Programmierung des mehrzelligen Aufbaus mit synthetischen Zelladhäsionsmolekülen

Nature Band 614, Seiten 144–152 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Zelladhäsionsmoleküle sind in mehrzelligen Organismen allgegenwärtig und bestimmen präzise Zell-Zell-Interaktionen in so unterschiedlichen Prozessen wie der Gewebeentwicklung, dem Transport von Immunzellen und der Verkabelung des Nervensystems1,2,3,4. Hier zeigen wir, dass durch die Kombination orthogonaler extrazellulärer Wechselwirkungen mit intrazellulären Domänen nativer Adhäsionsmoleküle wie Cadherine und Integrine eine breite Palette synthetischer Zelladhäsionsmoleküle erzeugt werden kann. Die resultierenden Moleküle führen zu maßgeschneiderten Zell-Zell-Wechselwirkungen mit Adhäsionseigenschaften, die denen nativer Wechselwirkungen ähneln. Die Identität der intrazellulären Domäne der synthetischen Zelladhäsionsmoleküle legt die Schnittstellenmorphologie und -mechanik fest, während verschiedene homotypische oder heterotypische extrazelluläre Interaktionsdomänen unabhängig voneinander die Konnektivität zwischen Zellen festlegen. Dieses Toolkit orthogonaler Adhäsionsmoleküle ermöglicht den rational programmierten Aufbau mehrzelliger Architekturen sowie die systematische Umgestaltung nativer Gewebe. Die Modularität synthetischer Zelladhäsionsmoleküle liefert grundlegende Erkenntnisse darüber, wie sich verschiedene Klassen von Zell-Zell-Schnittstellen entwickelt haben könnten. Insgesamt bieten diese Werkzeuge leistungsstarke Möglichkeiten für das Zell- und Gewebe-Engineering und für die systematische Untersuchung der mehrzelligen Organisation.

Die Fähigkeit, die Zell-Zell-Adhäsion systematisch zu programmieren, würde leistungsstarke neue Werkzeuge für die Untersuchung von Entwicklung, Neurobiologie und Immunologie liefern und könnte die Reparatur von mehrzelligen Geweben und das Design therapeutischer Zellen erleichtern5,6 (Abb. 1a). Dennoch bleibt die technische Adhäsion in metazoischen Zellen ein wenig erforschtes Gebiet in der synthetischen Biologie.

a, Verschiedene funktionelle Rollen der Zelladhäsion. b, Das konzeptionelle Design von synCAM-Rezeptoren. Die extrazelluläre Domäne eines CAM (links) wird durch GFP und einen GFP-bindenden Nanokörper (Anti-GFP; rechts) ersetzt. Eine Halteseilkontrolle ohne ICD ist ebenfalls dargestellt (Mitte). c, Maximale Projektion von ×20 konfokalen Mikroskopiebildern paarweiser synCAM-Schnittstellen. Maßstabsbalken, 10 µm. t = 3 Stunden. Eine GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine Anti-GFP-exprimierende Zelle (orange) gebunden. Die CAM-TM- und ICD-Domäne für jedes Paar ist angegeben (Tether ist die Kontrolle ohne ICD) (oben). Unten der GFP-Kanal der Schnittstellen oben, der die Unterschiede in der Rezeptoranreicherung an der Schnittstelle hervorhebt. Übereinstimmende synCAM-Expressionsniveaus sind in den erweiterten Daten in Abb. 1 dargestellt. d, Die von den in a gezeigten Schnittstellen gemessenen Kontaktwinkel. n = 20 (Tether), n = 20 (WT ECAD), n = 20 (DLL1), n ​​= 20 (JAM-B), n = 20 (NCAM-1), n ​​= 20 (ICAM-1), n = 20 (ECAD), n = 20 (ITGB1), n ​​= 20 (ITGB2), n = 15 (MUC4). Kontaktwinkel für die homotypische Zell-Zell-Interaktion von WT ECAD werden ebenfalls angezeigt. e, Der Anteil der GFP-Anreicherung an der Zell-Zell-Grenzfläche von c. n = 20 (Tether), n = 20 (DLL1), n ​​= 20 (JAM-B), n = 20 (NCAM-1), n ​​= 20 (ICAM-1), n ​​= 20 (ECAD), n = 20 (ITGB1), n ​​= 20 (ITGB2), n = 15 (MUC4). f, Quantifizierung der Kontaktwinkel von paarweisen L929-Zellen, die GFP/Anti-GFP-synCAMs mit den angegebenen Affinitäten und in Gegenwart (blau) oder Abwesenheit (schwarz) eines ICAM-1-ICD exprimieren. n = 20 Paare. Die Fehlerbalken zeigen die 95 %-Konfidenzintervalle. t = 3 Stunden. Übereinstimmende synCAM-Expressionsniveaus sind in Extended Data Abb. 1 dargestellt. Eine alternative Analyse (Kompetitionszellsortierungsassay) derselben Serie von synCAM-Zellen mit veränderter Affinität ist in Extended Data Abb. 3 dargestellt. Für die Boxplots in d und e gilt: Die Mittellinie zeigt den Median, die Boxgrenzen zeigen das 25. bis 75. Perzentil und die Whiskers zeigen die minimalen bis maximalen Werte.

Quelldaten

Native Zell-Zell-Wechselwirkungen werden durch eine große Ansammlung von Zelladhäsionsmolekülen (CAMs) vermittelt – komplexe Transmembranproteine, die benachbarte Zellen oder Matrix binden und eine mechanische Adhäsionsreaktion auslösen, die häufig Umlagerungen des Zytoskeletts beinhaltet7,8,9,10,11. Beispiele für CAMs sind Integrine, die fokale Adhäsionen aufbauen, und Cadherine, die adhärente Verbindungen zwischen Epithelzellen aufbauen11,12,13,14. Aufgrund der strukturellen Komplexität und Funktionsvielfalt von CAMs ist unklar, ob die Funktionen der extrazellulären Bindung und der durch intrazelluläre Domänen vermittelten Reorganisation des Zytoskeletts entkoppelt und neu kombiniert werden können, um neue Zell-Zell-Konnektivitäten zu erzeugen, obwohl frühere Studien auf das Potenzial für Modularität hinweisen15,16,17, 18,19.

Hier untersuchen wir systematisch die Modularität von CAMs, indem wir orthogonale extrazelluläre Bindungsdomänen (ECDs) mit endogenen intrazellulären CAM-Domänen (ICDs) fusionieren und so synthetische CAMs (synCAMs) erzeugen. Wir charakterisieren die resultierenden Zell-Zell-Schnittstellen und testen, ob synCAMs eine neue multizelluläre Organisation programmieren können.

Wir haben heterophile synCAMs generiert, in denen eine gut charakterisierte orthogonale Bindungswechselwirkung – die GFP-Anti-GFP-Wechselwirkung (Nanokörper) – mit den ICDs von E-Cadherin (ECAD), Integrin β1 (ITGB1), Integrin β2 (ITGB2) fusioniert ist. interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), Delta-ähnliches Protein 1 (DLL1), junktionales Adhäsionsmolekül B (JAM-B), neurales Zelladhäsionsmolekül 1 (NCAM-1) und Mucin 4 (MUC-4)20 (Abb . 1b). Die Transmembranregion (TM) und der ICD des Spender-CAM wurden mit dem GFP oder Anti-GFP-ECD fusioniert.

Anschließend haben wir getestet, ob verwandtes synCAM gepaart mit symmetrisch passenden ICDs die Verbindungsbildung zwischen L929-Mausfibroblasten (einer Zelllinie mit geringer endogener Adhäsion, die zur Beurteilung der differenziellen Adhäsionssortierung von Cadherin verwendet wird) vorantreiben kann21,22. Zellen, die verwandte synCAMs exprimieren, wurden in einer Ultra-Low-Attachment-Platte (ULA) mit flachem Boden gemischt und mithilfe der konfokalen Mikroskopie abgebildet (Abb. 1c). Wir verglichen synCAM-gesteuerte Schnittstellen mit solchen, die durch native Adhäsionsmoleküle (z. B. Wildtyp (WT) ECAD) oder durch eine einfache Bindung (GFP oder Anti-GFP, fusioniert mit einer Transmembrandomäne ohne ICD) gebildet werden. synCAMs/Tethers wurden im Ausdruck angepasst (Extended Data Abb. 1).

Mehrere synCAMs (ICDs: ECAD, ITGB1, ITGB2, ICAM-1 und MUC-4) bildeten umfangreiche Schnittstellen, die mit denen vergleichbar sind, die bei nativem Cadherin beobachtet wurden. Es bilden sich native Schnittstellen, obwohl diesen Molekülen ihre großen nativen extrazellulären Domänen völlig fehlen. Im Gegensatz dazu bildete der Tether (kein ICD) keine ausgedehnte Schnittstelle und zeigte nur einen kleinen Kontaktpunkt.

Mehrere andere synCAMs (ICDs: NCAM-1, JAM-B und DLL1) zeigten einen ausgeprägten Phänotyp. Die resultierenden Schnittstellen waren klein, aber mit einer erheblichen Schnittstellenanreicherung der GFP-markierten synCAMs (Abb. 1c). Im Gegensatz dazu blieb das GFP-Signal in angebundenen Zellpaaren über die gesamte Membran verteilt. Somit führen diese synCAMs bei Aktivierung zu einem ausgeprägten Phänotyp einer angereicherten räumlichen Clusterbildung an der Schnittstelle.

Um die Grenzflächengeometrie für synCAM-Wechselwirkungen (15–20 Zellpaare) quantitativ zu analysieren, haben wir den Kontaktwinkel gemessen – eine Standardmetrik der scheinbaren Zell-Zell-Oberflächenspannung, die mit der Grenzflächengröße korreliert (Abb. 1d). Wir haben auch den Anreicherungsanteil gemessen (den Anteil an GFP-markiertem synCAM, das an der Grenzfläche lokalisiert ist, im Vergleich zur Gesamtmembran; Abb. 1e). Diese Ergebnisse zeigen zwei phänotypische Hauptklassen von synCAMs: Eine Klasse induziert die Bildung großer, ausgedehnter Zell-Zell-Schnittstellen (ICDs: ECAD, ITGB1, ITGB2 und ICAM-1, MUC-4) und eine andere Klasse induziert die Bildung kleiner aber stark angereicherte Schnittstellen (ICDs: NCAM-1, JAM-B und DLL1) (MUC-4 und ICAM-1 zeigen hybrides Verhalten). Jede dieser synCAM-Schnittstellenklassen unterscheidet sich von der einfachen Tether-Interaktion.

Sowohl eine starke ECD-Bindungsinteraktion als auch eine starke ICD-Kopplung mit dem Zytoskelett könnten zur Bildung einer engen Zell-Zell-Grenzfläche beitragen. Die synCAM-Modularität ermöglicht die Untersuchung der relativen ECD- und ICD-Beiträge zur Grenzflächenfestigkeit. Unter Verwendung des ICAM-1 synCAM als Testsystem charakterisierten wir Zell-Zell-Schnittstellen mit unterschiedlicher ECD-Affinität (unter Verwendung einer Affinitätsreihe von GFP-Nanokörpern) oder einem gelöschten ICD20 (Abb. 1f und erweiterte Daten Abb. 1). Durch die Verringerung der ECD-Affinität von einer Dissoziationskonstante (Kd) von 0,7 nM auf 3 µM (>103-fach) wird der resultierende Zell-Zell-Kontaktwinkel allmählich verringert, aber selbst das schwächste ECD weist eine deutlich erweiterte Grenzfläche auf. Im Gegensatz dazu wird die Schnittstelle durch die Löschung des ICAM-1-ICD, selbst in Gegenwart eines hochaffinen ECD, vollständig zerstört. Eine ähnlich leichte Abnahme des Zell-Zell-Kontaktwinkels wurde für synCAMs mit einem ITGB1-ICD beobachtet, wenn der ECD-Kd zwischen 0,7 nM und 110 nM variiert wurde (Extended Data Abb. 2). Diese Beobachtungen stimmen mit einem Modell überein, in dem durch die ICDs vermittelte zytomechanische Veränderungen eine dominierende Rolle bei der Bestimmung der Grenzflächenstärke und Morphologie spielen23,24.

Wir haben auch charakterisiert, wie sich eine Verringerung der ECD-Interaktionsaffinität auf den Schnittstellenanreicherungsphänotyp des NCAM-1-synCAM auswirkt. Der GFP-Rezeptor bleibt an der Grenzfläche stark angereichert, selbst wenn die ECD-Affinität über einen Bereich von Kd = 0,7 nM bis 600 nM variiert wird (Extended Data Abb. 2). Somit scheint der Phänotyp der angereicherten Schnittstelle auch weitgehend von der ICD-Identität bestimmt zu sein.

Die Dominanz der ICD-Affinität gegenüber der ECD-Affinität bei der Bestimmung der Adhäsionseigenschaften wurde in Konkurrenzsortierungstests bestätigt (Extended Data Abb. 3). Hier konkurrieren Zellen, die zwei verschiedene Anti-GFP-synCAM-Varianten (ICAM-1 ICD) exprimieren, um die Co-Sortierung mit GFP-synCAM-„Köder“-Zellen. Zellen mit höherer Affinität sortieren sich bevorzugt mit den Köderzellen in den Kern des Zellclusters. Dieser ergänzende Test zeigt auch, dass der ICD in erster Linie die Adhäsionspräferenzen bestimmt. Die Expression von GFP-ICAM-1/Anti-GFP-ICAM-1 in höheren Konzentrationen erhöhte auch den Kontaktwinkel (Extended Data Abb. 4). Im Gegensatz dazu veränderte eine höhere Expression der GFP/Anti-GFP-Bindungen den Kontaktwinkel nicht.

Um synCAM-Schnittstellen detaillierter zu untersuchen, verwendeten wir einen kontrollierteren Assay, bei dem eine L929-Zelle, die ein Anti-GFP-synCAM exprimiert, mit einer GFP-beschichteten Oberfläche interagiert (Abb. 2 und Extended Data Abb. 5a). Da Oberflächen-GFP unbeweglich ist und sich nicht neu anordnen kann, breiten sich die interagierenden synCAM-Zellen auf der Oberfläche aus. Nach 75 Minuten wurden die Zellen fixiert und mit Phalloidin angefärbt, um das Aktin-Zytoskelett zu beobachten. Eine einfache Anti-GFP-Tether-Wechselwirkung führte zu einer minimalen Zellausbreitung auf der GFP-Oberfläche (Abb. 2a). Allerdings zeigten synCAMs erneut zwei unterschiedliche Ausbreitungsmodi. Zellen, die synCAMs mit ICDs von ICAM-1, ITGB1, ITGB2 und ECAD exprimieren, dehnten sich gleichmäßig auf der GFP-Oberfläche aus und entwickelten ein dichtes Band aus kortikalem Aktin entlang der Zellperipherie (Abb. 2b). Kinetische Studien zeigen, dass diese größere Ausbreitung eine langsame Phase von mehreren zehn Minuten bis Stunden hat, was mit der Notwendigkeit einer Umgestaltung des Zytoskeletts übereinstimmt (Extended Data Abb. 5b – e). Diese synCAMs erzeugen eine gleichmäßige „expansive“ Ausbreitung entlang der gesamten Zellperipherie. Im Gegensatz dazu ergaben synCAMs mit den ICDs MUC-4, NCAM-1 und JAM-B eine „Spiegelei“-Morphologie – eine kleinere zentrale Zellmasse war an der Peripherie von dünnen Membranvorsprüngen umgeben (Abb. 2c). In diesen Fällen vermittelten lamellipodiale und/oder filopodiale Aktinstrukturen eine radiale „protrusive“ Ausbreitung. Insgesamt stimmen diese Studien zur Oberflächenausbreitung mit unseren früheren Zell-Zell-Schnittstellenstudien überein, da die sich ausdehnenden synCAMs auch zu größeren Zell-Zell-Grenzflächen und größeren Kontaktwinkeln führen, während die sich ausbreitenden synCAMs kleine, aber stark angereicherte Grenzflächen bildeten.

a–c, repräsentative Phalloidin-gefärbte Bilder von L929-Zellen, die die angegebenen synCAMs exprimieren und sich auf einer GFP-beschichteten Oberfläche ausbreiten. Maßstabsbalken, 10 µm. t = 2 h. Aktin (Phalloidin-Färbung) ist grün dargestellt; Der gesamte Fußabdruck der Zelle (Membranmarkierung) wird in Lila angezeigt. Alle Bilder werden im gleichen Maßstab dargestellt. a: Die L929-Zelle, die Anti-GFP-Tether (kein ICD) exprimiert, zeigt eine minimale Ausbreitung. b: L929-Zellen, die synCAMs mit ICDs von ECAD, ICAM-1, ITGB1 und ITGB2 exprimieren, zeigen einen expansiven Ausbreitungsphänotyp – die Zelle breitet sich kreisförmig aus, mit kortikalem Aktin an der Peripherie des Zellfußabdrucks. Siehe die Ausbreitungskinetik-Assays in Extended Data Abb. 5. c, L929-Zellen, die synCAMs mit ICDs von NCAM-1, JAM-B und MUC-4 exprimieren, zeigen einen protrusiven Ausbreitungsphänotyp (eine „Spiegelei“-Form) – kortikales Aktin nicht breiten sich sehr weit aus, aber der Fußabdruck der Zellmembran erstreckt sich in einer sehr dünnen Schicht über die Zelle hinaus, oft mit weniger Zirkularität (d. h. eher filopodialer oder lamellopodialer Natur). d, Der vollständige Fußabdruck der Zelle (blau) und der Zellfläche (grau) für die synCAM-vermittelte Zellausbreitung. Bei den Boxplots zeigt die Mittellinie den Median, die Boxgrenzen zeigen das 25. bis 75. Perzentil und die Whiskers zeigen die minimalen bis maximalen Werte. Zellfläche: n = 23 (Tether), n = 17 (ECAD), n = 23 (JAM-B), n = 16 (ICAM-1), n ​​= 16 (ITGB1), n ​​= 18 (ITGB2), n = 14 (NCAM-1), n ​​= 12 (MUC-4). Zellen-Footprint: n = 22 (Tether), n = 21 (ECAD), n = 19 (JAM-B), n = 23 (ICAM-1), n ​​= 16 (ITGB1), n ​​= 12 (ITGB2), n = 14 (NCAM-1), n ​​= 15 (MUC-4). e, Bekannte Rekrutierungsinteraktionen von nachgeschalteten intrazellulären Proteinen, die in CAM-ICDs gefunden werden. Siehe die Mutationsanalyse von ICD-Bindungsmotiven in Extended Data Abb.6.

Quelldaten

Wir untersuchten, wie die synCAM-gesteuerte Zellausbreitung durch eine Reihe niedermolekularer Inhibitoren verschiedener Aktinregulatoren verändert wurde (Extended Data Abb. 6a). Alle synCAM-exprimierenden Zellen zeigten eine minimale Ausbreitung in Gegenwart von Latrunculin B, das die Bildung von Aktinfilamenten stört, was die Bedeutung der Zytoskelettaktivität bei allen Arten der Zellausbreitung bestätigt. Im Gegensatz dazu ermöglichte die Hemmung der Kontraktilität mit Blebbistatin (aber dennoch die Aktin-Polymerisation) die Ausbreitung von synCAM-Zellen, jedoch ohne den kontrollierten Zusammenbau von Aktin in eindeutige Strukturen, die für die verschiedenen synCAMs einzigartig sind. Dieses Ergebnis unterstreicht den Wettbewerb zwischen Ausbreitung und kortikaler Kontraktilität, wenn eine Zelle eine neue Schnittstelle erweitert24,26. Bei synCAMs, die sich protrusiv ausbreiten (z. B. JAM-B ICD), werden die normalerweise an der Peripherie der Zelle sichtbaren Lamellipodialblätter durch CK666 zerstört, was auf eine Rolle seines Ziels, des ARP2/3-Komplexes, bei der Bildung dieser dünnen Protrusive hinweist Strukturen.

Die hier beobachteten unterschiedlichen Grenzflächenmorphologien können durch postulierte Mechanismen der CAM-ICDs erklärt werden (Abb. 2e). Obwohl sie sich individuell im Detail unterscheiden, rekrutieren die expansiven ICDs (ECAD, ICAM-1, Integrine) Adaptermoleküle wie β-Catenin, Talin, Vinculin und ERM-Proteine, von denen man annimmt, dass sie das kortikale Aktin-Zytoskelett angreifen und so die Expansion vorantreiben gesamte Zellfront12,13,27. Im Gegensatz dazu interagieren die hervorstehenden ICDs (NCAM-1, JAM-B, DLL1) mit PDZ-Gerüstproteinen oder Lipidflößen und bilden im Allgemeinen organisierte Komplexe, die Clusterbildung oder Phasenkondensation beinhalten28,29,30,31. Die resultierenden räumlich fokussierten Anordnungen können dann protrusive Zytoskelettreaktionen wie die Bildung von Filopodien und Lamellipodien durch die Rekrutierung und Aktivierung von Proteinen wie N-WASP und ARP2/3 auslösen. Die Bedeutung dieser ICD-Interaktionsdomänen für die Schnittstellenbildung wurde durch Mutationsanalyse wichtiger Signalmotive bestätigt (Extended Data Abb. 6b – h).

Viele endogene CAMs binden homophil (z. B. ECAD und JAM-B) und bilden so eine Schnittstelle mit symmetrischen ICDs. Viele andere endogene CAMs sind jedoch an heterophilen Wechselwirkungen beteiligt (z. B. ITGB1, ITGB2 und ICAM-1), was zu Zell-Zell-Schnittstellen mit verschiedenen gegensätzlichen ICDs führt. Wir verwendeten daher die synCAM-Plattform, um zu untersuchen, wie symmetrische und asymmetrische ICDs die Morphologie der Zell-Zell-Schnittstelle beeinflussen. Wir haben alle möglichen Paare verschiedener GFP-Anti-GFP-synCAMs in L929-Fibroblasten untersucht (Abb. 3 und erweiterte Daten, Abb. 7).

a, Maximale Projektion von ×20 konfokalen Mikroskopiebildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (t = 3 h), die symmetrische ECAD-ICDs (links), asymmetrische ECAD- und Tether-Schnittstellen (∆ICD) (Mitte) und ausgeglichene asymmetrische ECAD- und ICAM-1-Schnittstellen zeigen Schnittstellen (rechts). Maßstabsbalken, 10 µm. Gezeigt werden die mCherry- und BFP-Kanäle (oben) und die GFP-Kanäle (unten) repräsentativer Bilder von zehn Paaren über drei unabhängige Replikate. b, Quantifizierung des Kontaktwinkels (oben) und GFP-Anreicherung (unten) für paarweise asymmetrische synCAM-Schnittstellen. n = 10. Die Kombination von Grenzflächen, die den größten Kontaktwinkel oder die größte Anreicherung aufweisen, sind rot umrandet. c, Beispiel ×20 konfokale Mikroskopbilder von paarweise unausgeglichenen asymmetrischen Schnittstellen, in denen ein protrusives synCAM an ein expansives synCAM bindet. t = 3 Stunden. Maßstabsbalken, 10 µm. Es werden repräsentative Bilder von zehn Paaren über drei unabhängige Replikate gezeigt. Oben: Bindung zwischen einem protrusiven Anti-GFP-synCAM und einem expansiven GFP-synCAM. Unten: Bindung zwischen einem hervorstehenden GFP-synCAM und einem expansiven Anti-GFP-synCAM.

Quelldaten

Asymmetrische Schnittstellen mit einem vollständig gelöschten ICD (Tether) auf einer Seite der Schnittstelle weisen deutlich gestörte Schnittstellen auf – sie zeigen eine minimale Zell-Zell-Grenzflächenausdehnung und Kontaktwinkelerhöhung (Abb. 3a, b). Eine große asymmetrische Schnittstelle kann jedoch gebildet werden, wenn zwei expansive synCAMs (z. B. ECAD-ICAM-1 oder ECAD-ITGB2) gepaart werden (Abb. 3a, b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich mit asymmetrischen synCAMs große, erweiterte Schnittstellen bilden können, wenn die gegensätzlichen ICDs eine ausgewogene Interaktion ergeben. Analog dazu erzeugen asymmetrische Schnittstellen, die zwei ICDs koppeln, die beide die GFP-Anreicherung vermitteln (z. B. NCAM-1–MUC-4, NCAM-1–JAM-B), einen Phänotyp der Schnittstellenanreicherung, der dem von symmetrischen Schnittstellen ähnelt (Abb. 3a, B). Um eine produktive Schnittstelle zu bilden, ist daher die genaue Reihenfolge eines gegnerischen ICD weniger kritisch als das Vorhandensein von ICDs mit übereinstimmender Stärke und Morphologie.

Als wir heterotypische Schnittstellen schufen, in denen eine Zelle mit einem hervorstehenden synCAM an eine Zelle mit einem expansiven synCAM bindet, interagierten die Zellen insbesondere mit einer konsistenten Morphologie – sie bildeten eine asymmetrische Schnittstelle, in der sich die hervorstehende synCAM-Zelle um die expansive synCAM-Zelle wickelt ( Abb. 3c). Diese Ergebnisse zeigen die Vielfalt der Schnittstellen, die mit synCAM-Kombinationen konstruiert werden können.

Um die Bildung neuer mehrzelliger Gewebe de novo zu programmieren, muss eine bestimmte zelluläre Konnektivität innerhalb eines mehrzelligen Systems vorgegeben werden5,32,33. Frühere Bemühungen zur orthogonalen Kontrolle der multizellulären Anordnung sowohl in Bakterien- als auch in Säugetiersystemen verwendeten im Allgemeinen Oberflächenanbindungsansätze5,32,33,34,35. Bemerkenswert ist, dass neuere Forschungen die individuelle Strukturierung gentechnisch veränderter Bakterien durch die Oberflächenexpression orthogonaler Nanokörper-Antigen-Paare ermöglicht haben33. Angesichts der Fähigkeit von synCAMs, die Zellmorphologie und die Struktur des Zytoskeletts zu steuern, haben wir getestet, ob synCAMs mit einer breiten Palette orthogonaler ECDs konstruiert werden können, um auch spezifische räumliche Konnektivität rational zu programmieren. Wir fanden heraus, dass funktionelle synCAMs mit mehreren unterschiedlichen Antikörper-Antigen-Bindungspaaren aufgebaut werden können, einschließlich HA-Tag-Anti-HA-Einzelketten-Variablenfragment (scFv); Maltose-bindendes Protein (MBP) – Anti-MBP-Nanokörper; B-Zelloberflächenantigen CD19–anti-CD19 scFv; Tyrosin-Proteinkinase MET-Anti-MET-Nanokörper; mCherry – Anti-mCherry-Nanokörper; und epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) – Anti-EGFR-Nanokörper (Abb. 4a und Zusatzvideo 1). Die Orthogonalität verschiedener ECD-synCAMs wurde mithilfe von Co-Sorting-Assays bestätigt und wir quantifizierten ihre Effizienz beim Ausschluss von WT-L929-Zellen aus der mehrzelligen Anordnung (Extended Data, Abb. 8).

a, Heterophile synCAMs mit orthogonalen extrazellulären Erkennungsdomänen. Die maximale Projektion von ×20 konfokalen Mikroskopie-Zell-Zell-Schnittstellenbildern zeigt L929-Zellen, die synCAMs mit den angegebenen Antikörper-Antigen-Paar-ECDs und entweder ICAM-1 (oben) oder ITGB1 (unten) TM/ICD exprimieren. Maßstabsbalken, 10 µm. t = 3 Stunden. Es werden repräsentative Bilder von vier unabhängigen Replikaten gezeigt. Experimentelle Tests der orthogonalen Sortierung sind in der erweiterten Datenabbildung 8 dargestellt. Eine Zeitrafferanalyse der orthogonalen Anordnungsbildung finden Sie im Zusatzvideo 1. b, Entwicklung kundenspezifischer heterotypischer Baugruppen. Maximale Projektion von ×20 konfokalen Mikroskopiebildern von L929-Zellen, die synCAMs mit den angegebenen ECD-Erkennungspartnern exprimieren. t = 2 h. Anordnungen bilden alternierende (links), überbrückende (Mitte) und zyklische (rechts) Muster. Es werden Beispielbilder isolierter zyklischer Wechselwirkungen gezeigt. t = 2 h. Eine Zeitrafferanalyse wird im Zusatzvideo 2 gezeigt. Wahrscheinlichkeitsfelder der Zellkontaktverteilung sind unten dargestellt. n = 5. Maßstabsbalken, 50 µm (linke 3 Bilder) und 10 µm (Einschübe). c, synCAM-Design mit einem homophil bindenden Leucin-Zipper-ECD (oben). Unten, maximale Projektion von ×20 konfokalen Mikroskopiebildern von L929-Zellen, die homophil bindende synCAMs mit dem Aph4- oder IF1-Leucin-Zipper-ECD und ICAM-1 TM/ICD exprimieren (ULA-Rundbodenvertiefung, insgesamt 80 Zellen). Maßstabsbalken, 50 µm. t = 24 h. Es werden repräsentative Bilder von drei unabhängigen Replikaten gezeigt. d, ×20 konfokale Mikroskopiebilder der Differenzsortierung zwischen L929-Zellen, die WT-ECAD oder die angegebenen homophil bindenden synCAMs exprimieren. Maßstabsbalken, 20 µm. t = 48 Std. Repräsentative Bilder werden mit zusätzlichen unabhängigen Replikaten in Extended Data Abb. 9 gezeigt. n = 15 (ECAD–IF1), n ​​= 15 (ECAD–Aph4), n = 14 (IF1–Aph4) und n = 18 (ECAD–IF1– Aph4). e, Schematische Darstellung des Rezeptordesigns und des Differentialsortierungstests von L929-Zellen, die WT-PCAD (orange) und ein Anti-PCAD-synCAM (Anti-PCAD, blau) exprimieren (links). Das Anti-PCAD synCAM enthält ein ICAM-1 TM/ICD. Rechts, maximale Projektionsbilder des Sortierassays, in dem L929-Zellen, die WT PCAD exprimieren (orange), mit parentalen (oben) oder synCAM- (unten) L929-Zellen (blau) gemischt wurden. Maßstabsbalken, 50 µm. t = 0 h und 24 h. Es werden repräsentative Bilder von vier unabhängigen Replikaten gezeigt, wobei zusätzliche Replikate in der erweiterten Datenabbildung 10 dargestellt sind.

Quelldaten

Wir haben getestet, ob dieser Satz orthogonaler heterotypischer synCAMs hochspezifische Zellbindungsmuster programmieren kann. (Abb. 4b und Zusatzvideo 2). Wir konstruierten Baugruppen mit den folgenden Mustern: (1) zwei Zellen (A↔B) mit abwechselnden heterophilen Wechselwirkungen (Expression eines heterophilen GFP-Anti-GFP-synCAM-Paares in den Zellen A und B); (2) drei Zellen (A↔B↔C) überbrückende Wechselwirkungen (Expression von orthogonalen synCAMs in den Zellen A und C und beide komplementären synCAMs in der überbrückenden Zelle B); (3) zyklische Wechselwirkungen mit drei Zellen (A↔B↔C↔A) (Ausdruck von zwei orthogonalen synCAMs in jeder der Zellen A, B und C). Die resultierenden Baugruppen organisieren sich gemäß den synCAM-definierten Zell-Zell-Konnektivitäten. Die Analyse der Verteilung der nächsten Nachbarn (mithilfe der Bildanalysesoftware Harmony) zeigte, dass synCAM-spezifizierte Interaktionen die Montage dominieren (Abb. 4b). In vergrößerten Bildern mit geringer Zellzahl kann der zyklische Interaktionssatz zu den vorhergesagten minimalen 3- und 4-Mehrzellanordnungen führen (Abb. 4b). Somit können synCAM-Kombinationen die genauen Bindungsverbindungen zwischen Zellen spezifizieren.

Als nächstes konstruierten wir homotypische synCAMs aus selbstdimerisierenden Coiled-Coil-ECD-Wechselwirkungen. Wir verwendeten die Leucin-Reißverschlüsse Aph4 (ein rechnerisch entworfener Leucin-Zipper36) und IF1 (boviner ATPase-Inhibitor IF1), da wir erwarteten, dass ihre antiparallelen Bindungstopologien interzelluläre Transzellwechselwirkungen gegenüber intrazellulärer cis-Bindung sterisch begünstigen könnten36,37. Wir haben auch eine dazwischenliegende Fibcon-Domäne (eine Konsens-FN3-Domäne von Fibronektin) neben den Coiled-Coil-Domänen angehängt, um eine zusätzliche Trennung von der Juxtamembranregion zu gewährleisten, was die Interaktionen zwischen Zellen weiter begünstigen könnte (Abb. 4c).

Wir haben getestet, ob Zellen, die orthogonale homophile synCAMs exprimieren, vorhersehbar Strukturen mit getrennten Kompartimenten erzeugen können. Zellen, die drei verschiedene orthogonale homotypische CAMs (WT ECAD, Aph4-ICAM-1 oder IF1-ICAM-1) exprimieren, wurden in Kombinationen gemischt (Abb. 4d) und auf der Grundlage der resultierenden Anordnungsstrukturen klassifiziert. Die einzelnen Zellpopulationen zeigen eine klare Sortierung durch ihre homophilen synCAMs, am auffälligsten ist jedoch das daraus resultierende hochmodulare Sortierverhalten. Wenn Zelltypen paarweise gemischt wurden, beobachteten wir, dass sich die IF1-Zellen im Vergleich zu ECAD oder Aph4 zur Mitte hin sortierten. Die ECAD- und Aph4-Zellen bilden eine zweilappige Hantelstruktur. Diese Beziehungen bleiben erhalten, wenn alle drei Zelltypen gemischt werden, was eine Struktur mit einer ECAD-Aph4-Hantelzellanordnung mit IF1-Zellen im Kern ergibt (Extended Data Abb. 9 für Aufbaustatistiken). Diese Ergebnisse zeigen, wie ein Toolkit orthogonaler synCAMs selbstorganisierende Multikompartimentstrukturen mit Modularität und Vorhersagbarkeit aufbauen kann.

Wir haben getestet, ob synCAMs direkt mit einem Gewebe interagieren können, das durch native Adhäsionsmoleküle wie P-Cadherin (PCAD) zusammengehalten wird. Daher haben wir ein synCAM mit einem Anti-PCAD-scFv entwickelt, der mit dem ICAM-1-ICD verschmolzen ist (Abb. 4e, erweiterte Daten, Abb. 10 und Zusatzvideo 3). Diese synthetischen PCAD-Zielzellen könnten effektiv in ein durch PCAD zusammengehaltenes Zellsphäroid interkalieren. Im Gegensatz dazu wurden Zellen, denen synCAM fehlte, ausgeschlossen und außerhalb der Struktur sortiert. Somit können synCAMs Zellen in Anordnungen integrieren, die von nativen Adhäsionsmolekülen gebildet werden.

Wir haben getestet, ob synthetische Adhäsionsmoleküle in Primärzellen funktionieren können und pluripotente Stammzellen (iPS) induziert haben. GFP/Anti-GFP-ICAM-1-synCAMs und GFP/Anti-GFP-Tether-Moleküle wurden in mehreren primären oder von iPS-Zellen abgeleiteten Zellen exprimiert (Extended Data Abb. 11). Wenn ICAM-1-basierte synCAMs in primären menschlichen Hautfibroblasten, menschlichen mesenchymalen Stromazellen und von iPS-Zellen abgeleiteten glatten Muskelzellen exprimiert werden, beobachteten wir eine starke Lokalisierung der GFP-markierten synCAMs an der Schnittstelle, die mit Partnerzellen gebildet wurde, die ein funktionelles verwandtes Anti exprimieren -GFP synCAM. Diese synCAM-Relokalisierung an der heterotypischen Zell-Zell-Grenzfläche wurde weder bei ungebundenen Zellen (GFP-synCAM bleibt in der gesamten Zelle verteilt, nicht nur an der Grenzfläche) noch bei Co-Kultivierung mit Partnerzellen beobachtet, die nur eine Anti-GFP-Bindung (kein ICD) enthielten ). Diese Ergebnisse zeigen, dass synCAMs in diesen verschiedenen Zelltypen in einer Weise funktionell miteinander interagieren, die von verwandten ECDs und dem Vorhandensein funktionell passender ICDs abhängt.

Wir untersuchten, ob synthetische Adhäsion durch native CAMs organisierte vielzellige Gewebe umgestalten und neu konfigurieren kann. Beispielsweise sortieren sich L929-Zellen, die WT ECAD und WT PCAD unterschiedlich exprimieren, zu einer zweilappigen Anordnung6. Wir untersuchten, ob die Einführung einer GFP-Anti-GFP-synCAM-Wechselwirkung diese beiden segregierenden Populationen zur Integration zwingen könnte (Abb. 5a). Durch die Expression eines heterotypischen Haltemoleküls wurde die zweilappige Anordnung in eine zweischichtige Struktur (Kernschale) umgewandelt, die die Segregation aufrechterhält, aber die Anzahl der heterophilen Kontakte im Vergleich zur zweilappigen Anordnung leicht erhöht. Im Gegensatz dazu wandelte die Expression der stärkeren synCAMs (ICAM-1 oder ECAD ICDs) die zweilappige Struktur in eine integrierte Struktur um, wobei sich die beiden Zelltypen in einem einzigen gemischten Kompartiment befanden. Diese synCAMs könnten auch die Integration unterschiedlich sortierter L929-Zellpopulationen erzwingen, die WT PCAD oder WT NCAD exprimieren (Extended Data Abb. 12a, b). Somit können synCAMs verwendet werden, um mehrzellige Baugruppen systematisch umzugestalten.

a, Schematische Darstellung des Experiments mit synCAMs, um die Integration unterschiedlich sortierter L929-Populationen zu erzwingen. Wir beginnen mit L929-Populationen, die WT ECAD (blau) oder WT PCAD (orange) exprimieren, was zur Aufspaltung in eine binodale Struktur führt. Das Bild zeigt, wie die Sortierung durch die Expression von integrierendem heterophilem synCAM mit Wechselwirkungen unterschiedlicher Stärke (gegenüber dem Tether-Rezeptor) verändert wird. Gezeigt werden Maximalprojektionen von ×20 konfokalen Mikroskopiebildern. Maßstabsbalken, 20 µm. t = 24 h. Eine Zeitrafferanalyse finden Sie im Zusatzvideo 3. Eine ähnliche Demonstration der synCAM-Integration von PCAD/NCAD-segregierten Zellpopulationen ist in Extended Data Abb. 7 dargestellt. b: L929-Zellen, die WT-PCAD (orange) exprimieren, gemischt mit einer MDCK-Monoschicht (blau), bilden Sphäroide, die passiv über dem MCDK-Epithel sitzen Schicht. Die Zugabe von GFP-Anti-GFP-synCAMs mit Wechselwirkungen zunehmender Stärke (gegenüber dem Tether-Rezeptor) führt zu einer zunehmenden mechanischen Kopplung zwischen Epithel- und Sphäroidgewebe. Wenn sie stark genug sind, bilden die beiden Zelltypen ein komplexes gitterartiges Netzwerk (ICAM synCAM). Die Bilder zeigen den Zusammenbau bei t = 24 h. Es werden sowohl vergrößerte 3D-Ansichten (oben) als auch verkleinerte Ansichten mit maximaler Projektion (unten) angezeigt. Maßstabsbalken, 100 µm (oben) und 1 mm (unten). Eine Zeitrafferanalyse der gekoppelten Gewebeentwicklung finden Sie im Zusatzvideo 4.

Um den Gewebeumbau weiter zu untersuchen, haben wir getestet, ob synCAMs Epithelmonoschichten verändern können – einen grundlegenden Baustein für verschiedene Gewebe und Organe. Beispielsweise ist die Modulation der Epithelstruktur durch Interaktionen mit mesenchymalen Zellen ein häufiges Thema in der Entwicklung. Wir verwendeten Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) als anfängliche Epithelzellschicht. Wenn eine Population von L929-Zellen, die PCAD exprimieren, hinzugefügt wird, bilden sie getrennte homotypische Sphäroidcluster, die über der konfluenten MDCK-Epithelschicht sitzen. Die anfänglichen Epithel- (MDCK) und Sphäroidgewebe (PCAD-L929) zeigen minimale Wechselwirkungen und fungieren als unabhängige Baugruppen (Abb. 5b).

Wir untersuchten, ob die Einführung überbrückender synthetischer Adhäsionswechselwirkungen (unter Verwendung von GFP-Anti-GFP-ECDs mit symmetrischen ICDs) die verschiedenen Epithel- und Sphäroidgewebe zur Interaktion zwingen könnte. Wenn eine minimale Tether-Interaktion (kein ICD) hinzugefügt wird, sitzen die PCAD-L929-Zellen fest auf der MDCK-Epithelschicht, agieren aber dennoch unabhängig und behalten ihre getrennte Sphäroidstruktur bei. Die Einführung eines stärkeren ECAD-synCAM führt jedoch dazu, dass sich die PCAD-L929-Sphäroide in flachere, asterartige Höcker ausbreiten, die die Epithelschicht stärker berühren. Schließlich führt das Hinzufügen der noch stärkeren ICAM-1-synCAM-Brückenwechselwirkung zu einer erheblichen kooperativen Neuordnung beider Gewebe (Abb. 5b, erweiterte Daten, Abb. 12c und Zusatzvideo 4). In diesem Fall organisieren sich L929-Zellen zu einem kontinuierlichen Gitternetzwerk über den MDCK-Zellen. Darüber hinaus zeigt die MDCK-Epithelschicht eine verringerte Konfluenz, möglicherweise weil die starke Brückenwechselwirkung zwischen den L929- und MDCK-Zellen offenbar MDCK-Zellen von der Oberfläche in die dazwischen liegenden Räume des Gitters zieht. Wir nehmen an, dass dieses kooperative Gewebe aus den gegensätzlichen Kräften der beiden Gewebe entsteht. Die starke homotypische (PCAD) Anziehung zwischen den L929-Zellen in Kombination mit der starken synthetischen Brückenwechselwirkung (synCAM) zwischen den L929-Zellen und den MDCK-Zellen führt dazu, dass diese beiden Populationen einen mechanisch ausgeglichenen Zustand einnehmen. Das resultierende Netzwerk erinnert an das selbstorganisierende Kapillarrohrnetzwerk aktivierter Endothelzellen. Kurz gesagt scheint diese Gitterkonfiguration eine Lösung zu bieten, die es den L929-Zellen ermöglicht, gleichzeitig ein hohes Maß an homotypischer Interaktion sowie ein hohes Maß an heterotypischer Interaktion mit der MDCK-Epithelschicht aufrechtzuerhalten. Eine ähnliche entstehende Gitternetzwerkstruktur wurde in einem analogen Experiment in Primärzellen beobachtet (primäre Darmepithelschicht der Maus plus embryonale Fibroblasten der Maus; erweiterte Daten, Abb. 12d). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass synCAMs ansonsten unabhängige Zellpopulationen systematisch koppeln können, um Mehrzellsysteme zu schaffen, deren kooperative Mechanik komplexe Gewebestrukturen hervorbringt.

Hier zeigen wir das Potenzial für die Entwicklung verschiedener synthetischer Adhäsionsmoleküle auf, die die Designprinzipien nativer Adhäsionsmoleküle teilen, aber neue und orthogonale Verbindungen zwischen Zellen spezifizieren. Obwohl Metazoen eine Vielzahl von CAMs einsetzen, um vielfältige zelluläre Interaktionen und den Gewebeaufbau zu vermitteln, bleiben wahrscheinlich viele weitere Schnittstellen von der Evolution ungenutzt. Die hier verwendete synCAM-Designstrategie integriert zwei Mechanismen zur Steuerung der synthetischen Adhäsion. Erstens spezifiziert die extrazelluläre Interaktionsdomäne die Zell-Zell-Konnektivität (Bindung), die entweder homophil oder heterophil mit genau kontrollierter Affinität sein kann. Zweitens bestimmt die intrazelluläre Domäne die Reorganisation des Zytoskeletts und bestimmt weitgehend die Grenzflächenmechanik und -morphologie. Die Orthogonalität und Einstellbarkeit der extrazellulären Domänenerkennung in Verbindung mit der Modularität der intrazellulären Domänenausgabe erweitert den möglichen Satz an Schnittstellen, die generiert werden können. Dieses Toolkit kann daher sowohl die Zell-Zell-Konnektivität als auch den resultierenden Schnittstellentyp verändern. Darüber hinaus kann die Mischung mehrerer synCAMs und nativer CAMs zur Schaffung eines Systems mechanisch gekoppelter Zellen Gewebe mit komplexen entstehenden Strukturen erzeugen.

Das breite Spektrum an Adhäsions-ICDs, die für chimäres Engineering geeignet sind, zeigt, dass die Funktion der intrazellulären Domäne bis zu einem gewissen Grad unabhängig vom endogenen extrazellulären Erkennungsmechanismus ist. Bemerkenswerterweise entsprechen die hier verwendeten einfachen extrazellulären Wechselwirkungen nicht der höheren regulatorischen Komplexität vieler natürlicher ECDs, die auch cis-Oligomerisierung, Catch-Bonding und allosterische Veränderungen zeigen können8,39,40,41,42. Dennoch reichen synCAMs immer noch aus, um ähnliche Zell-Zell-Schnittstellen aufzubauen. Die Modularität von CAMs gibt Aufschluss darüber, wie viele natürliche CAMs sich möglicherweise entwickelt haben. Beispielsweise finden sich Proteine ​​mit Cadherin-ECDs in Choanoflagellaten (den nächsten einzelligen Verwandten von Metazoen), ihnen fehlen jedoch die Metazoen-ICDs43,44. Diese Proteine ​​wurden möglicherweise von Choanoflagellaten zur Bindung an Nahrung oder Substrate und nicht zur Zell-Zell-Adhäsion verwendet und später durch Rekombination mit intrazellulären Signaldomänen für die Zell-Zell-Adhäsion kooptiert.

Diese Studie unterstützt eine dominierende Rolle der intrazellulären Domäne bei der Bestimmung des Charakters von CAM-vermittelten Zell-Zell-Schnittstellen. Bindungsinteraktionen zwischen Zellen, die nicht mit dem Zytoskelett interagieren, können keine starken, ausgedehnten Schnittstellen erzeugen, unabhängig von der extrazellulären Bindungsaffinität. Im Gegensatz dazu ermöglichen synCAMs, die aus ICDs bestehen, die das Zytoskelett angreifen, eine komplexere Morphologie, die von der Identität des ICD auf jeder Seite der Schnittstelle abhängt. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit früheren Studien, die darauf hindeuten, dass Cadherin-ICDs die Kortexspannung umgestalten, um die Zellschnittstellenexpansion und den Widerstand gegen Zelltrennung voranzutreiben23,24,45,46,47,48.

Schließlich zeigen wir, dass synCAMs ein vielseitiges Toolkit für die Programmierung multizellulärer Strukturen bieten, entweder de novo oder durch Interkalation oder Umgestaltung von durch native CAMs gebildeten Geweben. Das Toolkit von synCAMs ermöglicht auch die systematische Störung selbstorganisierender Systeme, die zur Analyse der Mechanismen verschiedener Entwicklungsprozesse genutzt werden könnte. In der Zukunft könnten diese Arten von gentechnisch veränderten Adhäsionsmolekülen möglicherweise zur Lösung therapeutischer Probleme eingesetzt werden, etwa zur präzisen Steuerung der Gewebereparatur und -regeneration oder zur Kontrolle der Interaktionen und des Transports von Immun- und Nervenzellen49.

Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies gekauft. In-Fusion-Klonierungsreagenz, CloneAmp HiFi PCR Premix, das Lenti-X-Konzentrator-Kit und chemisch kompetente Stellar-Zellen wurden von Takara Bio erworben. Miniprep-Kits und Spin-Säulen wurden von Qiagen erworben. Das FuGENE HD-Transfektionsreagenz wurde von Promega bezogen. DMEM, GlutaMAX, Alexa Fluor 647 Phalloidin (A22287) und Alexa Fluor 555 Phalloidin (A34055) wurden von Thermo Fisher Scientific gekauft. Fetales Rinderserum (FBS) wurde von der Cell Culture Facility der University of California, San Francisco (UCSF) erworben. L929-Maus-Fibroblastenzellen (ATCC, CCL-1) wurden von der American Type Culture Collection erworben. MDCK-Zellen waren ein Geschenk des Mostov-Labors an der UCSF. Primäre dermale Fibroblastenzellen (CC-2511), embryonale Mausfibroblasten (M-FB-481) und aus menschlichem Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen (PT-2501) wurden von Lonza Bioscience erworben. Nexcelom 3D 384-Well-Ultra-Low-Attachment-behandelte Rundboden-Multiwellplatten wurden von Nexcelom Bioscience gekauft. Cellstar Cell-Repellent Surface 384-Well Platten mit flachem Boden wurden von Greiner Bio-One gekauft. Die flachen, TC-behandelten 384-Well-Optik-Imaging-Platten mit klarem Boden wurden von Corning gekauft. Humane pluripotente H9-Stammzellen (hPSCs) (WA09) wurden von WiCell gekauft. EDTA (46-034-CI) und wachstumsfaktorreduziertes Matrigel (356231) wurden von Corning (Corning) bezogen. Geltrex, hESC-qualifiziert (A1413302), Essential 8 Flex Medium Kit (A2858501), Essential 6 Flex Medium Kit (A1516401) und Advanced DMEM/F12 (12634028) wurden von Thermo Fisher Scientific erworben. Rekombinantes Human-/Maus-/Ratten-Aktivin-A-Protein (338-AC-050) wurde von R&D Systems erworben. FBS für iPS-Zellen (1701) wurde von ScienCell gekauft. Der tiefrote Plasmamembranfarbstoff CellMask wurde von Invitrogen bezogen. Phalloidin-iFluor 405-Reagenz (ab176752) wurde von Abcam gekauft.

Die folgenden Antikörper wurden gekauft und vor der Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers in PBS verdünnt: DYKDDDDK-Epitop-Tag Alexa Fluor 647-konjugierte Antikörper (1042E, Kaninchen, R&D Systems, IC8529R, AEOB0118081, 1:100); DYKDDDDK-Epitop-Tag Alexa Fluor 488-konjugierte Antikörper (1042E, Kaninchen, R&D Systems, IC8529G, AEOA0521031, 1:100); Anti-MYC-Tag (9B11) monoklonale Maus-Antikörper (AlexaFluor 647-Konjugat) (Cell Signaling Technology, 2233, 25, 1:100); Anti-HA-Tag (6E2) monoklonale Maus-Antikörper (AlexaFluor 647-Konjugat) (Cell Signaling Technology, 3444, 15, 1:100); Anti-Human-HGFR/c-MET (95106) AlexaFluor 488-konjugierte Antikörper (R&D Systems, FAB3582G, 1:50); Anti-EGFR-Antikörper (DH8.3) (AlexaFluor 647) (Novusbio, 50599AF647, 1:50); und Anti-6×His-Tag (HIS.H8)-Antikörper (Abcam, ab18184, 1:100).

Die Zellsortierung und Durchflusszytometrie wurden mit dem FACSAria II Cell Sorter oder dem LSR II Flow Cytometer (Beckton-Dickinson) durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie wurde unter Verwendung des automatisierten konfokalen Spinning-Disk-Mikroskops Opera Phenix mit einem ×20-Wasserimmersionsobjektiv in 384-Well-Platten durchgeführt; die Nikon TiE mit CSU-X1-Spinning-Disk-Konfokaleinheit mit ×60- und ×100-Ölimmersionsobjektiven; oder das Zeiss LSM 980 mit Airyscan 2 mit einem ×40-Wasserimmersionsobjektiv.

Alle Konstrukte wurden in einen pHR-Vektor kloniert, der den SFFV-Promotor, die Kozak-Konsensussequenz und eine spaltbare Signalsequenz von Influenza-Hämagglutinin (MKTIIALSYIFCLVFA)50 enthielt.

Um die synCAM-Konstrukte zu entwerfen, wurden Transmembran- und intrazelluläre Regionen von zellulären Adhäsionsmolekülen anhand von Topologieanmerkungen in UniProt51 identifiziert. Codon-optimierte Gene, die jede CAM-ICD- und TM-Region kodieren, wurden von Integrated DNA Technologies erworben und mittels In-Fusion-Klonierung in den Vektor eingefügt. Jede CAM TM- und ICD-Region wurde mithilfe der In-Fusion-Klonierung mit einer extrazellulären Bindungsdomäne (z. B. GFP, Anti-GFP) fusioniert (Ergänzungstabelle 2). Sequenzen für alle Nanobody- oder scFv-ECDs wurden aus zuvor veröffentlichten Arbeiten oder aus öffentlich zugänglichen Patenten20,52,53,54,55,56 erhalten. Für die Experimente mit Darmepithelzellen wurden eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) und ein Puromycin-N-Acetyltransferase-Gen (Puro) stromabwärts der GFP-ICAM-1- und GFP-Tether-Konstrukte innerhalb des pHR-Vektors kloniert. Die Plasmide wurden von RF Biotech sequenzverifiziert.

Lentivirus wurde durch Cotransfektion von Vektoren, die Verpackungsproteine ​​(pMD2.G und p8.91) kodieren, mit dem interessierenden pHR-Plasmid unter Verwendung des Fugene 6 HD-Transfektionsreagenzes (gemäß dem Protokoll des Herstellers) in HEK293T-Zellen, die in Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert wurden, bei etwa 70 erzeugt % Zusammenfluss. Zwei Tage nach der Transfektion wurden virale Überstände gesammelt, durch einen 0,45-mm-Filter geleitet und sofort zur Transduktion verwendet.

Zur Transduktion von Primärzellen wurde das Lentivirus mit dem Lenti-X Concentrator Kit (Takara) gemäß dem Protokoll des Herstellers 20-fach konzentriert.

L929- und MDCK-Zellen wurden in DMEM mit 10 % FBS kultiviert. Um stabile Zelllinien zu erzeugen, wurde der Virusüberstand (50–400 µl) mit 1,5 ml Medium verdünnt und direkt mit Zellen (1 × 105 L929 oder MDCK) in 12-Well-Schalen ausplattiert. Dann, 24 Stunden nach der Infektion, wurde das Virusmedium durch normales Wachstumsmedium ersetzt und die Zellen wurden in einen T25-Kolben expandiert. Die Zellen wurden mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper auf die entsprechende Epitopmarkierung hin gefärbt und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) nach Expression sortiert. Sofern nicht anders angegeben, wurde für jedes Experiment eine nach Massen sortierte Population verwendet. Um die GFP-ICAM-1- und GFP-Tether-L929-Zelllinien mit abgestimmten Expressionsniveaus zu erzeugen, wurde die den Zellen zugesetzte Gesamtvirusmenge zwischen 50 und 400 µl titriert und die Zellen wurden mithilfe von FACS nach verschiedenen synCAM-Expressionsniveaus sortiert. Für die Aph4- und IF1-synCAMs wurden Einzelzellpopulationen durch Sortieren einzelner Zellen in eine 96-Well-Platte erstellt.

Um das Expressionsniveau von synCAMs in jeder Zelllinie zu bestätigen, wurden die Zellen mittels FACS analysiert. Die Zellen wurden mit TrypLE abgelöst und auf eine 96-Well-Rundbodenplatte übertragen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (für 4 Minuten bei 400 g), der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden in 40 μl PBS, das einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Antikörper enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden 50 Minuten lang bei 4 °C gefärbt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in PBS mit 5 % FBS resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie (BD LSR II, BD FACSDiva) analysiert. Die Durchflusszytometriedaten wurden dann mit FlowJo (TreeStar) analysiert.

Vor der Durchführung des Experiments wurden alle Zelllinien mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und anschließend auf 4 × 105 Zellen pro ml verdünnt. L929-Zellen, die zytosolisches BFP und ein GFP-synCAM stabil exprimieren, wurden 1:1 mit L929-Zellen, die zytosolisches mCherry und ein Anti-GFP-synCAM exprimierten, in einer 384-Well-Platte mit flachem Boden und zellabweisender Oberfläche (3,2 × 104 Zellen, 80 µl) gemischt Gesamtvolumen, 37 °C). Bei t = 3 h wurden die Platten mit 20-facher Vergrößerung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet. Bilder mit maximaler Projektion wurden aus der Software des Herstellers (Harmony) exportiert. Es wurden deutliche Zellpaare ähnlicher Größe identifiziert und Kontaktwinkel in ImageJ gemessen. Der Prozentsatz der GFP-Anreicherung wurde in ImageJ bestimmt, indem das an der Zell-Zell-Grenzfläche lokalisierte GFP-Signal als Bruchteil des in der gesamten Zelle vorhandenen GFP-Signals gemessen wurde. Die Datenanalyse für die gemessenen Kontaktwinkel- und Anreicherungswerte wurde in Prism 9 (GraphPad) durchgeführt.

Wir haben die Geschwindigkeit, Grenzflächengröße und Morphologie der Ausbreitung von synCAM-Zellen auf einer GFP-beschichteten Oberfläche charakterisiert. Gereinigtes GFP-Protein wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 µM in PBS verdünnt und es wurde genügend Volumen aufgetragen (~100 µl), um die Bodenfläche einer 8-Well-Bildgebungskammer mit Glasboden zu bedecken. Diese Lösung wurde 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Überschüssige Lösung wurde entfernt und die Kammer mit PBS gespült. Anschließend wurde die Kammer mit einer Lösung aus 10 mg ml-1 Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mg ml-1 Beta-Casein (Sigma-Aldrich) für mindestens 1 Stunde auf Eis blockiert. Die Blockierungslösung wurde entfernt und die Kammer wurde dreimal mit PBS gewaschen. Bei der Verwendung von CellVis (C8-1.5HN)-Kammern wurden ein Anti-6×-His-Antikörper (ab18184) und 6×-His-markiertes GFP (ab134853) verwendet, um eine vollständige Abdeckung der Oberfläche mit GFP zu erreichen. Eine 100-fache Verdünnung des Antikörpers in PBS wurde auf der Oberfläche der Kammer 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde eine 10 µg ml-1-Lösung, die His-markiertes GFP enthielt, 1 Stunde lang bei 4 °C auf der Oberfläche inkubiert. Anschließend wurde die Kammer mit einer Lösung aus 10 mg ml-1 BSA und 1 mg ml-1 Beta-Casein (Sigma-Aldrich) für mindestens 1 Stunde auf Eis blockiert. Die Blockierungslösung wurde entfernt und die Kammer dreimal mit PBS gewaschen.

Um die Zellen für den Ausbreitungstest vorzubereiten, wurden L929-Zellen mit Trypsin EDTA abgelöst und in Zellkulturmedium resuspendiert. Etwa 50 µl resuspendierte Zelllösung aus einem konfluenten T25-Kolben wurden zu 200 µl Zellkulturmedium gegeben und in die Bildgebungskammer gegeben. Die Kammer wurde dann in ein konfokales Rotationsscheibenmikroskop überführt, das mit einem Umgebungskontrolltisch von Oko Labs ausgestattet war. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 2 Stunden alle 3 Minuten mit einem Ölimmersionsobjektiv ×60 abgebildet. Während der ersten 60–90 Minuten wurde die Ausbreitung verschiedener Zellen auf der Oberfläche durch Überwachung der im Zytoplasma der synCAM-Zellen exprimierten zytoplasmatischen Fluoreszenzproteine ​​beobachtet.

Die Bilder wurden durch Binärisierung der Intensität analysiert, um eine Maske der Zelle zu erhalten, die dann zur Berechnung der gesamten Ausbreitungsfläche (A) und des Umfangs (p) des Fußabdrucks verwendet werden konnte. Um die Morphologie der Schnittstelle zu charakterisieren, wurde die Zirkularität (c = p2/4πA) berechnet und zwischen verschiedenen synCAMs verglichen. Diese Messungen wurden auch unter Verwendung eines fluoreszierenden Anti-Flag-Tag-Antikörpers (markiert synCAM-Konstrukte) durchgeführt, um die Fläche und Morphologie direkt an der Schnittstelle zum Deckglas zu messen. Um unterschiedliche Ausbreitungskinetiken zu vergleichen, wurde die zeitliche Änderung der Fläche mit der folgenden Form angepasst: A = bt1/4 wobei b der Ausbreitungsratenkoeffizient ist. Dieses Modell wurde zuvor verwendet, um die Kinetik der Ausbreitung von Zellen auf einer Klebefläche zu vergleichen26. Die Analyse wurde in MATLAB (2020a) implementiert.

Um das Aktin-Zytoskelett sichtbar zu machen, wurden sich ausbreitende Zellen für die Immunhistochemie gemäß Standardverfahren fixiert und gefärbt. Die Zellen wurden in 4 % PFA in Zytoskelettpuffer (10 mM PIPES, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2) 20 Minuten lang auf Eis fixiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal gewaschen und mit 0,1 % Triton X-100-Lösung in PBS 10 Minuten lang auf Eis permeabilisiert und erneut dreimal gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 10 % BSA in PBS (PBS-BSA) für mindestens 1 Stunde bei 4 °C blockiert. Um das Aktin-Zytoskelett sichtbar zu machen, wurden die Zellen mit fluoreszierend markiertem Phalloidin (konjugiert mit den Fluoreszenzfarbstoffen Alexa 647, 555 oder 405) angefärbt. Die Zellen wurden dann mit einem konfokalen Spinnscheibenmikroskop und einem Objektiv mit 100-facher Vergrößerung abgebildet. Die Zellperipherie wurde durch Anfärben mit der tiefroten Plasmamembranfärbung CellMask (Invitrogen) bestimmt. Für Messungen zur Untersuchung der Auswirkungen von Zytoskelett-Inhibitoren auf die Zellausbreitung wurden Zellen in ein Medium mit dem Inhibitor eingebracht und auf der GFP-beschichteten Oberfläche (CK666 (100 µM), Latrunculin B (5 µM), SMIFH2 (100 µM) verteilt. Blebbistatin-Inhibitoren (50 µM) wurden von Abcam bezogen. Anschließend wurden die Zellen gemäß dem obigen Verfahren fixiert und gefärbt, bevor sie mit dem Zeiss 980 Airyscan-Mikroskop und einem ×40-Wasserimmersionsobjektiv (Zen Blue) abgebildet wurden.

Vor der Durchführung des Experiments wurden alle Zelllinien mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und anschließend auf 1 × 103 Zellen pro ml verdünnt. L929-Zellen, die zytosolisches BFP und ein Anti-GFP-synCAM mit unterschiedlicher Affinität stabil exprimierten, wurden 1:1:1 mit L929-Zellen, die zytosolisches mCherry und ein Anti-GFP-synCAM mit unterschiedlicher Affinität exprimierten, und L929-Zellen, die GFP-ICAM-1 in verschiedenen Vertiefungen exprimierten, gemischt einer 384-Well-ULA-Rundbodenvertiefung (80 µl Gesamtvolumen). Bei t = 24 h wurden die Vertiefungen mit 20-facher Vergrößerung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet.

Um die Organisation verschiedener synCAM-exprimierender Zellen im multizellulären Differentialsortierungstest zu quantifizieren, haben wir die radiale Verteilungsfunktion g(r) aus konfokalen Mehrkanal-3D-Stapeln berechnet. Zellen, die mCherry und BFP exprimieren, wurden mit 20-facher Vergrößerung und einer Z-Schrittgröße von 10 µm abgebildet. Für jeden Schnitt im Bildstapel wurde ein Schwellenwert ermittelt und für jeden Farbkanal binarisiert, und der Massenschwerpunkt (COM) des Clusters wurde ermittelt. g(r) wurde ermittelt, indem der Abstand jedes Pixels vom COM berechnet und auf die Pixeldichte innerhalb des Clusters normalisiert wurde. Um einen einzelnen Wert zu erstellen, der die Verteilung der Zellen im Cluster erfasst, haben wir den COM der g(r)-Verteilung berechnet und diesen Wert für die mCherry-Zellen vom Wert für die BFP-Zellen abgezogen. Große Werte zeigen daher an, dass mCherry-Zellen näher am Zentrum des Clusters liegen, und kleine Werte zeigen an, dass BFP-Zellen näher am Zentrum des Clusters liegen. Die Bildanalyse wurde in MATLAB (2020a) implementiert.

Es wurden L929-Zellen erzeugt, die synCAMs mit orthogonalen heterophilen Paaren und einem zytosolischen mCherry oder BFP stabil exprimieren. Vor der Durchführung des Experiments wurden Zelllinien mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und anschließend auf 4 × 105 Zellen pro ml verdünnt. Jedes Paar wurde 1:1 in einer 384-Well-Platte mit flachem Boden und zellabweisender Oberfläche gemischt (3,2 × 104 Zellen, 80 µl Gesamtvolumen, 37 °C). Bei t = 3 h wurden die Platten mit 20-facher Vergrößerung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet. Bilder mit maximaler Projektion wurden mit der Software des Herstellers erstellt.

Um die Orthogonalität der heterophilen synCAM-Paare zu validieren, wurde eine Untergruppe hinsichtlich der Fähigkeit zur differenziellen Sortierung anhand der L929-Elternzellen charakterisiert. Die synCAM-Zelllinien wurden mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und dann auf 1 × 103 Zellen pro ml verdünnt. L929-Elternzellen wurden mit TrypLE abgelöst, mit CellTrace Far Red gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt und auf 1 × 103 Zellen pro ml verdünnt. Zwei synCAMs und die WT L929-Zellen wurden 1:1:1 (insgesamt 80 µl) in einer ULA-Rundbodenvertiefung gemischt und nach 24 Stunden bei 20-facher Vergrößerung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet. Anschließend wurden mit der Software des Herstellers (Harmony) Bilder mit maximaler Projektion erstellt. Innerhalb der Software wurden einzelne Zellen segmentiert und der Mittelpunkt der Anordnung auf Basis der durchschnittlichen Position aller Zellen berechnet. Anschließend wurde der Abstand der WT (Far Red) L929-Zellen und synCAM (BFP)-Zellen vom zuvor berechneten Zentrum der Anordnung bestimmt. Anschließend wurde der Unterschied zwischen dem durchschnittlichen Abstand von WT- und synCAM-Zellen berechnet und als Wärmekarte dargestellt, wobei größere Abstände einem stärkeren Ausschluss von WT-Zellen aus der Anordnung entsprechen.

Homotypische synCAMs wurden entwickelt, um ECD-cis-Wechselwirkungen der Bindungsregion sterisch zu beeinträchtigen. Antiparallele Leucin-Reißverschlüsse, die die trans- gegenüber der cis-Bindung begünstigen sollten, wurden an eine Fibcon-Linkerdomäne fusioniert, die den Rezeptor von der Juxtamembranregion aus verlängert37,38,36. Versuche, homotypische synCAMs ohne den Fibcon-Linker zu entwerfen, waren erfolglos. Diese konstruierten ECDs wurden mit einem ICAM-1 TM/ICD verschmolzen.

Es wurden L929-Zellen erzeugt, die die homophilen synCAM-Rezeptoren und das zytosolische mCherry stabil exprimieren. Klonale Zelllinien wurden durch Einzelzellsortierung erhalten. Die Zelllinien wurden mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und dann auf 1 × 103 Zellen pro ml verdünnt. Die Zellen wurden in einer ULA-Rundbodenplatte mit 384 Vertiefungen (80 Zellen, 80 µl Gesamtvolumen, 37 °C) 24 Stunden lang inkubiert und dann durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet. Bilder mit maximaler Projektion wurden mit der Software des Herstellers (Harmony) erstellt.

Zuvor wurden L929-Zellen generiert, die WT PCAD und zytosolisches mCherry exprimieren6. L929-Zellen, die zytosolisches BFP mit oder ohne stabile Expression eines Anti-PCAD-synCAM (ICAM-1 TM/ICD) exprimierten, wurden 1:1 mit L929-Zellen, die WT-PCAD und zytosolisches mCherry stabil exprimierten, in einer ULA-Rundbodenplatte mit 384 Vertiefungen gemischt ( 80 Zellen, 80 µl Gesamtvolumen, 37 °C) für 24 h und abgebildet mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix). Bilder mit maximaler Projektion wurden mit der Software des Herstellers (Harmony) erstellt. Innerhalb der Harmony-Software wurde die Gesamtfläche, die sowohl von den L929-Zellen, die WT-PCAD (mCherry) exprimieren, als auch von den WT- oder Anti-PCAD-Zellen (BFP) umfasst wird, für jedes Bild mit maximaler Projektion zu jedem Zeitpunkt aus verschiedenen Vertiefungen berechnet. Anschließend wurde das Flächenverhältnis von BFP zu mCherry-Zellen berechnet und über 24 Stunden aufgetragen, wobei ein erhöhtes Verhältnis dem Ausschluss von BFP-Zellen aus der mehrzelligen Anordnung entsprach (Extended Data, Abb. 10b). Darüber hinaus wurden die Zellen für t = 24 h segmentiert und die Position der Mitte der Anordnung als durchschnittliche Position der mCherry+- und BFP+-Zellen berechnet. Anschließend wurde der relative Abstand der BFP+- und mCherry+-Zellen zum Zentrum der Anordnung berechnet (Extended Data Abb. 10c), wobei ein größerer Abstand einem erhöhten Ausschluss von BFP+ L929-Zellen entspricht.

Für die multizellulären Strukturierungsexperimente wurden L929-Zelllinien mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und dann auf 1 × 103 Zellen pro ml verdünnt. Vor der Verdünnung wurden die Aph4- und IF1-synCAMs gemäß dem Protokoll des Herstellers mit CellTrace Far Red bzw. CFSE gefärbt.

Um das zweizellige alternierende Muster zu erzeugen, wurden L929-Zellen, die GFP-ICAM-1 (Zelle 1) exprimierten, mit L929-Zellen gemischt, die zytosolisches mCherry und LaG16-ICAM-1 (Anti-GFP) (Zelle 2) exprimierten (1:1 80 µl). gesamt). Um das Drei-Zellen-Brückenmuster zu erzeugen, wurden L929-Zellen, die GFP-ECAD exprimierten (Zelle 1), mit Zellen, die zytosolisches mCherry, LaG16-ECAD und Anti-CD19-ICAM-1 exprimierten (Zelle 2), und Zellen, die zytosolisches BFP und CD19 exprimierten, gemischt –ICAM-1 (Zelle 3) (1:2:1 80 µl insgesamt). Um das zyklische Muster aus drei Zellen zu erzeugen, wurden L929-Zellen, die GFP-ECAD und Anti-MBP-ICAM-1 exprimierten (Zelle 1), mit Zellen, die LaG16-ECAD und mCherry-ICAM-1 exprimierten (Zelle 2), und Zellen, die MBP exprimierten, gemischt –ICAM-1, LaM4–ICAM-1 und zytosolisches BFP (Zelle 3) (1:1:1 80 µl insgesamt). In allen Fällen wurden die Zellen in ULA-Rundbodenvertiefungen ausplattiert und nach 2 Stunden mittels konfokaler Mikroskopie (Phenix) abgebildet. Mit der Software des Herstellers (Harmony) wurden Bilder mit maximaler Projektion aus verschiedenen Vertiefungen erstellt. Um die Interaktionswahrscheinlichkeitstabellen zu berechnen, wurden die Zellen für jedes Bild mit maximaler Projektion in Harmony segmentiert. Zell-Zell-Kontakte wurden anhand der Positionen der segmentierten Zellen identifiziert und die Wahrscheinlichkeit für jede Interaktion berechnet und als Wärmekarte dargestellt.

Um die isolierten zyklischen Anordnungen aus drei und vier Zellen zu bilden, wurden L929-Zellen verwendet, die GFP-ECAD und Anti-MBP-ICAM-1 exprimieren (Zelle 1); LaG16–ECAD und mCherry–ICAM-1 (Zelle 2); und MBP-ICAM-1, LaM4-ICAM-1 und zytosolisches BFP (Zelle 3) wurden auf 4 × 103 Zellen pro ml verdünnt und in einer Vertiefung mit flachem Boden und zellabweisender Oberfläche ausplattiert. Einzelne Paare wurden identifiziert und Bilder mit maximaler Projektion erstellt und exportiert.

L929-Zellen, die Wt-ECAD und zytosolisches BFP, Aph4-ICAM-1 oder IF1-ICAM-1 exprimieren, wurden in ULA-Rundbodenvertiefungen (1:1 oder 1:1:1) miteinander gemischt (entweder einzeln oder alle drei zusammen). 80 µl insgesamt). Die Zellen wurden nach 48 Stunden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Die Maximumprojektionsbilder wurden aus verschiedenen Vertiefungen mit der Software des Herstellers (Harmony) erstellt und auf der Grundlage des Assemblierungsphänotyps klassifiziert.

Erwachsene menschliche Hautfibroblasten (NHDF-Ad) und embryonale Mausfibroblasten (MEFs) wurden in DMEM mit 10 % FBS kultiviert. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden in mesenchymalem Stammzellwachstumsmedium (Lonza) kultiviert.

Um stabile Zellen zu erzeugen, die die synCAM-Konstrukte exprimieren, wurde der Virusüberstand (15 µl des 20-fach konzentrierten Virus) mit 1,5 ml Medium verdünnt und direkt mit Zellen ausplattiert, die bis zu einer Konfluenz von 80 % gewachsen waren (5 × 104 MSCs, MEFs oder NHDFs, ausplattiert in einem 12 -na ja Gericht). Dann, 24 Stunden nach der Transduktion, wurde das virale Medium durch normales Wachstumsmedium ersetzt und die Zellen wurden in einer Schale mit 6 Vertiefungen expandiert. MEFs wurden durch FACS weiter nach Expression von synCAM-Konstrukten sortiert.

Mit der offiziellen Genehmigung des UCSF Human Gamete, Embryo and Stem Cell Research Committee (GESCR) an FF haben wir in dieser Studie die von WiCell erworbenen menschlichen embryonalen Stammzelllinien WA09 verwendet. Diese Zelllinien und ihre Originalprobe sind vollständig anonymisiert und kein Autor hatte Zugriff auf die Identifikatoren.

hPSCs (WA09, WiCell) wurden in E8-Medium auf Geltrex-beschichteten Platten mit sechs Vertiefungen gehalten. Zwei Tage vor Beginn der Differenzierung der glatten Muskulatur wurden hPSCs mit EDTA dissoziiert und in eine mit Geltrex beschichtete Platte mit sechs Vertiefungen replattiert. Sobald die hPSCs Konfluenz erreichten, wurde das E8-Medium abgesaugt und durch 1 ml pro Vertiefung Essential 6 mit 100 ng ml Aktivin A ersetzt. Am nächsten Tag wurde das Medium abgesaugt und durch 2 ml pro Vertiefung E6-Medium mit 10 ng ml ersetzt −1 BMP4. Zwei Tage später wurde das Medium abgesaugt und durch 2 ml E6-Medium pro Vertiefung mit 10 ng ml−1BMP4 ersetzt. An den Tagen 5–9 wurden die Zellen jeden zweiten Tag mit frischem E6-Medium + 2 % FBS gehalten. Ab Tag 10 wurde das Medium dreimal pro Woche durch Advanced DMEM/F12 + 10 % FBS ersetzt.

Um SMCs mit stabiler Expression von synCAMs zu erzeugen, wurden die SMCs in einer 96-Well-Platte bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet und mit 1 µl 20-fach konzentriertem Virus transduziert. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt.

Das Darmepithel wurde wie zuvor beschrieben isoliert und kultiviert57. Kurz gesagt, wurden Dünndarmkrypten vom Zwölffingerdarm männlicher C57BL/6-Mäuse im Alter von 6–12 Wochen getrennt. Das Gewebe wurde 30 Minuten lang in eiskaltes PBS mit 15 mM EDTA gelegt und dann in mehreren Fraktionen kräftig gewirbelt, um Krypten freizusetzen. Der die Krypten enthaltende Überstand wurde auf einem 70-μM-Netz filtriert, und dann wurden die Krypten pelletiert und in wachstumsfaktorreduziertem Matrigel resuspendiert und als 3D-Enteroide mit ENR-Medium (Advanced DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, 12634-028)) kultiviert. mit 1× N2 (Thermo Fisher Scientific, 17502-048), 1× B27 (Thermo Fisher Scientific, 17504-044), 10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific, 15630080), 1× GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, 35050-061) , 1 mM N-Acetylcystein (Sigma-Aldrich A9165), 100 U ml-1 Penicillin und 100 mg ml-1 Streptomycin (Corning, 30-002), ergänzt mit 50 ng ml-1 EGF (Sigma Aldrich, E9644.2MG) , 100 ng ml−1 Noggin (R&D 6057-NG/CF) und 5 % R-Spondin-konditioniertes Medium). Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt und die Organoide wurden wöchentlich mechanisch dissoziiert und passagiert.

Für diese Experimente wurden Mäuse in einer spezifischen pathogenfreien Tierhaltung der University of California San Francisco (UCSF) gehalten. Alle Wartungsarbeiten und Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und des Laboratory Animal Resource Center durchgeführt. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Laboratory Animal Resource Center der UCSF genehmigt. Mäuse wurden in den UCSF LARC Animal Care Facilities am UCSF Parnassus untergebracht. Sie wurden in einer individuellen, spezifischen, pathogenfreien Suite untergebracht. Sie wurden mit bis zu fünf Mäusen pro Käfig in Beatmungskäfigen mit Futter und Wasser nach Belieben unter einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus und kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen (20–26 °C und 30–70 %) gehalten.

Zur Expression von synCAM-Konstrukten wurden Organoide wie zuvor beschrieben mit Lentivirus transduziert58. Zuerst wurden 3D-Enteroide mit TrypLe in einzelne Zellen dissoziiert, die dann in Matrigel mit reduziertem Wachstumsfaktor und Transduktionsmedium (NR-Medium, ergänzt mit 50 % Wnt3a-konditioniertem Medium, 10 μM Nicotinamid (Sigma-Aldrich, N3376-100G)) gezüchtet wurden. , 5 μM CHIR (Sigma-Aldrich, SML1046-5MG) und 10 μM Y-27632 (Sigma-Aldrich, Y0503-1MG)) für 3–5 Tage zur Anreicherung von Stammzellen. Anschließend wurden die Enteroide dissoziiert, pelletiert, in Transduktionsmedium mit 8 μg ml-1 Polybren (Sigma-Aldrich, H9268-5G) und konzentriertem Lentivirus resuspendiert, 1 Stunde lang bei 32 °C bei 600 g zentrifugiert und dann 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert H. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in Matrigel resuspendiert und 3 Tage lang in Transduktionsmedium gezüchtet, dann auf ENR-Medium umgestellt. Nach der Amplifikation erfolgte die Antibiotikaselektion durch Zugabe von 1 μg ml−1 Puromycin (Thermo Fisher Scientific, A1113803) zum Medium.

GFP-ICAM-1, GFP-Tether, Anti-GFP-Fibcon-ICAM-1 oder Anti-GFP-Fibcon-Tether wurden in MSCs, NHDFs oder SMCs transduziert. Für diese Experimente wurde eine Fibcon-Linker-Domäne sowohl für die Anti-GFP-ICAM-1- als auch für die Anti-GFP-Tether-Konstrukte einbezogen, um die Expression in Primärzellen zu verbessern. Alle GFP-exprimierenden Zellen wurden mit einem Plasmid zur Expression von zytosolischem BFP co-transduziert, und alle Anti-GFP-exprimierenden Zellen wurden mit einem Konstrukt co-transduziert, das zytosolisches mCherry exprimierte. Dann, 24 Stunden nach der Transduktion, wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Nach 4 bis 7 Tagen wurden die MSCs, SMCs oder NHDFs mit TryplE abgelöst, im Medium resuspendiert und in einer 384-Well-Platte ausplattiert. Dann, 24 Stunden nach dem Ausplattieren, wurden die Vertiefungen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet.

L929-Zellen, die WT-PCAD, zytosolisches mCherry und LaG16-synCAM (ICAM-1, ECAD oder Tether-Kontrolle) stabil exprimieren, wurden 1:1 mit L929-Zellen gemischt, die WT-ECAD, zytosolisches BFP und ein GFP-synCAM (ICAM-1, ECAD oder Tether-Kontrolle) stabil exprimieren Tether-Kontrolle) in einer ULA-Rundbodenplatte (80 Zellen insgesamt, 80 µl, 24 h, 37 °C). Vor dem Mischen wurden die L929-Zelllinien mit TrypLE abgelöst, in 1 ml DMEM resuspendiert, gezählt und dann auf 1 × 103 Zellen pro ml verdünnt. Die Baugruppen wurden mithilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (Phenix, 20-fache Vergrößerung) abgebildet, und Maximalprojektionsbilder aus verschiedenen Vertiefungen wurden mit der Software des Herstellers erstellt und werden angezeigt.

Um die Anordnung zwischen L929-Zellen, die WT-NCAD exprimieren, und L929-Zellen, die WT-PCAD exprimieren, zu modifizieren, wurde das Experiment genau wie oben beschrieben mit L929-Zellen durchgeführt, die WT-NCAD und zytosolisches GFP anstelle der WT-ECAD-Zellen exprimieren.

Eine anhaftende Schicht von MDCK-Zellen, die zytosolisches BFP und GFP-Tether, GFP-ICAM-1 oder GFP-ECAD exprimieren, wurde in den Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen gebildet (16.000 Zellen pro Vertiefung ausplattiert). Nach 48 Stunden wurden L929-Zellen hinzugefügt, die WT PCAD, zytosolisches mCherry und LaG16–ICAM-1, LaG16–tether, LaG16–ECAD oder keinen zusätzlichen Rezeptor exprimierten (24.000 Zellen pro Vertiefung). Die Wechselwirkung zwischen den beiden Schichten wurde mithilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) 24 Stunden lang abgebildet. Die verkleinerten Bilder der Baugruppen wurden durch Zusammenfügen von neun benachbarten Sichtfeldern nach dem Exportieren der Bilder aus der Software des Herstellers erstellt. Sowohl die Rundheit als auch die Oberfläche der mCherry+-Anordnung wurden für jedes Feld des Experiments in der Software des Herstellers (Harmony) quantifiziert.

Einschichtige Enteroidkulturen wurden wie zuvor beschrieben59 etabliert. 3D-Enteroide wurden mit TrypLE in einzelne Zellen dissoziiert, in PBS gewaschen und mit CellTrace gefärbt. Insgesamt 150.000 Zellen, die entweder GFP-ICAM-1 oder GFP-Tether exprimierten, wurden auf eine 384-Well-Paste ausplattiert, die mit 5 % wachstumsfaktorreduziertem Matrigel in 40 μl ENR-Medium, ergänzt mit 3 μM CHIR und 10 μM Y-27632, vorbeschichtet war . Nach 4 Stunden wurden jeder Vertiefung weitere 60 μl ENR-Medium zugesetzt. Dann, 24 Stunden nach dem Ausplattieren, wurden die enteroiden Monoschichten, embryonale Fibroblastenzellen (MEFs) der Maus, die Anti-GFP-Fibcon-Tether oder Anti-GFP-Fibcon-ICAM-1 exprimierten, und zytosolisches mCherry hinzugefügt (16.000 Zellen). Nach 24 Stunden wurden die Vertiefungen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (Phenix) abgebildet. Bilder mit maximaler Projektion und 3D-Bilder wurden aus der Software des Herstellers (Harmony) exportiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Experimentelle Daten, die die Schlussfolgerungen dieser Studie stützen, sind im Artikel und in den Zusatzinformationen verfügbar. Alle in dieser Studie verwendeten Datenbanken sind öffentlich verfügbar. Zur Identifizierung von Proteinsequenzen und Domänenarchitektur wurde die Universal Protein Resource (https://www.uniprot.org/) verwendet. Zur Identifizierung linearer Motive innerhalb von CAM-ICDs wurde die Ressource Eukaryotic Linear Motif (ELM) (http://elm.eu.org/) verwendet. Weitere Mikroskopie-Replikate sind bei Figshare verfügbar (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21647546.v1). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken D. Mullins, Z. Gartner, V. Weaver, M. Kutys und den Mitgliedern des Lim-Labors und des Cell Design Institute für Diskussionen, Unterstützung und Ratschläge. Diese Arbeit wurde von einem NSF Center for Cell Construction Grant (DBI-1548297), dem NIH NCI (U01CA265697) und dem UCSF Cell Design Institute unterstützt. AJS ist ein Damon Runyon Fellow, der von der Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG, 2355-19) unterstützt wird, und ein Hartz Cell Design Fellow. ARH wurde durch einen NSERC Discovery Grant (RGPIN-2022-04933) unterstützt. JG wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke durch die UCSF-Zuschussnummer 2R25NS070680-11 unterstützt.

Andrew R. Harris

Derzeitige Adresse: Fakultät für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik, Carleton University, Ottawa, Ontario, Kanada

Wesley L. McKeithan

Aktuelle Adresse: Maze Therapeutics, San Francisco, CA, USA

UCSF Cell Design Institute, University of California, San Francisco, CA, USA

Adam J. Stevens, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Wesley L. McKeithan und Wendell A. Lim

Abteilung für Zelluläre und Molekulare Pharmakologie, University of California, San Francisco, CA, USA

Adam J. Stevens, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Jonathan T. Ramirez, Wesley L. McKeithan, Faranak Fattahi und Wendell A. Lim

Zentrum für Zellbau, University of California, San Francisco, CA, USA

Adam J. Stevens, Andrew R. Harris, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Wesley L. McKeithan, Daniel A. Fletcher und Wendell A. Lim

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California, Berkeley, CA, USA

Andrew R. Harris und Daniel A. Fletcher

Abteilung für Neurologie, Weill Institute for Neuroscience, University of California, San Francisco, CA, USA

Josiah Gerdts

Programm für kraniofaziale Biologie, University of California, San Francisco, CA, USA

Coralie Trentesaux & Ophir D. Klein

Abteilung für Orofaziale Wissenschaften, University of California, San Francisco, CA, USA

Coralie Trentesaux & Ophir D. Klein

Eli und Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, CA, USA

Jonathan T. Ramirez & Faranak Fattahi

Abteilung für Pädiatrie, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, Kalifornien, USA

Ophir D. Klein

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA

Daniel A. Fletcher

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Von AJS, ARH, CT, FF, ODK, DAF und WAL konzipierte Forschung. AJS, JG, KHK und WLM haben Plasmide geklont und Zelllinien generiert. AJS führte Zell-Zell-Adhäsionsexperimente durch. ARH führte Zellausbreitungsadhäsionsexperimente durch. AJSCT, JTR und KHK führten Adhäsionsexperimente in primären und von iPS-Zellen abgeleiteten Zellen durch. AJS und ARH analysierten Daten. AJS, ARH, DAF und WAL haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Wendell A. Lim.

WAL ist Berater für Allogene und SciFi Foods und besitzt Anteile an Gilead und Intellia. Die University of California San Francisco hat einen Patentantrag für die in dieser Arbeit beschriebenen gentechnisch veränderten Adhäsionsmoleküle eingereicht, wobei WAL und AJS als Erfinder aufgeführt sind (PCT/US2021/057601). Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Matthias Lutolf und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) FACS-Analyse der synCAM-Expression von GFP (links) und αGFP (rechts) in L929-Fibroblastenzellen nach Zellsortierung. Die Oberflächenexpression jedes synCAM wird mithilfe eines markierten Anti-FLAG-Tag-Antikörpers gemessen. Die CAM TM- und ICD-Domäne für jedes Konstrukt ist angegeben (Tether = Kontrolle ohne ICD, DLL1 = Delta-like Protein 1, JAM-B = Junction Adhesion Molecule B, NCAM-1 = Neural Cell Adhesion Molecule 1, MUC-4 = Mucin). 4, ICAM-1 = Interzelluläres Adhäsionsmolekül 1, Ecad = E-Cadherin, Intβ1 = Beta-1-Integrin, Intβ2 = Beta-2-Integrin). Die Analyse zeigt, dass die Oberflächenexpressionsniveaus der Tether- und alternativen synCAM-Konstrukte gut übereinstimmen. (b) Zusätzliche Replikate der synCAM-Zell-Zell-Adhäsionsschnittstellenanalyse. Maximale Projektion von 20x konfokalen Mikroskopiebildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (t = 3 h): GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine αGFP-exprimierende Zelle (orange) gebunden. Der GFP-Kanal der Schnittstellen wird gezeigt, was die Unterschiede in der Rezeptoranreicherung hervorhebt. Vier von zwanzig weiteren Beispielen werden hier gezeigt. (c) FACS-Analyse der αGFP-synCAM-Expression in L929-Fibroblastenzellen, die zytosolisches mCherry (links) oder BFP (rechts) exprimieren, nach Zellsortierung. Die CAM-TM- und ICD-Domäne für jedes Konstrukt ist ICAM-1, und die GFP-bindende Lama-Nanobody (LaG)-ECD für jedes Konstrukt ist angegeben. Diese Analyse zeigt, dass diese Reihe alternativer Affinitäts-synCAMs auf vergleichbaren Niveaus exprimiert wird. (d) Maximale Projektion von 20-fachen konfokalen Mikroskopbildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (t = 3 h): GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine αGFP-exprimierende Zelle mit dem angegebenen Bindungs-Kd (orange) gebunden.

(a) FACS-Analyse der αGFP-synCAM-Expression in L929-Fibroblastenzellen, die zytosolisches mCherry exprimieren, nach Zellsortierung. Die CAM-TM- und ICD-Domäne für jedes Konstrukt ist NCAM-1 oder Intβ1, und die GFP-bindende Lama-Nanobody (LaG)-ECD für jedes Konstrukt ist angegeben. Diese Analyse zeigt, dass diese Reihe alternativer Affinitäts-synCAMs auf vergleichbaren Niveaus exprimiert wird. (b) Maximale Projektion von 20X konfokalen Mikroskopiebildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (t = 3 h, Maßstabsbalken = 10 µm). Oben: GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine αGFP-exprimierende Zelle (orange) gebunden. Die CAM-TM- und ICD-Domäne für jedes Paar ist Intβ1. Unten: GFP-Kanal der Schnittstellen oben, der die Unterschiede der Rezeptoranreicherung an der Schnittstelle hervorhebt. (c) Maximale Projektion von 20X konfokalen Mikroskopiebildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (t = 3 h, Maßstabsbalken = 10 µm). Oben: GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine αGFP-exprimierende Zelle (orange) gebunden. Die CAM TM- und ICD-Domäne für jedes Paar ist NCAM-1. Unten: GFP-Kanal der Schnittstellen oben, der die Unterschiede der Rezeptoranreicherung an der Schnittstelle hervorhebt. (d) Diagramme der Kontaktwinkel, gemessen an den in b und c gezeigten Grenzflächen, im Verhältnis zur entsprechenden Affinität des LaG-Nanokörpers (Daten werden als Mittelwerte von n = 10 Paaren dargestellt, Fehler = 95 % KI). Die Kontaktwinkel für Intβ1 (blau) sind im Verhältnis zu NCAM-1 (rot) und der Tether-Kontrolle aus Abb. 1f (schwarz) dargestellt. (e) Diagramme der GFP-Anreicherung, gemessen an den in b und c gezeigten Grenzflächen, im Verhältnis zur entsprechenden Affinität des LaG-Nanokörpers (Daten werden als Mittelwerte von n = 10 Paaren dargestellt, Fehler = 95 % KI). Die GFP-Anreicherung für NCAM-1 (rot) wird im Vergleich zu Intβ1 (blau) und der Tether-Kontrolle aus Abb. 1f (schwarz) dargestellt.

Quelldaten

(a) Cartoon-Darstellung des Differentialsorting-Wettbewerbstests (links) und Quantifizierung der radialen Verteilung, dargestellt als Wärmekarte (rechts). Dieses Experiment stellt eine alternative Möglichkeit zur Messung der Adhäsionspräferenzen/-stärke der verschiedenen synCAM-gesteuerten Zell-Zell-Wechselwirkungen dar, die sich von der in Abb. 1f gezeigten Kontaktwinkelmessung unterscheidet. Hier mischen wir Oberflächen-GFP-L929-Zellen (Köderzellen) mit zwei konkurrierenden, unterschiedlich markierten L929-Zellen, jede mit einem anderen αGFP-synCAM. Eine stärkere Adhäsion des synCAM wird über den relativen Grad der Co-Sortierung der Konkurrenzzellen zum Kern in Verbindung mit den Köderzellen beurteilt. Wir berechnen die radiale Verteilung konkurrierender Zellen (rot/blau) aus dem Schwerpunkt des Sphäroids. (b) Repräsentative maximale Projektionsbilder des Zellsortierungs-Konkurrenztests zwischen L929-Zellen, die αGFP-ICAM-1 exprimieren, mit dem angegebenen ECD-LaG-Nanokörper (mCherry oder BFP), gemischt mit L929-Zellen, die GFP-ICAM-1 exprimieren (t = 24 h, Maßstabsleiste). = 50 µm). (c) Quantifizierung des Zellsortierungs-Konkurrenztests aus b (n = 4). (d) Repräsentative maximale Projektionsbilder des Zellsortierungs-Konkurrenztests zwischen L929-Zellen, die αGFP-ICAM-1 und zytosolisches exprimieren, und L929-Zellen, die αGFP-Tether exprimieren, gemischt mit L929-Zellen, die GFP-ICAM-1 exprimieren (Maßstabsbalken = 20 µm, t = 24). H). (e) Quantifizierung des Zellsortierungs-Konkurrenztests aus d (n = 4).

Quelldaten

(a) FACS-Analyse der GFP-synCAM- und αGFP-synCAM-Expression in L929-Fibroblastenzellen nach Zellsortierung mit einem ICAM-1- oder Tether-ICD. Für die GFP-Konstrukte wird die Expression sowohl für das gesamte GFP-Signal in der Zelle (Y-Achse) als auch für mit einem αFlag APC 647-Antikörper gefärbte Zellen (X-Achse) gezeigt. (b) Maximale Projektion von 20-fachen konfokalen Mikroskopiebildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (t = 3 h, Maßstabsbalken = 10 µm) unterschiedlicher Expressionsniveaus aus Panel a: GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine αGFP-exprimierende Zelle (orange) gebunden ). Die CAM TM- und ICD-Domäne für jedes Paar ist ICAM-1 oder Tether. (c) Box- und Whisker-Plots (Box = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = Min. bis Max., Mitte = Median) der Kontaktwinkel, gemessen an den in b gezeigten Grenzflächen (n = 10 Paare).

Quelldaten

(a) Beispielmikroskopische Bilder von Zellausbreitungstests aus Abb. 2, die Phänotypen für alle synCAM-Arten zeigen (Maßstabsbalken = 10 µm). Es werden repräsentative Bilder unabhängiger Replikate von Tether n = 10, ICAM-1 n = 20, JAM-B n = 20, MUC-4 n = 15, NCAM-1 n = 20, Intβ1 n = 20, Intβ2 n = 20 gezeigt SynCAMs werden in L929-Fibroblasten exprimiert und auf einer GFP-beschichteten Glasoberfläche plattiert. Der durch Membranfarbstoff erkannte Zell-Fußabdruck ist in blauer Umrandung dargestellt. Aktin, gefärbt mit Phalloidin und in Weiß dargestellt. (b) Cartoon, der den Zellausbreitungstest zeigt. L929-Zellen, die ein αGFP-synCAM exprimieren, werden auf einer GFP-beschichteten Oberfläche ausplattiert und über die Zeit überwacht. (c) Dargestellte Bilder aus dem Zellausbreitungstest von L929-Zellen, die die angegebenen synCAMs exprimieren. Gezeigt werden einzelne Schichten aus konfokalen Bildern. Maßstabsbalken = 10 µm. (d) Repräsentative Verlaufskurven der Zellausbreitungskontaktfläche von L929-Zellen, die die angegebenen synCAMs exprimieren. Fehler = SEM. (e) Berechnete Ausbreitungskonstanten für L929-Zellen, die die angegebenen synCAMs exprimieren (wobei n die Anzahl der analysierten eindeutigen Zellen ist, Tether n = 24, Ecad n = 17, JAM-B n = 23, ICAM-1 n = 16, Intβ1 n). = 16, Intβ2 n = 18, NCAM-1 n = 14, MUC-4 n = 12. Die angezeigte Linie stellt den Medianwert dar.

Quelldaten

(a) Beispielmikroskopische Bilder von L929-Fibroblasten, die αGFP JAM-B, ICAM-1 oder Tether exprimieren, die sich auf einer GFP-beschichteten Oberfläche ausbreiten und mit Phalloidin gefärbt sind (Maßstabsbalken = 10 µm). Die Ausbreitung wird in Gegenwart des angegebenen Inhibitors der Aktinregulation gezeigt. An zwei verschiedenen Tagen wurden mindestens 10 Regionen von Interesse fotografiert. (b) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel von synCAM-Schnittstellen, die das ICAM-1-ICD mit Mutationen in den ERM-Bindungsdomänen (BD) enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = min max, Mitte = Median, n = 20 Paare)60. (c) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel von synCAM-Schnittstellen, die den Intβ1-ICD mit Mutationen in den beiden Talin-Bindungsdomänenmotiven „NPxY“ enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = min max, Mitte = Median, n = 20 Paare)61. (d) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel von synCAM-Schnittstellen, die den Intβ2-ICD mit Mutationen in den beiden Talin-Bindungsdomänenmotiven „NPxF“ enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = min max, Mitte = Median, n = 20 Paare)62. (e) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel von synCAM-Schnittstellen, die das Ecad ICD mit Mutationen in der β-Catenin-Bindungsdomäne enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = Min. bis Max., Mitte). = Median, n = 20 Paare)63. (f) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel und GFP-Anreicherung von synCAM-Schnittstellen, die den MUC-4-ICD mit Mutationen in Ser- und Tyr-Phosphorylierungsstellen enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = min bis max, Mitte = Median, n = 20 Paare). (g) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel und GFP-Anreicherung von synCAM-Schnittstellen, die das JAM-ICD mit Mutationen in der PDZ-Bindungsdomäne enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = min. bis max., Mitte = Median, n = 20 Paare). (h) Maximale konfokale Projektionsbilder (Maßstabsbalken = 10 µm) und berechnete Kontaktwinkel und GFP-Anreicherung von synCAM-Schnittstellen, die das NCAM-1-ICD mit Mutationen in der Cys-Palmitoylierungsstelle enthalten (Kasten = 25. bis 75. Perzentil, Whiskers = min max, Mitte = Median, n = 20 Paare)64.

Quelldaten

(a) Maximale Projektion von 20x konfokalen Mikroskopbildern paarweiser synCAM-Schnittstellen (Maßstabsbalken = 10 µm, t = 3 h): GFP-exprimierende Zelle (blau) ist an eine αGFP-exprimierende Zelle (orange) gebunden, die den angegebenen CAM-ICD enthält. Es werden repräsentative Bilder von 10 unabhängigen Zellpaaren gezeigt. (b) GFP-Kanal der in a gezeigten Zellpaare.

(a) Cartoon, der den differenziellen Sortiertest zur Bestimmung der Orthogonalität von synCAM-ECD-Paaren zeigt. SynCAM-Paare werden mit L929-Elternzellen gemischt und nach 24 Stunden abgebildet. Die Sortierung der Elternzellen sollte nur erfolgen, wenn die zugehörigen synCAM-ECDs korrekt übereinstimmen und binden können. (b) Repräsentative maximale Projektionsbilder des Differentialsortierassays für eine Teilmenge der synCAMs mit orthogonalen ECDs (Maßstabsbalken = 20 µm). Eine Sortierung der parentalen L929-Zellen wurde nur bei übereinstimmenden ECDs beobachtet. (c) Quantifizierung der Sortierung aus b (n = 6). Die Differenz des durchschnittlichen Abstands vom Mittelpunkt der Kugel zwischen L929-Elternzellen und BFP+-Zellen wurde berechnet und als Wärmekarte dargestellt. Bei übereinstimmenden synCAM-Paaren wird ein Ausschluss von Elternzellen beobachtet. (d) Repräsentative maximale Projektionsbilder im synCAM-Design mit mehreren Epitopen innerhalb einer einzigen ECD (Maßstabsbalken = 20 µm). Die HA-CD19-ECD weist eine differenzielle Sortierung nur für αCD19- oder αHA-synCAMs auf. Auf diese Weise können wir OR-Gate-synCAMs generieren, die in der Lage sind, sich mit mehreren Adhäsionspartnern zu paaren. (e) Quantifizierung der Sortierung aus d (n = 6). Die Differenz des durchschnittlichen Abstands vom Mittelpunkt der Kugel zwischen L929-Elternzellen und BFP+-Zellen wurde berechnet und als Wärmekarte dargestellt. Bei übereinstimmenden synCAM-Paaren wird ein Ausschluss von Elternzellen beobachtet.

Quelldaten

Maximale Projektion von 20-fach konfokalen Mikroskopbildern der Differenzsortierung zwischen L929-Zellen, die WT Ecad oder die angegebenen homophil bindenden synCAMs exprimieren (Maßstabsbalken = 50 µm, t = 48 h). Repräsentative Bilder, Baugruppenklassifizierungen und Verteilungen werden für Ecad-IF1 (a), Ecad-Aph4 (b), IF1-Aph4 (c) und Ecad-IF1-Aph4 (d) angezeigt.

(a) Maximale Projektionsbilder des Sortierassays, in dem L929-Zellen, die WT PCad exprimieren (orange), mit parentalen (links) oder synCAM-L929-Zellen (rechts) gemischt werden (blau, t = 0, 24 h, Maßstabsbalken = 50 µm) . (b) Quantifizierung der relativen Fläche zwischen der BFP-Negativkontrolle oder αPcad synCAM und mCherry (Pcad) L929-Zellen im Verlauf der 24-Stunden-Assemblierung (n = 4 biologisch unabhängige Proben, Fehler = SEM). Ein größerer Flächenunterschied steht im Einklang mit einer kompakteren PCad-Kugel und dem Ausschluss von BFP+-Zellen. (c) Quantifizierung des relativen Abstands pro Zelle (BFP-mCherry) vom Mittelpunkt der Kugel nach dem Zusammenbau (t = 24 h, n = 4 biologisch unabhängige Proben, Linie = Mittelwert). WT-BFP-Zellen weisen einen größeren Abstandsunterschied auf, was mit ihrem Ausschluss aus der PCad-Sphäre übereinstimmt, während αPCAD-synCAMs interkalieren.

Quelldaten

Maximale Projektion von 20-fach konfokalen Mikroskopiebildern von αGFP und GFP synCAMs (mit ICAM-1 ICD) oder entsprechendem Tether (kein ICD), ausgedrückt in MSCs (a, Maßstabsbalken = 10 µm) primären dermalen Fibroblasten (b, Maßstabsbalken = 20 µm) oder iPSC-abgeleitete SMCs (c, Maßstabsbalken = 20 µm). αGFP-Zellen wurden auch mit mCherry markiert; GFP-Zellen wurden auch mit BFP markiert. Es werden repräsentative Bilder von drei unabhängigen Replikaten gezeigt. Bei beiden Zelltypen ist der GFP-Tether diffus in der Zelle verteilt. Im Gegensatz dazu weist das GFP-synCAM stark angereicherte atheterotypische Zell-Zell-Schnittstellen auf (weiße Pfeile). Wenn Zellen, die GFP-synCAMs exprimieren, ohne ihre Partnerzellen ausplattiert werden, wird das GFP diffus in der Zelle verteilt.

(a) Cartoon, der die Modulation der Sortierung von WT Ncad (grün) und WT Pcad (orange) durch Einführung von synCAMs zeigt. (b) Maximale Projektionen von 20-fach konfokalen Mikroskopiebildern von WT Pcad- und WT Ncad L929-Zellen mit Expression der angegebenen heterophilen synCAMs (Maßstabsbalken = 20 µm, t = 24 h). Das GFP-synCAM wird in der Ncad-exprimierenden L929-Zelle und αGFP-synCAM in der Pcad-exprimierenden L929-Zelle exprimiert. Es werden repräsentative Bilder von drei unabhängigen Replikaten gezeigt. Diese Daten zeigen, dass synCAMs die Integration zwischen unterschiedlich sortierenden Pcad- und Ncad-Zellen ebenso vorantreiben können wie zwischen Pcad- und Ecad-Zellen (Abb. 5a). (c) Quantifizierung der Rundheit (links) und der Gesamtoberfläche (rechts) von L929-Zellen aus maximalen Projektionen von 20x konfokalen Bildern in Abb. 5b (Daten werden als Mittelwerte von n = 18 eindeutigen Feldern dargestellt, die über zwei unabhängige Wells analysiert wurden, Fehler). = SD). (d) 3D-Ansichten (oben) und maximale Projektion (unten) von mehrzelligen Anordnungen zwischen einer intestinalen Epithelmonoschicht der Maus (grün) und embryonalen Fibroblastenzellen (MEFs) der Maus (orange) mit entweder einer GFP-αGFP-Bindung (links) oder synthetischem ICAM -1 (rechts) heterophile Adhäsionswechselwirkung. Es werden repräsentative Bilder von zwei unabhängigen Replikaten gezeigt.

Quelldaten

SynCAM-Zell-Zell-Schnittstellen. Kontaktwinkel- und GFP-Anreicherungsmessungen werden bereitgestellt. Fehler = 95 % KI.

Sequenzen von Proteinkonstrukten, die in dieser Studie verwendet werden. Der Epitop-Tag ist rot hervorgehoben, die ECD-Bindungsregion ist blau dargestellt und die TM-Region und ICD sind fett dargestellt.

SLiM-Domänen von CAM-ICDs, die in synCAMs verwendet werden. SLiMs wurden aus ELM-Datenbanken und Literaturquellen identifiziert.

Selbstorganisation von Zellen mit orthogonalen synCAM-Paaren. Alternative ECD mit ICAM-1 ICD werden gezeigt (verknüpft mit Abb. 4a).

Dreizelliges synCAM-Interaktionsnetzwerk. Dreizellige synCAM-Interaktionsnetzwerke steuern den Zellaufbau (verknüpft mit Abb. 4b).

SynCAM-Interkalation in native Baugruppen. Anti-PCAD synCAM (ICAM-1 ICD) steuert die Zellinterkalation in den PCAD-Cluster (verknüpft mit Abb. 4e).

Umgestaltung der Gewebeorganisation. SynCAMs können die Kopplung und komplexe Umgestaltung von Epithel- und Sphäroidgeweben vorantreiben (verknüpft mit Abb. 5b).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Stevens, AJ, Harris, AR, Gerdts, J. et al. Programmierung des mehrzelligen Aufbaus mit synthetischen Zelladhäsionsmolekülen. Natur 614, 144–152 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

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Eingegangen: 28. Oktober 2021

Angenommen: 02. Dezember 2022

Veröffentlicht: 12. Dezember 2022

Ausgabedatum: 02. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

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