Targeting von TBK1 zur Überwindung der Resistenz gegen Krebsimmuntherapie

Nature Band 615, Seiten 158–167 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Trotz des Erfolgs der PD-1-Blockade bei Melanomen und anderen Krebsarten fehlen wirksame Behandlungsstrategien zur Überwindung der Resistenz gegen Krebsimmuntherapie1,2. Hier identifizieren wir die angeborene Immunkinase TANK-bindende Kinase 1 (TBK1)3 als Kandidatengen für die Immunevasion in einem gepoolten genetischen Screening4. Mithilfe einer Reihe genetischer und pharmakologischer Werkzeuge in mehreren experimentellen Modellsystemen bestätigen wir die Rolle von TBK1 als Immunevasion-Gen. Das Targeting von TBK1 verstärkt die Reaktionen auf die PD-1-Blockade, indem es die Zytotoxizitätsschwelle für Effektorzytokine (TNF und IFNγ) senkt. Die TBK1-Hemmung in Kombination mit der PD-1-Blockade zeigte auch Wirksamkeit bei Verwendung von patienteneigenen Tumormodellen, mit übereinstimmenden Ergebnissen bei passenden patienteneigenen organotypischen Tumorsphäroiden und passenden patienteneigenen Organoiden. Tumorzellen, denen TBK1 fehlt, sind darauf vorbereitet, als Reaktion auf TNF und IFNγ in JAK-STAT-abhängiger Weise einen RIPK- und Caspase-abhängigen Zelltod zu erleiden. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass die gezielte Bekämpfung von TBK1 eine wirksame Strategie zur Überwindung von Resistenzen gegen Krebsimmuntherapie ist.

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Die in dieser Studie generierten und analysierten Datensätze sind im Artikel und seinen Zusatzinformationen enthalten. In-vivo-scRNA-seq-Daten wurden beim GEO unter den Zugangscodes GSE217160 (In-vivo-TBK1i-Studie) und GSE217274 (In-vivo-TBK1-CRISPR-Cas9-Studie) hinterlegt und sind auf Anfrage erhältlich. Beschreibungen der Analysen finden Sie in der Zusammenfassung „Methoden und Berichterstattung“.

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Diese Arbeit wurde von NIH K08CA226391 (zu RWJ), P01CA24023 (zu SIP), K99CA259511 (zu KP), T32CA207021 (zu JHC), 5R01AR072304 (zu DEF), 5P01CA163222 (zu DEF), 5R01AR043369 (zu DEF) und 5R unterstützt 01CA222871 ( zu DEF). Zusätzliche Unterstützung wurde durch den Melanoma Research Alliance Young Investigator Award (https://doi.org/10.48050/pc.gr.86371, an RWJ), ein Fakultätsforschungsstipendium der Karin Grunebaum Cancer Research Foundation (an RWJ) und Termeer Early Career bereitgestellt Stipendium für Systempharmakologie (an RWJ) und eine Schenkung von SB und JW Belkin. KP würdigt die Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Stand Up to Cancer Peggy Prescott Early Career Scientist Award PA-6146, Stand Up to Cancer Phillip A. Sharp Award SU2C-AACR-PS-32; DJ dankt der Susan Eid Tumor Heterogeneity Initiative; und DEF dankt der Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation für die finanzielle Unterstützung. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Sammlung, Analyse und Interpretation der Daten oder beim Verfassen des Manuskripts. Wir danken allen Mitgliedern der Manguso- und Jenkins-Labore bei MGH, HMS und dem Broad Institute. Grafiken in Abb. 2a und 5i wurden mit BioRender erstellt.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Robert T. Manguso, Russell W. Jenkins

Massachusetts General Hospital Cancer Center, Abteilung für Medizin, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Yi Sun, Or-yam Revach, Amina Fu, Xiang Ma, Jia Gwee, Fürst Sindurakar, Jun Tian, Arnav Mehta, Moshe Sade-Feldman, Thomas LaSalle, Hongyan Xie, Rodrigo Saad-Beretta, Kathleen B. Yates, Angelina M. Cicerchia, Martin Q. Rasmussen, Samuel J. Klempner, Dejan Juric, David M. Miller, Jonathan H. Chen, Karin Pelka, Dennie T. Frederick, Debattama R. Sen, Ryan B. Corcoran, Nir Hacohen, Keith T . Flaherty, Robert T. Manguso und Russell W. Jenkins

Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Seth Anderson, Emily A. Kessler, Clara H. Wolfe, Emily J. Robitschek, Thomas GR Davis, Sarah Kim, Payal Tiwari, Peter P. Du, Arnav Mehta, Alexis M. Schneider, Moshe Sade-Feldman, Kathleen B. Yates , Arvin Iracheta-Vellve, Jonathan H. Chen, Karin Pelka, Nir Hacohen, Genevieve M. Boland, Robert T. Manguso und Russell W. Jenkins

Labor für Systempharmakologie, Harvard Program in Therapeutic Sciences, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Anne Jenney, Caitlin E. Mills, Shuming Liu, Johan KE Spetz, Xingping Qin, Kristopher A. Sarosiek, Peter K. Sorger und Russell W. Jenkins

Abteilung für Medizinische Onkologie, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Arnav Mehta, Elena Ivanova, Amir R. Aref, Cloud P. Paweletz und David A. Barbie

Abteilung für Biotechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Alexis M. Schneider

Abteilung für Zellbiologie und Krebswissenschaft, Rappaport-Fakultät für Medizin, Institut für Technologie, Technion, Haifa, Israel

Keren Yizhak

Abteilung für chirurgische Onkologie, Abteilung für Chirurgie, Massachusetts General Hospital Cancer Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Tatyana Sharova, William A. Michaud, Sarah I. Pai und Genevieve M. Boland

Programm für molekulare und integrative physiologische Wissenschaften, Harvard School of Public Health, Boston, MA, USA

John KE Spetz, Xingping Qin und Christopher A. Sarosek

John B. Little Center for Radiation Sciences, Harvard School of Public Health, Boston, MA, USA

John KE Spetz, Xingping Qin und Christopher A. Sarosek

Programm für molekulare und zelluläre Onkogenese, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, USA

Gao Zhang

Preston Robert Tisch Brain Tumor Center, Abteilung für Neurochirurgie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

Gao Zhang

Preston Robert Tisch Brain Tumor Center, Abteilung für Pathologie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

Gao Zhang

Moores Cancer Center, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

Der junge Wook Kim

Zentrum für neuartige Therapeutika, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

Der junge Wook Kim

Medizinische Fakultät, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

Der junge Wook Kim

Forschungszentrum für Hautbiologie, Abteilung für Dermatologie, Massachusetts General Hospital und Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Mack Y. Su und David E. Fisher

Zentrum für Systembiologie, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA

Sara I. Pai

Abteilung für Dermatologie, Massachusetts General Hospital und Harvard Medical School, Boston, MA, USA

David M. Miller

Abteilung für Biostatistik, Abteilung für Datenwissenschaften, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Anita Giobbie-Hurder

Abteilung für Pathologie, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA

Jonathan H. Chen

Gilead Sciences, Foster City, CA, USA

Susanna Stinson

Belfer Center for Applied Cancer Science, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Elena Ivanova, Amir R. Aref, Cloud P. Paweletz und David A. Barbie

Xsphera Biosciences, Boston, MA, USA

Amir R. Aref

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Konzeption und experimentelles Design: YS, O.-yR, SA, CEM, PT, KBY, AI-V., RTM und RWJ Methodik und Datenerfassung: YS, O.-yR, SA, EAK, CHW, AJ, CEM, EJR, AF, XM, JG, PT, AMC, MQR, PS, JT, AM, HX, TS, SL, WAM, RS-B., JKES, , DMM, SS, EI, ARA, CPP, DRS und GMB Analyse und Interpretation von Daten: YS, O.-yR, SA, CEM, PT, TGRD, SK, PPD, JT, AM, AMS, KY, MS-F ., TL, JWK, KAS, AG-H., JHC, KP, DAB, DEF, RBC, NH, PKS, KTF, GMB, RTM und RWJ Manuskripterstellung und Überarbeitung: YS, O.-yR, SA, CEM, HX, DJ, DAB, RTM und RWJ

Korrespondenz mit Russell W. Jenkins.

RWJ ist Mitglied des Beirats von Xsphera Biosciences und hat eine finanzielle Beteiligung an Xsphera Biosciences, einem Unternehmen, das sich auf den Einsatz von Ex-vivo-Profiling-Technologie konzentriert, um funktionelle, präzise Immunonkologielösungen für Patienten, Anbieter und Arzneimittelentwicklungsunternehmen bereitzustellen. AM ist Berater für Third Rock Ventures, Asher Biotherapeutics und Abata Therapeutics; und hält Beteiligungen an Asher Biotherapeutics und Abata Therapeutics. SIP hat Beratungszahlungen von Abbvie, Astrazeneca/MedImmune, Cue Biopharma, Fusion Pharmaceuticals, MSD/Merck, Newlink Genetics, Oncolys Biopharma, Replimmune, Scopus Biopharma und Sensei Biopharma erhalten; Sie erhielt Zuschüsse/Forschungsunterstützung von Abbvie, Astrazeneca/MedImmune, Cue Biopharma, Merck und Tesaro. SJK war als Berater für Eli Lilly, Merck, BMS, Astellas, Daiichi-Sankyo, Pieris und Natera tätig. und besitzt Aktien von Turning Point Therapeutics. DJ erhielt Beratungshonorare von Novartis, Genentech, Syros, Eisai, Vibliome, Mapkure und Relay Therapeutics; führte Auftragsforschung mit Novartis, Genentech, Syros, Pfizer, Eisai, Takeda, Pfizer, Ribon Therapeutics, Infinity, InventisBio und Arvinas durch; und besitzt Beteiligungen an Relay Therapeutics und PIC Therapeutics. DMM erhielt Honorare für die Mitarbeit in Beiräten von Checkpoint Therapeutics, EMD Serono, Castle Biosciences, Pfizer, Merck, Regeneron und Sanofi Genzyme; und besitzt Aktien von Checkpoint Therapeutics. DEF ist finanziell an Soltego beteiligt, einem Unternehmen, das salzinduzierbare Kinaseinhibitoren für topische Hautverdunkelungsbehandlungen entwickelt, die für eine breite Palette menschlicher Anwendungen eingesetzt werden könnten. RTM berät Bristol Myers Squibb. MS-F. erhält Forschungsgelder von Bristol-Meyers Squib.

Nature dankt Robert Bradley, Toshiro Sato und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Relative Depletion/Anreicherung von Ikbke-sgRNAs aus einem Pool von sgRNAs, die auf 2.368 Gene abzielen, die von Cas9-exprimierenden B16-Melanomzellen exprimiert werden (n = 4 unabhängige Guides, die auf jedes Gen abzielen; die Falscherkennungsrate (FDR) wurde mit dem STARS-Algorithmus v1.3 berechnet , wie zuvor beschrieben6,7). b-, TBK1- und β-Actin-Proteinspiegel in Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Zellen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. c, Proliferation von Tbk1-Null- und Kontroll-B16-Tumorzellen nach 1–4 Tagen In-vitro-Kultur (n = 9 pro Bedingung aus drei unabhängigen Experimenten). d, Tumorvolumen der Kontrolle (grau), Tbk1-null (hellrot) B16-Tumoren in NSG-Mäusen (n = 5 Mäuse pro Gruppe). Die mittleren Tumorvolumina (ausgefüllte Kreise) sind +/– Standardabweichung (schattierter Bereich) dargestellt. 2-Wege-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. e, Spinnendiagramme für die Tumorvolumenanalyse für Kontroll-sgRNA-1 (schwarz), sgRNA-2 (grau), Tbk1 sgRNA-1 (rosa) und Tbk1 sgRNA-2 (rot) B16-Tumoren in mit Anti-PD-1 behandelten Tumoren Wildtyp-C57BL/6-Mäuse (siehe Abb. 1c). fg, Spinnendiagramme für die Tumorvolumenanalyse (f) und das Überleben (g) für Kontroll- (schwarz), Anti-PD-1- (grau), TBK1i- (rosa) und Anti-PD-1+TBK1i- (rot) B16-Tumoren in C57BL/6-Mäuse (siehe Abb. 1d). Für die Überlebensanalyse (g) wurde ein paarweiser Test unter Verwendung des Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) für das Überleben (g) durchgeführt. n = 10 Mäuse pro Behandlungsgruppe, ***P < 0,001; ns, nicht signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe. h, Körpergewicht von Mäusen mit B16-Ova-Tumoren am Tag 14 der angegebenen Behandlung. Dargestellt sind Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) (n = 10 Mäuse pro Gruppe, 1-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest; ns, nicht signifikant). i, Bewertung der Lebensfähigkeit von CT26 MDOTS mit den angegebenen Behandlungen. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) werden angezeigt (n = 3, biologische Replikate, einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; * *** P < 0,0001). j–k, Tumorvolumenanalysen von Mäusen mit MC38- (j) und MB49-Tumoren (k), die mit TBK1i, Anti-PD-L1 oder einer Kombination behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrolle (IgG + Vehikel); n = 10 Mäuse pro Behandlungsgruppe. Die mittleren Tumorvolumina (ausgefüllte Kreise) sind +/– Standardabweichung (schattierter Bereich) dargestellt. 2-Wege-ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001; im Vergleich zur Kontrollgruppe.

a, Tumortyp, Gewebequelle (Ort), klinische Reaktionsdaten, PDOTS-Reaktionsdaten und zugehöriges Tumormutationsprofil für Proben, die für die PDOTS-Profilierung verwendet werden (Proben geordnet nach Ex-vivo-PDOTS-Reaktion auf kombiniertes Anti-PD-1+TBK1i). PDOTS-Reaktionsparameter sind wie folgt definiert: Responder (Reduktion >30 % im Vergleich zur Kontrolle), teilweiser Responder (<30 % Reduktion und <20 % Wachstum im Vergleich zur Kontrolle) und Non-Responder (>20 % Wachstum im Vergleich zur Kontrolle). Der rote Rand um das graue Rechteck weist auf das Vorhandensein einer Veränderung im angegebenen Gen hin. b, Wirkung des monoklonalen IgG4-Kontroll-Ab auf die Lebensfähigkeit von PDOTS bei einem Patienten mit Melanom. Dargestellt sind Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) (n = 3, biologische Replikate, zweiseitiger ungepaarter t-Test).

a–b, tSNE-Diagramm von 11 Clustern von CD45+-Zellen (a) von Patienten mit metastasiertem Melanom, die auf eine Immun-Checkpoint-Blockade ansprechen (R) oder nicht ansprechen (NR) (Ref. Sade-Feldman et al. 2018), und t- SNE-Diagramme RNA-sequenzierter Einzelzellen mit Färbung von CD3E (T-Zellen), CD14 (myeloische Zellen) und CD19 (B-Zellen) TBK1- und IKBKE-Expression (b). c–d, breite Clusteranteile (c) und prozentuale Zellen pro Cluster in den angegebenen Behandlungsgruppen (d). e–f-, UMAP- (c) und Dichtediagramme (d) reclusterierter lymphoider (T/NK) Zellen. g, Clusteranteile lymphoider (T/NK) Zellen. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (Kreise) werden +/− Sem (Fehlerbalken) angezeigt. Mehrfacher ungepaarter t-Test, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant. h, Prozentsatz aktivierter (CD69+CD25+) Maus-CD8+-Splenozyten, vorbehandelt mit TBK1i (1 μM) oder DMSO (0,1 %) mit/ohne Restimulation; n = 3 biologisch unabhängige Proben, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest; *P < 0,05; ***P < 0,001. i–k, intrazelluläre Zytokinfärbung für TNF (i), IL-2 (j) und IFNγ (k) von CD3+CD8+-Splenozyten der Maus, vorbehandelt mit TBK1i (1 μM) oder DMSO (0,1 %) mit/ohne Restimulation mit Daten als % CD69+CD25+-Zellen und MFI); n = 3 biologisch unabhängige Proben, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest; **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant.

a, Durchflusszytometrie von Immunpopulationen aus Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Tumoren, die mit Anti-PD-1 behandelt wurden (n = 4 pro Gruppe). Dargestellt sind Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) (n = 4 biologisch unabhängige Proben, zweiseitiger ungepaarter t-Test). bc-, UMAP- (b) und Dichte- (c) Diagramme von 31.810 RNA-sequenzierten Einzelzellen aus Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Tumoren nach Anti-PD-1-Behandlung (DC, dendritische Zellen; Tregs, regulatorische T-Zellen; MDSC, myeloid- abgeleitete Suppressorzelle; NK, natürliche Killerzellen; M1-, M1-Makrophagen; M2-, M2-Makrophagen). d, Prozentsatz der Zellen in jedem abstammungsdefinierten Cluster. Dargestellt sind Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) (n = 4 biologisch unabhängige Proben, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest; P-Werte für M1-Makrophagen und CD8-T-Zellen, die keine statistische Signifikanz erreichten). e, UMAP-Diagramm von RNA-sequenzierten Einzelzellen mit Färbung der Tbk1- und Ikbke-Expression mit den Zelltypen, auf die verwiesen wird (b). f, Blasendiagramm, das die Tbk1- und Ikbke-Expression über UMAP-definierte Zellcluster anzeigt.

a, UMAP-Diagramm von RNA-sequenzierten Einzelzellen mit Färbung der Ifng- und Tnf-Expression mit den angegebenen Zelltypen (rechts). b, logarithmische Änderung der Expression von Ifng (hellrot) und Tnf (hellblau) über abstammungsdefinierte Zellcluster (Tbk1-null/Kontrolle).

a, Vulkandiagramm, das die relative Abreicherung/Anreicherung von sgRNA-Genen darstellt. Die fünf am häufigsten abgereicherten sgRNAs sind angegeben. b, Streudiagramm der Gen-Essentialität aus dem In-vitro-CRISPR-Screen (Kontrolle und Tbk1-Null-B16-Zellen). c, TBK1-Expression und Zelllebensfähigkeit (Kontrolle vs. TNF/IFNγ;) für Einzelzellklone, die aus polyklonaler Kontrolle und Tbk1-Null-B16-Zellen stammen. Western Blot ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) werden angezeigt (n = 6 über zwei unabhängige Experimente, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant). d, TBK1-Indel-Spektrum von Kontroll-sgRNA- und Tbk1-sgRNA-B16-Einzelzellklonen. e, Bewertung der Lebensfähigkeit (Zelltiter Glo) von B16-Ova-Zellen in Standard-2D-Kultur nach 24-stündiger Behandlung mit TNF (160 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) im Vergleich zu unstimulierten Zellen (n = 6, 2). unabhängige Experimente, 1-Wege-ANOVA, Holm-Sidaks Mehrfachvergleichstest). f, Bewertung der Lebensfähigkeit (Hoechst/Propidiumiodid) von B16-Tumorsphäroiden (ohne Immunzellen) in 3D-Mikrofluidikkultur nach 96-stündiger Behandlung mit TNF (10 ng ml−1) + IFNγ (10 ng ml−1) im Vergleich zu unstimulierten Zellen ( n = 6, 2 unabhängige Experimente, 1-fach ANOVA, Holm-Sidaks Mehrfachvergleichstest). g, Bewertung der Zelllebensfähigkeit von B16-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit TNF (200 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) im Vergleich zu unstimulierten Zellen, die mit steigenden Konzentrationen von MRT67307 behandelt wurden (n = 9, 3 unabhängige Experimente 2- Weg-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). h, Bewertung der Zelllebensfähigkeit von B16-Zellen in Standard-2D-Kultur nach 24-stündiger Behandlung mit TNF (200 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) im Vergleich zu unstimulierten Zellen, die mit steigenden Konzentrationen von GSK8612 behandelt wurden (n = 3, 1). unabhängiges Experiment, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). i, Zelllebensfähigkeitsbewertung von B16-Zellen in Standard-2D-Kultur nach 24-stündiger Behandlung mit TNF (200 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) mit steigenden Konzentrationen von TBK1 PROTAC 3i (n = 6, 2 unabhängige Experimente 2 -Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant.

a, GR-Werte für die 9-Punkte-Inhibitor-Titration von TBK1i in parentalen, Kontroll-sgRNA- (polyklonalen und monoklonalen) und Tbk1-sgRNA- (polyklonalen und monoklonalen) B16-Zellen (2 unabhängige Experimente; repräsentative Daten aus einem einzelnen Experiment mit 6 technischen Replikaten pro Bedingung) . Mittelwerte (ausgefüllte Kreise) werden +/− sem (Fehlerbalken) angezeigt. b–c, Bewertung der TBK1i-Potenz (b; halbmaximaler Effekt, GEC50) und der Gesamtwirksamkeit (c; Fläche über der GR-Kurve, GRAOC) d–e, Heatmap der GR-Werte für Eltern (d) und BRAF/MEK-Inhibitor resistente (e) menschliche A375-Melanomzellen, behandelt mit steigenden Konzentrationen von TNF und IFNγ für 24, 24 und 72 Stunden mit 0, 0,25 und 1,0 μM TBK1i (n = 3).

a–b, Bewertung der Zelllebensfähigkeit (Zelltiter Glo) in Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Zellen, vorbehandelt mit RIPK1-Inhibitor (Nec-1s, 10 μM) und dem Pan-Caspase-Inhibitor Q-VD-OPh (10 μM) + /− TNF/IFNγ (n=3, 1 unabhängiges Experiment: 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). b, Bewertung der Zelllebensfähigkeit (Zelltiter Glo) in Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Zellen, vorbehandelt mit RIPK1-Inhibitor (Nec-1s, 10 μM) und dem Pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk (20 μM) +/– TNF/IFNγ (n = 3–6, 1–2 unabhängige Experimente: 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). c, Bewertung der Zelllebensfähigkeit in Tbk1-Null-B16-Zellen, vorbehandelt mit RIPK1-Inhibitor (Nec-1s, 10 μM) und dem Caspase-8-Inhibitor z-IETD-fmk (2,5 μM) +/– TNF/IFNγ (n = 6, 2 unabhängige Experimente; 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). d, Bewertung der Zelllebensfähigkeit in Tbk1-Null-B16-Zellen, vorbehandelt mit RIPK3-Inhibitor (HS-1371, 2 μM) und dem Pan-Caspase-Inhibitor Q-VD-OPh (20 μM) +/– TNF/IFNγ (n = 6). , 2 unabhängige Experimente: 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). e, Bewertung der Zelllebensfähigkeit in Tbk1-Null-B16-Zellen, vorbehandelt mit MLKL-Inhibitor (GW806742X, 5 μM) und dem Pan-Caspase-Inhibitor Q-VD-OPh (20 μM) +/– TNF/IFNγ (n = 6, 2). unabhängige Experimente: 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). fh, Klonogener Assay von B16-Zellen, behandelt mit TNF (10 ng ml−1), IFNγ (10 ng ml−1) oder TNF + IFNγ mit Kontrolle (0,1 % DMSO), Q-VD-OPh (20 μM) mit/ ohne den RIPK1-Inhibitor Nec-1s (10 μM, f), den RIPK3-Inhibitor HS-1371 (2 μM, g) und den MLKL-Inhibitor GW806742X (2 μM, h) (dargestellt sind repräsentative Bilder; n = 3). i, normalisierte Expression ausgewählter Gene in B16-Zellen, die mit TNF (10 ng ml−1), IFNγ (100 ng ml−1) oder beidem behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen (Quellendaten für Bulk-RNA-Seq – Manguso et al. 2017). j, normalisierte Expression von Mlkl und Ripk3 in Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Zellen mit/ohne TNF/IFNγ-Behandlung (18 h), bestimmt durch qRT-PCR (n = 3; 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant. k, Western-Blot der angegebenen Proteine in Tbk1-Null-B16-Zelllysaten nach 2-stündiger Vorbehandlung mit Vehikelkontrolle (0,1 % DMSO), Q-VD-OPh (20 μM), Nec-1s (10 μM) oder Q -VD-OPh plus Nec-1s oder Q-VD-OPh plus Birinapant (1 μM), gefolgt von einer 10-stündigen Behandlung mit TNF (160 ng ml–1) und IFNγ (40 ng ml–1) oder unstimulierter (PBS) Kontrolle . Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

a, Heatmap der prozentualen Freisetzung von Cytochrom C (Cyt C) für die In-vitro-BH3-Profilierung von unstimulierten Kontrollzellen (sg1 und sg2) und Tbk1-null (sg1 und sg2) B16-Zellen. Mittelwerte dargestellt; n=3 biologisch unabhängige Proben; 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest. b, Heatmap der %-Cytochrom-C-(Cyt-C)-Freisetzung für die In-vitro-BH3-Profilierung von Kontroll-sgRNA- und Tbk1-sgRNA-B16-Zellen. Mittelwerte dargestellt; n = 3 biologisch unabhängige Proben; 2-Wege-ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest. Zu keinem Zeitpunkt wurden statistisch signifikante Unterschiede zwischen Kontroll-sgRNA- und Tbk1-sgRNA-B16-Zellen beobachtet. c, Bewertung der Lebensfähigkeit (Zelltiter Glo) von B16-Zellen in Standard-2D-Kultur nach 24-stündiger Behandlung mit den angegebenen Konzentrationen von Staurosporin (STS) in Kontroll- und Tbk1-Null-B16-Zellen. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) werden angezeigt (n = 6, 2 unabhängige Experimente, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). d, Lebensfähigkeitsbewertung (Hoechst/Propidiumiodid) von B16-Tumorsphäroiden (ohne Immunzellen) in 3D-Mikrofluidikkultur nach 48-stündiger Behandlung. Die angegebenen Konzentrationen von Staurosporin (STS) im Vergleich zu unstimulierten Zellen sind Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise). gezeigt (n = 6, 2 unabhängige Experimente, 1-Wege-ANOVA, Holm-Sidaks Mehrfachvergleichstest). e, Western Blot für STING, IRF3, TBK1 und β-Actin in B16-Zellen mit einzelnen CRISPR-Zelllinien mit Single-Guide-RNAs, die auf Tmem173, Irf3 und Tbk1 abzielen, im Vergleich zur Kontroll-sgRNA. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. f, Western Blot für STING, IRF3, TBK1 und β-Actin in doppelten CRISPR B16-Zellen mit angegebenen sgRNA-Paaren. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. g, Bewertung der Lebensfähigkeit (Zelltiter Glo) der angegebenen sgRNA-B16-Zellen nach 48-stündiger Behandlung mit TNF (160 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) im Vergleich zu unstimulierten Zellen. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) werden angezeigt (n = 4 biologische Replikate, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant). h, PDOTS-Lebensfähigkeitsbewertung von Patienten (n = 2) mit kutanem Melanom mit indizierten Behandlungen. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) werden angezeigt (n = 6 biologische Replikate, 2 unabhängige Proben; einfache ANOVA mit Dunns Mehrfachvergleichstest, **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant). i, Heatmap der sekretierten Zytokinprofile (L2FC) konditionierter Medien von PDOTS als Reaktion auf angegebene Behandlungen (n = 2). Mittelwerte angezeigt. **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant.

a, Häufigkeitshistogramme der Anreicherung (Z-Score) für alle sgRNAs pro Ziel in Tbk1-Null-B16-Zellen +/– In-vitro-Stimulation mit TNF (10 ng ml−1) und IFNγ (10 ng ml−1). b, Streudiagramm, das die relative Depletion von sgRNAs zeigt, die auf 19.674 Gene in einer Cas9+ B16-Kontrolle und einer Tbk1-sgRNA-Zelllinie +/– In-vitro-Stimulation mit TNF (10 ng ml−1) und IFNγ (10 ng ml−1) abzielen. c, Western Blot von Kontroll-sgRNA und Tbk1-Null-B16-Zellen, behandelt mit TNF (160 ng ml–1) und IFNγ (40 ng ml–1) für die angegebenen Zeiten. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. d, Bewertung der Zelllebensfähigkeit in parentalen B16-Zellen, die 48 Stunden lang mit TBK1i (1 μM) +/– JAK 1/2-Inhibitor (Ruxolitinib, 0,5 μM) +/– TNF/IFNγ vorbehandelt wurden, im Vergleich zu unstimulierten Kontrollen. Mittelwerte (Balken) und Einzelwerte (offene Kreise) werden angezeigt (n=3, 1 unabhängiges Experiment; 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest; *P < 0,05; ***P < 0,001; **** P < 0,0001; ns, nicht signifikant). e, Western Blot der angegebenen Proteine in Tbk1-Null-B16-Zelllysaten nach 2-stündiger Vorbehandlung mit Vehikelkontrolle (0,1 % DMSO), Ruxolitinib (1 μM), Q-VD-OPh (20 μM), Nec-1s ( 10 μM) oder Q-VD-OPh plus Nec-1s, gefolgt von einer 10-stündigen Behandlung mit TNF (160 ng ml–1) und IFNγ (40 ng ml–1) oder unstimulierter (PBS) Kontrolle. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. f, GR-Werte für die 9-Punkte-Inhibitor-Titration von Ruxolitinib (JAK1/2i) in Eltern-, Kontroll-sgRNA- (monoklonal) und Tbk1-sgRNA-(monoklonalen) B16-Zellen (2 unabhängige Experimente; repräsentative Daten aus einem einzelnen Experiment mit 6 technischen Replikaten pro Bedingung). ). Mittelwerte (ausgefüllte Kreise) werden +/− sem (Fehlerbalken) angezeigt.

Ergänzende Abbildungen. 1–13. Genexpressionsmatrizen für scRNA-seq, Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie und unbeschnittene Bilder für Western-Blot-Analysen.

Klinisch-pathologische PDOTS-Daten.

sgRNA-Depletions- und -Anreicherungsdaten für In-vitro-CRISPR-Screens in B16-Zellen.

Unterstützende Daten für die Hauptfiguren.

Unterstützende Daten für die erweiterten Datenzahlen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sun, Y., Revach, Oy., Anderson, S. et al. Targeting von TBK1 zur Überwindung der Resistenz gegen Krebsimmuntherapie. Natur 615, 158–167 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05704-6

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Eingegangen: 16. Juli 2021

Angenommen: 04. Januar 2023

Veröffentlicht: 12. Januar 2023

Ausgabedatum: 02. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05704-6

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Targeting von TBK1 zur Überwindung der Resistenz gegen Krebsimmuntherapie