TREM2hi-residente Makrophagen schützen das septische Herz, indem sie die Homöostase der Kardiomyozyten aufrechterhalten

Nature Metabolism Band 5, Seiten 129–146 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Sepsis-induzierte Kardiomyopathie (SICM) tritt häufig bei septischen Patienten mit hoher Mortalität auf und ist durch eine abnormale Immunantwort gekennzeichnet. Aufgrund der zellulären Heterogenität war es schwierig, die Rolle von Immunzelluntergruppen bei SICM zu verstehen. Hier identifizieren wir eine einzigartige Subpopulation herzresidenter Makrophagen mit der Bezeichnung CD163+RETNLA+ (Mac1), die sich während einer Sepsis selbst erneuert und zur Vorbeugung von SICM eingesetzt werden kann. Durch die Kombination von Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Schicksalskartierung in einem Sepsis-Mausmodell zeigen wir, dass die Mac1-Subpopulation deutliche transkriptomische Signaturen aufweist, die durch Endozytose angereichert sind, und eine hohe Expression von TREM2 (TREM2hi) aufweist. TREM2hi-Mac1-Zellen reinigen aktiv von Kardiomyozyten ausgestoßene dysfunktionale Mitochondrien. Ein Trem2-Mangel in Makrophagen beeinträchtigt die Selbsterneuerungsfähigkeit der Mac1-Subpopulation und führt folglich zu einer fehlerhaften Eliminierung beschädigter Mitochondrien, einer übermäßigen Entzündungsreaktion im Herzgewebe, einer verschlimmerten Herzfunktionsstörung und einer verringerten Überlebensrate. Insbesondere verhindert die intraperikardiale Verabreichung von TREM2hi-Mac1-Zellen SICM. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Modulation von TREM2hi-Mac1-Zellen als therapeutische Strategie für SICM dienen könnte.

Sepsis betrifft etwa 49 Millionen Menschen und verursacht jährlich weltweit über 11 Millionen Todesfälle1,2. Die Mehrzahl der Patienten mit Sepsis weist eine abweichende Herzfunktion auf, die üblicherweise als SICM3 bezeichnet wird. Als wichtiger Faktor für Organdysfunktionen zeichnet sich SICM durch eine verringerte Ejektionsfraktion (EF) aus und ist mit einer hohen Mortalität bei Patienten verbunden. Bemerkenswert ist, dass bei SICM auch eine vorübergehend reversible Myokarddysfunktion beobachtet wird, was darauf hindeutet, dass die Herzhomöostase nach septischem Stress wiederhergestellt werden kann4,5,6; Allerdings sind die Mechanismen, die die Herzrehabilitation während einer Sepsis erleichtern, noch nicht vollständig geklärt.

Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Gewebehomöostase nach einer Herzverletzung7. Im Herzgewebe sind Makrophagen dominante Immunzellen, die sehr heterogen und in ihrer Abstammung diversifiziert sind8,9,10. Im letzten Jahrzehnt galten aus dem Knochenmark stammende (zirkulierende) Makrophagen als die einzigen primären Phagozyten, die beispielsweise an der Heilung und Homöostase des Herzgewebes beteiligt sind11; Neue Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass kardiale Makrophagen (CRMs) eine grundlegende Rolle bei der Beseitigung nekrotischer Zellen und Trümmer, der Förderung der Angiogenese, der Einschränkung von Entzündungen und der Gewebeumgestaltung während des Herzverletzungsprozesses spielen, die unabhängig von zirkulierenden Makrophagen sind10,12, 13. Kürzlich zeigte eine Studie, dass CRMs die zerfallenden Mitochondrien, die von Kardiomyozyten ausgestoßen werden, entfernen, um die Herzgesundheit aufrechtzuerhalten14.

Ein septisches Herz hat unter Stress einen hohen Energiebedarf, einschließlich erhöhter Körpertemperatur, Hypoxie, Tachykardie und systemischem Zytokinsturm. Im Einklang mit dieser pathologischen Veränderung wurde in vielen Tierstudien eine kardiale mitochondriale Dysfunktion nachgewiesen15,16. Klinisch korreliert eine mitochondriale Dysfunktion direkt mit schlechten Sepsis-Ergebnissen17,18. Daher ist die Aufrechterhaltung der kardialen mitochondrialen Homöostase für die Wiederherstellung von SICM von entscheidender Bedeutung. Allerdings bleibt völlig unbekannt, wie Immunzellen als Manipulator der mitochondrialen Qualitätskontrolle im septischen Herzen dienen.

In der vorliegenden Studie haben wir durch die Kombination von Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) mit Schicksalskartierungstechniken ein Profil der dynamischen Veränderungen von Herzimmunzellen, insbesondere Herzmakrophagen, im septischen Herzen der Maus erstellt. Wir identifizierten eine CD163+RETNLA+ Mac1-Subpopulation mit Selbsterneuerungsfähigkeit, die für die Unterstützung der Herzfunktion unter septischem Stress von entscheidender Bedeutung ist. Eine eingehende phänotypische und funktionelle Analyse ergab, dass die Mac1-Subpopulation durch endozytische transkriptomische Signaturen und eine hohe TREM2-Expression gekennzeichnet war. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die TREM2hi-Makrophagen-Subpopulation aktiv von Kardiomyozyten ausgestoßene Mitochondrien abfängt und daher die Herzhomöostase bei Sepsis fördert. Die Trem2-Ablation in Makrophagen beeinträchtigte die Fähigkeit der Mac1-Zellen zur Selbsterneuerung, was zur Ansammlung dysfunktionaler Mitochondrien im extrazellulären Raum des Myokards und zu einer Verschlechterung der Herzfunktion nach einer Sepsis führte. Schließlich verbesserte die intraperikardiale Verabreichung von TREM2hi-Mac1-Zellen die Herzfunktion und verhinderte SICM. Diese Ergebnisse bieten eine Perspektive für die Entwicklung TREM2-gerichteter Immuntherapien von SICM.

Um die Mechanismen einer reversiblen Myokarddysfunktion bei septischem Stress zu untersuchen, haben wir das septische Mausmodell (Caecal Ligation and Puncture (CLP)-Modell) etabliert und das septische Herz mittels Echokardiographie und Biomarkern für Herzverletzungen profiliert. Wie erwartet verschlechterte sich die Herzfunktion mit fortschreitender Sepsis stetig und verschlechterte sich 3 Tage nach CLP deutlich. Anschließend erholte sich die Herzfunktion allmählich (Extended Data Abb. 1a–d). Übereinstimmend zeigten auch die Herzverletzungsparameter (Laktatdehydrogenase (LDH), Troponin I, Anp und Bnp) vergleichbare dynamische Veränderungen (Extended Data Abb. 1e – h). Aufgrund der entscheidenden Rolle der Entzündung in der Pathologie von SICM wurden kardiale Entzündungsmarker mit einem Multiplex-Protein-Array gemessen. Die Konzentrationen von Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Interleukin (IL)-4, IL-1α, IL-9, Interferon (IFN)-γ, IL-1β, IL-21 und IL-10 im Herzen erreichte 3 Tage nach CLP einen Höhepunkt und nahm dann im Laufe der Zeit langsam ab (Extended Data Abb. 1i). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die dynamischen Veränderungen der Herzfunktion während des Fortschreitens der Sepsis mit der entzündlichen Umgebung des Herzgewebes übereinstimmen.

Als nächstes charakterisierten wir die Typen und Zustände der an SICM beteiligten Immunzellen mithilfe von scRNA-seq. Stoffwechselaktive, kernhaltige CD45+-Zellen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) von 14 Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten abgetrennt. Insgesamt wurden 29.537 qualitätskontrollpositive Zellen für die weitere Analyse ausgewählt, die im Durchschnitt etwa 9.362 kartierte Lesevorgänge und 2.718 Gene pro Zelle generierten (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 2a). Wie erwartet ergab die unvoreingenommene Clusteranalyse mehrere Cluster von Herzimmunzellen (Abb. 1b), darunter Makrophagen (Adgre1 und Fcgrt), Monozyten (Plac8 und Chil3), Neutrophile (S100a8/a9) und natürliche Killerzellen (NK)/T-Zellen (Cd3e, Klrk1 und Il7r), B-Zellen (Igkc und Cd79a) und zyklische Zellen (Mki67 und Stmn1) (Abb. 1c, d und erweiterte Daten Abb. 2b, c). Unter ihnen waren Makrophagen die am häufigsten vorkommenden Zellen mit einer Vielzahl von Unterclustern im Herzen. Durch den Vergleich der Veränderungen der Immunzellen zu jedem Zeitpunkt stellten wir fest, dass der Prozentsatz der Makrophagen leicht abnahm, wohingegen die Heterogenität der Makrophagen-Subcluster nach CLP deutlicher war. In der Zwischenzeit wurden nach einer Sepsis große Mengen an Neutrophilen und Monozyten in das Myokard rekrutiert (Abb. 1e, f). Zusätzlich zu den Erkenntnissen aus scRNA-seq bestätigte die Durchflusszytometrieanalyse die parallelen Veränderungen in kardialen Immunzellen während des Fortschreitens der Sepsis (Extended Data Abb. 2d, e).

a, Schematische Darstellung, die die scRNA-seq-Pipeline muriner Herzimmunzellen während des Fortschreitens der Sepsis zeigt. SS, stationärer Zustand. b: UMAP-Diagramme (Uniform Manifold Approximation and Projection) von 29.537 kardialen Immunzellen, die in 15 Clustern aus den Herzen von 14 WT-Mäusen bei SS, 3, 7 und 21 Tage nach CLP verteilt wurden. Herzzellen von 3–4 Mäusen wurden als eine Probe gemischt. c, UMAP-Diagramme von Herzimmunzellen, gefärbt nach Zelltyp. d, Wärmekarte mit ausgewählten Cluster-Marker-Genen (oben, farblich nach Cluster und Zustand kodiert) mit beschrifteten Beispielgenen und Zelltyp-Anmerkungen. e, UMAP-Diagramme von Herzimmunzellen von WT-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten der Sepsis, kommentiert nach Zelltyp wie in c. Zu jedem Zeitpunkt tragen entweder drei (SS oder 21 Tage) oder vier Mäuse (3 oder 7 Tage) bei. f, Balkendiagramme, die die Verteilung der Immunzelltypen von WT-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten der Sepsis zeigen (Extended Data Abb. 1 und 2).

Quelldaten

Da das Monozyten-Makrophagen-Kompartiment die größte und am stärksten veränderte Population kardialer Immunzellen während einer Sepsis darstellt, führten wir eine unbeaufsichtigte Clusteranalyse durch, um die Heterogenität und Rolle kardialer Monozyten-Makrophagen zu untersuchen. Es wurden fünf Makrophagen-Subcluster (Mac1–5), zwei Monozyten-Subcluster (Mon1 und Mon2) und ein Subcluster dendritischer Zellen (DC) identifiziert (Abb. 2a). Mac1 war durch die Expression von Retnla, Lyve1, Cd163 und Folr2 gekennzeichnet, die den Signaturen von Makrophagen im Herzgewebe ähnelten19. Mac2 exprimierte relativ hohe Mengen an Antigen-Präsentationsgenen, deren Eigenschaften mit dem zuvor berichteten Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-II-Cluster übereinstimmten19,20. Mac3 war mit Cxcl13, Ccl8, Saa3 und einigen IFN-stimulierten Genen (Ifit3 und Irf7) angereichert. Dieser Cluster könnte entzündungsfördernd sein und IFN-induzierbare Zellen enthalten21. Mac4 wurde durch die Expression von Cd72 und Acp5 identifiziert, die als Marker für pathologisch proinflammatorische Zellen bestätigt wurden22. Mac5 entsprach CCR2+-Makrophagen12,19,23, die auch hohe Mengen an Antigenpräsentationsgenen (H2-Aa und H2-Eb1) exprimierten. Mon1 war der klassische Monozytencluster mit hoher Ly6c2-Expression, während Mon2 der nichtklassische Monozytencluster mit geringer Ly6c2-Expression war (Lit. 24, 25). Der DC-Cluster war durch hohe Mengen an Xcr1, Naaa und Irf8 gekennzeichnet, die als Marker für klassische DCs26 gemeldet wurden (Abb. 2b und erweiterte Daten Abb. 3a). Als nächstes verglichen wir die dynamischen Unterschiede in den relativen Anteilen der acht Subcluster in verschiedenen Stadien des SICM. Bemerkenswert ist, dass die Mac1- und Mac2-Subcluster vorwiegend im Steady-State im Herzen vorhanden waren, wohingegen die Spiegel der Mac1-Subgruppe 3 Tage nach CLP drastisch reduziert waren. Die Werte von Mac3 und Mac4 stiegen 3 Tage nach CLP deutlich an; Als sich die Herzfunktion jedoch 7 und 21 Tage nach CLP allmählich erholte, wurde der Mac1-Subcluster wiederhergestellt (Abb. 2c, d). Wir verwendeten auch Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz, um die scRNA-seq-Ergebnisse zu bestätigen, indem wir CD163 und RETNLA als Marker für Mac1 auswählten. Konsistent verringerten sich die relative Häufigkeit und die absolute Anzahl von Mac1 3 Tage nach CLP und wurden 7 und 21 Tage nach CLP wiederhergestellt (Abb. 2e, f und erweiterte Daten Abb. 3b – d). Anschließend ergab die Korrelationsanalyse, dass die absoluten Zahlen von Mac1 positiv mit der EF des Herzens und negativ mit den Serum-Herz-Troponin-I-Spiegeln (cTnI) während des Fortschreitens der Sepsis korrelierten (Abb. 2g, h). Zusammengenommen zeigen diese Daten einen ausgeprägten CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+Mac1-Subcluster, der mit der Wiederherstellung der Herzfunktionsstörung nach septischem Stress verbunden ist.

a, UMAP-Diagramme von 24.058 Monozyten-Makrophagen, die den acht Clustern aus Abb. 1c zugeordnet sind. b, Heatmap mit den Top-20-Cluster-Marker-Genen (oben, farblich nach Cluster und Zustand codiert) mit beschrifteten Beispielgenen und Cluster-Anmerkungen. c, UMAP-Diagramme des Monozyten-Makrophagen-Kompartiments von WT-Mäusen bei SS, 3, 7 und 21 Tage nach CLP, kommentiert nach Cluster wie in a. d, Balkendiagramme, die die Clusterverteilung innerhalb des Monozyten-Makrophagen-Kompartiments von WT-Mäusen nach CLP zeigen. e, Repräsentative Konturdiagramme, die eine durchflusszytometrische Analyse kardialer CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen von WT-Mäusen nach CLP zeigen. f, Quantifizierung von CD163+RETNLA+-Makrophagen pro mg Herzgewebe. Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung. Zweiseitige P-Werte wurden durch einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest ermittelt. g,h, Korrelation der kardialen CD163+RETNLA+-Makrophagenzahlen mit den EF- und cTnI-Spiegeln. Die Daten werden als zweiseitige Spearman-Rangkorrelation dargestellt. Gestrichelte Linien stellen 95 %-Konfidenzintervalle dar. Jedes Symbol stellt ein Tier dar (SS, n = 8 Mäuse; CLP 3 Tage, n = 8 Mäuse; CLP 7 Tage, n = 9 Mäuse; CLP 21 Tage, n = 10 Mäuse) (f, g). Die Ergebnisse stellen in dieser Abbildung vier unabhängige Experimente dar (Extended Data Abb. 3).

Quelldaten

Um die mögliche Beziehung zwischen Monozyten und dem Mac1-Subcluster zu bestimmen, untersuchten wir die dynamischen Immunzustände und Zellübergänge des Monozyten-Makrophagen-Kompartiments mit dem Monocle-Algorithmus27. In der Pseudozeitanalyse haben wir Monozyten-Makrophagen auf 1.500 Zellen heruntergerechnet, um eine klare Zellentwicklungsbahn zu erhalten. Wir beobachteten, dass sich Mac1-Zellen am Anfang der Pseudozeit-Trajektorie befanden, während sich Mon1-, Mon2- und DC-Zellen am Ende der Trajektorie befanden. Darüber hinaus befand sich die Mehrheit der Mac2-Zellen am Ende der Pseudozeit-Trajektorie, wohingegen Mac3-Zellen, ähnlich wie die Mac1-Zellen, am Startzweig lokalisiert waren (Abb. 3a, b und erweiterte Daten Abb. 4a). Die Verfolgung der Veränderungen der Genexpression in Monozyten-Makrophagen-Kompartimenten ergab Entwicklungsmuster, die den Phänotyp und die Funktion von Makrophagen-Untergruppen definieren. Kurz gesagt, der Mac1-Cluster war durch hochregulierte Expressionsniveaus von Cd163, Lyve1, Retnla, Mrc1, Gas6 und Folr2 und durch herunterregulierte Expressionsniveaus von Monozytengenen (Plac8 und Chil3) gekennzeichnet. Die Mon1-, Mon2-, Mac5- und DC-Cluster zeichneten sich durch eine hochregulierte Expression von Ccr2, Il1b, Chil3 und Plac8 aus, wohingegen der Mac2-Cluster durch eine hohe Expression antigenpräsentierender Gene (H2-Aa und H2-Ab1) gekennzeichnet war. Diese Zellcluster zeigten eine verringerte Expression des Mac1-Genprofils (Abb. 3c und erweiterte Daten Abb. 4b).

a, Die Monocle-Vorhersage der Monozyten-Makrophagen-Entwicklungsbahn mit daneben kartierten Seurats-Clusterinformationen in Abb. 2a. b, Die Monocle-Vorhersage der Monozyten-Makrophagen-Entwicklungsbahn, wobei jeder Seurat-basierte Cluster separat dargestellt ist. c, Heatmap der Top-50-Grade zusammen mit der Pseudozeit. Die relative Position einzelner Teilmengen über die Pseudozeit hinweg ist unten dargestellt. d, Repräsentative Konturdiagramme, die die Expression von tdTomato (CX3CR1) auf gegateten CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen, CD45+CD11b+F4/80+ (nicht-CD163+RETNLA+)-Makrophagen und CD45+CD11b+F4 zeigen /80−LY6C+ Monozyten. Diagramm, das den Prozentsatz der tdTomato+-Zellen zeigt, die zu jedem Zeitpunkt der Sepsis aus den Herzen von WT-Mäusen isoliert wurden. NS, nicht signifikant. e, Repräsentative Konturdiagramme, die die Expression von tdTomato (CX3CR1) und CD163 auf gesteuerten CD45+CD11b+F4/80+RETNLA+-Makrophagen zeigen, und Diagramm, das die absolute Anzahl der aus Herzen isolierten CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+tdTomato+-Makrophagen zeigt von WT-Mäusen zu jedem Zeitpunkt nach der Sepsis. f, Repräsentative Histogramme, die die Expression von Ki67 in CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen zeigen, und Diagramm, das die Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von Ki67 bei SS, 3 und 7 Tage nach CLP zeigt. Punkte stellen einzelne Themen dar (d–f); SS, n = 5 Mäuse; CLP 3 Tage, n = 6 Mäuse; CLP 7 Tage, n = 7 Mäuse. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. zweiseitige P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA bestimmt, gefolgt von einem Mehrfachvergleichstest nach Games-Howell (d) oder Sidak (d–f); Die Ergebnisse stellen drei unabhängige Experimente dar (Extended Data Abb. 4).

Quelldaten

Um die obigen Ergebnisse der Pseudozeitanalyse zu bestätigen, verwendeten wir außerdem eine Tamoxifen-induzierbare Cx3cr1CreERT2-IRES-YFP-Mauslinie, gekreuzt mit Rosa26-stop-tdTomato-Reportermäusen (bezeichnet als Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom; Extended Data Abb. 4c), um Mac1-Zellen in SICM zu verfolgen. Die tdTomato-Fluoreszenzsignale dieser Reportermäuse unterschieden zuverlässig CRMs von rekrutierten, aus Monozyten stammenden Makrophagen19. Etwa 95 % der zirkulierenden Monozyten (CD115+CD11b+) und ~89 % Herzmakrophagen (F4/80+CD11b+) waren 1 Woche nach der ersten Verabreichung von Tamoxifen tdTomato+. Drei Wochen nach der Verabreichung von Tamoxifen wurden die zirkulierenden Monozyten nach und nach durch tdTomato-Monozyten ersetzt, wohingegen ihr Beitrag zu Herzmakrophagen vernachlässigbar war. Zum Zeitpunkt von 5 Wochen behielten fast 85 % der Makrophagen und ~98 % der CD163+RETNLA+ Mac1-Zellen im Herzen tdTomato+ bei, das dann auf ähnlichen Werten gehalten wurde (Extended Data Abb. 4d). Sechs Wochen nach der Verabreichung von Tamoxifen wurden Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom-Mäuse einer CLP-Operation unterzogen. Wir beobachteten, dass mehr als 95 % der CD163+RETNLA+ Mac1-Zellen 3 und 7 Tage nach CLP als tdTomato+ verblieben (Abb. 3d). Dementsprechend waren der Anteil und die absolute Anzahl der tdTomato + Mac1-Zellen im septischen Herzen 3 Tage nach CLP deutlich reduziert und erholten sich 7 Tage nach CLP teilweise (Abb. 3e). Um die Proliferation von Mac1-Zellen in vivo zu bestimmen, wurde die Ki67-Expression bewertet. tdTomato+ Mac1-Zellen zeigten 3 Tage nach CLP eine hohe Expression von Ki67 im Vergleich zu denen im Steady-State, was darauf hinweist, dass Mac1-Zellen unter septischem Stress einen aktiv proliferativen Zustand aufwiesen (Abb. 3f und Extended Data Abb. 4e). Diese Daten legen nahe, dass CD163+RETNLA+ Mac1-Zellen sich selbst erneuernde CRMs sind, unabhängig von der Auffüllung durch zirkulierende Monozyten, und während einer Sepsis proliferative Ausbrüche zeigen.

Als nächstes versuchten wir, die funktionalen Eigenschaften der Mac1-Teilmenge in SICM zu untersuchen. Die Anreicherungsanalyse der Genontologie (GO) ergab, dass 156 in Mac1 hochregulierte differentiell exprimierte Gene (DEGs) in biologischer Hinsicht mit Phagozytose und Endozytose zusammenhängen (Abb. 4a). Bemerkenswert ist, dass das Phagozytose-bezogene Gen Trem2 in Mac1-Zellen im Vergleich zu anderen Makrophagen hochreguliert war. (Erweiterte Daten Abb. 5a). Anschließend untersuchten wir die Expression von Trem2 in allen Zellclustern und stellten fest, dass Trem2 in der Mac1-Untergruppe besonders häufig vorkam (Abb. 4b und Extended Data Abb. 5b). Immunfluoreszenzfärbung zeigte die Expression von TREM2 auf Mac1-Zellen sowie eine Kolokalisierung mit CD163 (Abb. 4c). Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte, dass CD163+RETNLA+ Mac1-Zellen im Vergleich zu anderen Makrophagen höhere TREM2-Spiegel exprimierten (Abb. 4d und erweiterte Daten Abb. 5c). Um die Rolle von TREM2 für die Umgestaltung der Makrophagen-Untergruppe in SICM zu bestimmen, führten wir außerdem CLP bei Trem2-defizienten (Trem2-/-) Mäusen und Wildtyp-Wurfgeschwister-Kontrollen durch und analysierten deren kardiale Monozyten-Makrophagen-Kompartimente durch scRNA-seq. Eine unbeaufsichtigte Clusteranalyse von Monozyten-Makrophagen-Kompartimenten in Trem2-/-- und WT-Mäusen zeigte ähnliche Arten und Anteile von Subclustern im Steady-State bzw. 3 Tage nach CLP (Extended Data, Abb. 5d). Bemerkenswerterweise beobachteten wir, dass der Anteil der Mac1-Zellen sowohl bei WT- als auch bei Trem2-/--Mäusen 3 Tage nach CLP signifikant abnahm (Extended Data Abb. 5e). Am Tag 7 nach CLP erholten sich die Mac1-Zellen bei WT-Mäusen auf die normale Anzahl, der Anteil der Mac1-Zellen bei Trem2-/--Mäusen konnte jedoch nicht wiederhergestellt werden (Abb. 4e, f). Die Durchflusszytometrieanalyse bestätigte, dass sich der Prozentsatz und die absolute Anzahl von CD163+RETNLA+-Mac1-Zellen in Trem2–/–-Mäusen am Tag 7 nach CLP im Vergleich zu WT-Kontrollen nicht erholten (Abb. 4g). Im Gegensatz dazu wurden die Anteile anderer kardialer Immunzellkompartimente durch den Trem2-Mangel nicht beeinflusst, mit Ausnahme einer Verringerung des Makrophagenanteils in Trem2-/−-Mäusen 3 und 7 Tage nach CLP und einem leichten Anstieg des Neutrophilenanteils 7 d nach CLP (Extended Data Abb. 5f). Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Proliferationsfähigkeit von CD163+RETNLA+-CRMs bei Trem2–/–-Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen 3 Tage nach CLP, angezeigt durch Ki67-Expression, signifikant verringert war (Abb. 4h). Diese Ergebnisse legen insgesamt nahe, dass TREM2 ein Marker für die Mac1-Untergruppe und essentiell für den Umbau von Mac1-Zellen in septischen Herzen ist.

a, Punktdiagramme, die die 20 wichtigsten biologischen Prozesse für die von GO analysierten hochregulierten DEGs von Mac1 zeigen. Rote Pfeile zeigen Endozytose-bezogene Pfade an. b, UMAP-Diagramme und Violindiagramme, die die Expression von Trem2 im Monozyten-Makrophagen-Kompartiment zeigen. c, Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von CD163 (grün), TREM2 (rot) und Kernen (blau) im Herzgewebe von WT-Mäusen bei SS (n = 5) und 7 Tage nach CLP (n = 5). Die gepunkteten Linien zeigen CD163+TREM2+-Makrophagen. Maßstabsbalken, 20 μm. d, Repräsentative Histogramme der durchflusszytometrischen Analyse der TREM2-Expression in kardialen CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+- und CD45+CD11b+F4/80+(nicht-CD163+RETNLA+)-Makrophagen von WT-Mäusen bei SS und 7 Tage danach CLP. e, UMAP-Diagramme, die Zellclusterungsergebnisse entsprechend Abb. 2a für insgesamt 13.405 Monozyten-Makrophagen in WT- und Trem2-Knockout-Herzen (KO) 7 Tage nach CLP zeigen. f, Clusterverteilung innerhalb der Monozyten-Makrophagen-Untergruppen in WT- und Trem2-KO-Herzen 7 Tage nach CLP. g, Prozentsätze und absolute Zahlen von CD163+RETNLA+-Makrophagen, analysiert durch Durchflusszytometrie aus Herzen von WT-Mäusen (n = 6) und Trem2-KO-Mäusen (n = 6), 7 Tage nach CLP. h, Repräsentative Konturdiagramme, die die Expression von Ki67 auf gesteuerten CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen zeigen, und Diagramm, das den Prozentsatz der Ki67-exprimierenden Zellen in WT (n = 5–6) und Trem2-KO (n = 6) zeigt –7) Herzen bei SS und 3 Tage nach CLP. Jedes Symbol repräsentiert eine Maus (g,h). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; Zweiseitige P-Werte wurden durch ungepaarten t-Test (g) und einfaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest (h) bestimmt. Die Ergebnisse repräsentieren drei unabhängige Experimente (c,d,g,h). Siehe auch Erweiterte Daten Abb. 5.

Quelldaten

Kardiomyozyten stoßen dysfunktionale Mitochondrien in spezielle Vesikel aus, die als „Exopher“ bezeichnet werden und einen mittleren Durchmesser von 3,5 ± 0,1 μm und ein mittleres Volumen von 31,0 ± 2,5 μm3 aufweisen14, ähnlich den in Neuronen von Caenorhabditis elegans beschriebenen Strukturen28. Herzmakrophagen sind für die Aufrechterhaltung der Herzhomöostase unverzichtbar, indem sie diese subzellulären Partikel und defekten Mitochondrien reinigen14. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Homöostase von Makrophagen in septischen Herzen gestört ist. Wir vermuteten, dass eine gestörte Homöostase von Makrophagen die Entfernung von aus Kardiomyozyten stammenden beschädigten Mitochondrien während einer Sepsis beeinträchtigen könnte. Zunächst wurden αMHCCre-Mäuse mit Rosa26TdTom-Mäusen gekreuzt und nur die Kardiomyozyten der erzeugten Mäuse (als CardRED-Mäuse bezeichnet) zeigten rote Fluoreszenz. Wir beobachteten, dass die Ansammlung einiger subzellulärer Partikel, definiert als Exopher, mit dem mitochondrialen Protein Tom20 im extrazellulären Raum septischer CardRED-Mäuseherzen kolokalisierte (Abb. 5a, b und Zusatzvideo 1). Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse ergab eine signifikante Ansammlung freier Mitochondrien in der Peripherie von Kardiomyozyten 3 Tage nach CLP (Extended Data Abb. 6a, b). Darüber hinaus wurden diese Exopher mittels Durchflusszytometrie gereinigt14. Wir beobachteten, dass kardiale Exopher positiv auf die mitochondrialen Sonden MitoTracker Green und MitoNIR reagierten (Extended Data Abb. 6c, d), außerdem ein verringertes Membranpotential und eine verlorene Reaktionsfähigkeit auf hyperpolarisierende Mittel aufwiesen (Extended Data Abb. 6e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Sepsis die Ansammlung dysfunktionaler Mitochondrien verursacht, die von Kardiomyozyten im extrazellulären Raum des Herzens ausgeworfen werden.

a, Immunfluoreszenzbilder und 3D-Rekonstruktion, die das Vorhandensein von Tom20+-Material in Kardiomyozyten-abgeleiteten Exophern aus Herzen septischer CardRED-Mäuse zeigen. b, Vorhandensein von Tom20+-Material in von Kardiomyozyten abgeleiteten Exophern aus Herzen von CardRED-Mäusen bei SS und 3 Tage nach CLP. Diagramm mit Exopher-Zahlen pro Sichtfeld (FOV); n = 6 pro Gruppe. c, TEM-Bild einer mononukleären Zelle, die Mitochondrien durch ausgedehnte Pseudopodien in septischen Herzen aufnimmt (CLP 7 d). d, Bilder, die von Kardiomyozyten abgeleitete Exophern (rot) zeigen, die Mitochondrien (Tom20, weiß) enthalten, die in TREM2+-Makrophagen (grün) aus Herzen von CardRED-Mäusen (n = 4) vorhanden sind. e, Von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mt-Dendra2, grün), die in TREM2+-Makrophagen (rot) aus Herzen von MitoCard-Mäusen (n = 4) vorhanden sind. f, Von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mt-Dendra2, grün), lokalisiert in Lysosomen (LAMP1, weiß) von TREM2+-Makrophagen (rot) in Herzen von MitoCard-Mäusen (n = 3). g, TREM2+-Makrophagen (grün) nahmen von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mt-Keima-458, cyan) und einige Mitochondrien in einer sauren Umgebung (mt-Keima-561, rot) aus Herzen von AAV9-Tnnt2-mt-Keima-infizierten Mäusen auf . h, CD163+-Makrophagen (grün) verschlangen von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien in Herzen von WT- bzw. Trem2–/–-Mäusen, die mit AAV9-Tnnt2-mt-Keima infiziert waren. Diagramm, das den Prozentsatz der mt-Keima+-Mitochondrien in CD163+-Makrophagen zeigt (n = 5 pro Gruppe). Für jedes Tier wählten wir zufällig fünf Visualisierungsbereiche aus und fünf Mac1-Zellen wurden analysiert. Das Verhältnis der Fläche der mt-Keima-Mitochondrien in einer einzelnen Mac1-Zelle zur Fläche derselben Mac1-Zelle wurde berechnet. Das Verhältnis in der KO-Gruppe wurde auf das Verhältnis der Kontrollgruppe normalisiert. i, Der Einbau von aus Kardiomyozyten stammendem tdTomato-Protein in CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen und CD45+CD11b+F4/80−LY6C+-Monozyten aus WT → CardRED- oder KO → CardRED-Chimären 7 Tage nach CLP. Diagramm, das die Quantifizierung des MFI von tdTomato zeigt (n = 6–7 pro Gruppe). j, Vorhandensein von Tom20+-Material (cyan) in von Kardiomyozyten abgeleiteten Exophern (rot) aus Herzen von WT → CardRED- und KO → CardRED-Chimären 7 Tage nach CLP. Diagramm, das die Exopher-Zahlen pro FOV zeigt (n = 6 pro Gruppe). In den Bildern sind Maßstabsbalken angegeben. Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung (b, h, j) und den Median mit Interquartilabstand (i). Zweiseitige P-Werte wurden durch den ungepaarten t-Test (b, h, j) und den Mann-Whitney-U-Test (i) bestimmt. Die Ergebnisse repräsentieren vier (b), drei (d–f) und zwei (g–j) unabhängige Experimente (Extended Data Abb. 6 und 7).

Quelldaten

Angesichts der Tatsache, dass freie Mitochondrien und mitochondriale DNA (mtDNA) Herzschäden hervorrufen können, ist die Eliminierung von Exophern, die aus Kardiomyozyten stammende Mitochondrien enthalten, wichtig, um die Homöostase des Herzens aufrechtzuerhalten und eine optimale Herzfunktion wiederherzustellen29,30. Als nächstes untersuchten wir den Mechanismus für die Beseitigung dysfunktionaler Mitochondrien im septischen Herzen. TEM-Bilder zeigten, dass einige an Kardiomyozyten angrenzende Zellen eine ähnliche Größe und Morphologie wie Makrophagen aufwiesen. Diese Makrophagen streckten Pseudopoden aus, die die mitochondrienhaltigen Vesikel in der Peripherie septischer Kardiomyozyten umgaben (Abb. 5c und Extended Data Abb. 6f). Konfokale und dreidimensionale (3D) Bilder zeigten übereinstimmend, dass von TREM2+-Zellen umgebene Exophere (rot) Mitochondrien in septischen Herzen von CardRED-Mäusen enthielten (Abb. 5d und Zusatzvideo 2).

Um die phagozytische Aktivität von TREM2hi-Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+CD163+) zu quantifizieren, ergab eine Durchflusszytometrieanalyse mit den Herzen von CardRED-Mäusen den höheren Einbau von aus Kardiomyozyten stammendem tdTomato-Protein in Mac1-Zellen im Vergleich zu Nicht-Mac1-Zellen ( Erweiterte Daten Abb. 6g). Darüber hinaus wurden Kardiomyozyten-spezifische Mitochondrien-Reportermäuse (MitoCard) durch Kreuzung von mtD2Flox/Flox mit αMHCCre/+-Mäusen erzeugt, und konfokale Bilder zeigten, dass von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien in TREM2+-Makrophagen lokalisiert waren (Abb. 5e und Zusatzvideo 3). Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte auch, dass TREM2hi-Mac1-Zellen während der SICM mehr von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien einbauten (Extended Data Abb. 6h). Darüber hinaus führten wir eine TUNEL-Färbung mit Herzen von septischen WT-Mäusen durch und stellten fest, dass der Prozentsatz von TUNEL+cTnI+-Zellen an den Gesamtzellen (TUNEL+cTnI+/4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)) sehr niedrig war (ungefähr 1). %) am Tag 3 nach der Sepsis (Extended Data Abb. 6i). Diese Ergebnisse schlossen die Möglichkeit aus, dass TREM2hi-Zellen apoptotisches Material aus dem septischen Herzen einbauen.

Um das Schicksal von aus Kardiomyozyten stammenden Mitochondrien in Mac1-Zellen aufzuklären, führten wir eine Immunfärbung von TREM2 mit dem Lysosomenmarker Lamp1 mit den Herzabschnitten septischer MitoCard-Mäuse durch und beobachteten, dass mt-Dendra2-Signale in TREM2+-Zellen teilweise in LAMP1+-Lysosomen lokalisiert sind (Abb. 5f und ). Zusatzvideo 4). Als nächstes verpackten wir das Adeno-assoziierte Virus Serotyp 9 (AAV9)-Tnnt2-mt-Keima-Virus und führten eine intramyokardiale Injektion des AAV9-Virus durch, um die spezifische Expression des Keima-Proteins in den Mitochondrien (mt-Keima) von Kardiomyozyten sicherzustellen (Extended Data Abb . 7a)32. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass reichlich vorhandene mt-Keima+-Partikel in TREM2+-Makrophagen konzentriert waren (Abb. 5g). Keima ist pH-empfindlich und sein Peak im Anregungsspektrum kann sich von der kürzeren (grün, in der neutralen Umgebung) zur längeren (rot, in der sauren Umgebung) Wellenlänge verschieben33. Video- und 3D-Bilder zeigten, dass mt-Keima in TREM2+-Makrophagen sowohl grüne als auch rote Fluoreszenzsignale in den Herzen septischer WT-Mäuse aufwies, denen das AAV9-Tnnt2-mt-Keima-Virus injiziert worden war (Abb. 5g und Zusatzvideo 5), was darauf hindeutet, dass Mitochondrien entnommen wurden Die von Mac1-Zellen erzeugten Proteine ​​können an die saure lysosomale Umgebung abgegeben werden. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass TREM2hi-Mac1-Zellen eine starke Aktivität bei der Eliminierung von aus Kardiomyozyten stammenden dysfunktionalen Mitochondrien aufweisen.

Die scRNA-seq-Datenanalyse ergab, dass die Mehrzahl der endozytischen Gensignaturen wie Wwp1, Ccr5, Cd36, Eps15, Cltc, Mrc1, Ccl24, Dab2 und Folr2 in der gesamten Makrophagenpopulation bei Trem2–/– Mäusen im Vergleich zu WT-Zellen abnahm ( Erweiterte Daten Abb. 7b,c). Anschließend untersuchten wir die Wirkung von TREM2 auf die Aufnahme von aus Kardiomyozyten stammenden Mitochondrien durch Makrophagen. Die intramyokardiale Injektion des AAV9-Tnnt2-mt-Keima-Virus wurde mit WT- bzw. Trem2-/-Mäusen durchgeführt. Trem2 −/− septische Mäuse zeigten eine verringerte Aufnahme von kardiomyozytären Mitochondrien und Keima durch CD163+-Makrophagen (Abb. 5h und Zusatzvideo 5). Als nächstes transplantierten wir Knochenmarkszellen von WT- oder Trem2-/-Mäusen in bestrahlte CardRED-Empfängermäuse und 8 Wochen später wurde eine CLP-Operation durchgeführt (Extended Data Abb. 7d). Wir fanden heraus, dass WT → CardRED CD163+RETNLA+ Mac1-Zellen 7 Tage nach CLP mehr von Kardiomyozyten abgeleitetes Material abfingen als Trem2–/–→CardRED CD163+RETNLA+ Mac1-Zellen (Abb. 5i). Die Immunfluoreszenz zeigte konsistent, dass sich mehr von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien im Herzen von Trem2−/−→CardRED-Chimären ansammelten (Abb. 5j). Darüber hinaus zeigten Trem2-defiziente Mäuse 7 Tage nach CLP eine starke Ansammlung freier Mitochondrien im extrazellulären Raum von Kardiomyozyten (Extended Data Abb. 7e), dies wurde jedoch bei Trem2-defizienten Mäusen im Steady State nicht gefunden (Extended Data Abb. 7f). ). Diese Daten legen nahe, dass TREM2 die Reinigung beschädigter Mitochondrien durch Mac1-Zellen in septischen Herzen erleichtert.

Um die physiologische Bedeutung von TREM2hi-Mac1-Zellen in SICM zu bestimmen, verglichen wir die Überlebensrate, die systolische Herzfunktion, Herzverletzungsmarker und Entzündungen zwischen WT- und Trem2-/-Mäusen nach CLP. Wie in Abb. 6a gezeigt, war die Mortalität septischer Trem2-/−-Mäuse deutlich erhöht. Darüber hinaus ergab der Echokardiographie-Assay, dass Trem2-/−-Mäuse im Vergleich zu WT-Wurfgeschwister-Kontrollen eine schlechtere Herzfunktion aufwiesen, was durch eine geringere EF, eine geringere fraktionierte Verkürzung (FS) und ein geringeres Herzzeitvolumen (CO) angezeigt wurde, insbesondere 7 und 21 Tage nach CLP (Abb. 6b und ). Erweiterte Daten Abb. 8a,b). Die Konzentrationen von cTnI und LDH im Serum sowie die Messenger-RNA-Spiegel von Anp und Bnp im Herzgewebe waren bei septischen Trem2-/−-Mäusen alle erhöht (Abb. 6c und Extended Data Abb. 8c – e). Außerdem erhöhte ein Trem2-Mangel die mRNA-Spiegel entzündungsfördernder Mediatoren nach CLP signifikant (Extended Data Abb. 8f–i).

a: Überlebensanalyse von WT-Mäusen (n = 18) und Trem2-/--Mäusen (n = 30), nachdem die CLP-Leistung 7 Tage lang überwacht wurde. b-, c-, WT- und Trem2-/--Mäuse wurden CLP unterzogen und die Herzfunktion wurde bei SS sowie 3, 7 und 21 Tage nach CLP untersucht. Diagramm mit EF % (b), gemessen durch Echokardiographie (n = 7–8 Mäuse für jede Gruppe) und den cTnI-Spiegeln (c) im Serum (n = 5–8 Mäuse für jede Gruppe). d, Repräsentative M-Modus-Echokardiographiebilder und EF % der WT → WT-Chimären (Trem2+/+Ch) und Trem2−/−→WT-Chimären (Trem2−/−Ch) 7 Tage nach CLP. e, Repräsentative Dauerstrich-Doppler-Echokardiographiebilder und E/A-Verhältnis von Trem2+/+Ch- und Trem2−/−Ch-Chimären 7 Tage nach CLP. f, Diagramm, das den mittels Echokardiographie gemessenen CO zeigt. g,h, Diagramme, die die Konzentrationen von cTnI (g) und LDH (h) im Serum von Trem2+/+Ch- und Trem2−/−Ch-Chimären 7 Tage nach CLP zeigen (d–h, n = 11 Mäuse für jede Gruppe) . i, Diagramme, die die Proteinspiegel von ANP und BNP im Serum von Trem2+/+Ch- und Trem2−/−Ch-Chimären 7 Tage nach CLP zeigen. j, Diagramme, die die Proteinspiegel von Tumornekrosefaktor (TNF)-α, IL-1β, IL-6 und CCL2 im Herzgewebe von Trem2+/+Ch- und Trem2−/−Ch-Chimären 7 Tage nach CLP zeigen (i, j, n = 10 Mäuse für jede Gruppe). k, Repräsentative TEM-Bilder (links) und Mitochondrien-Verletzungs-Score (rechts) von Trem2+/+Ch- und Trem2−/−Ch-Chimären 7 Tage nach CLP. Maßstabsbalken, 5 μm. Balkendiagramm, das den Mitochondrien-Verletzungs-Score pro FOV zeigt. Jedes Symbol stellt ein FOV von TEM-Bildern dar. Jede Gruppe besteht aus vier Mäusen und fünf FOVs wurden zufällig für die Untersuchung von jedem Tier ausgewählt. l,m, Diagramme, die die ATP-Spiegel (l) in Herzgewebelysaten und die Serumlaktatspiegel (m) von Trem2+/+Ch- und Trem2−/−Ch-Chimären 7 Tage nach CLP (l, m, n = 11) zeigen Mäuse für jede Gruppe). Jedes Symbol repräsentiert ein Tier (b–j,l,m). Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung (b–f,h–l) und den Median mit Interquartilbereich (g,m). Zweiseitige P-Werte wurden durch den Kaplan-Meier-Log-Rank-Test (a), die zweiseitige ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest (b, c), den ungepaarten t-Test (d–f, h–k) und Mann– bestimmt. Whitney U-Test (g,m). Die Ergebnisse repräsentieren mindestens vier (b,c) und drei (d–m) unabhängige Experimente (Extended Data Abb. 8).

Quelldaten

Aus dem Knochenmark stammende Makrophagen tragen zum residenten Mikroglia-Pool in chimären Mäusen bei34,35. Bestrahlten Empfängern (CD45.1-Hintergrund) wurden Knochenmarkszellen von WT- bzw. Trem2-/-Mäusen (CD45.2-Hintergrund) transplantiert (Extended Data Abb. 8j). Der Durchflusszytometrietest zeigte, dass die Effizienz der Rekonstitution von Mac1-Zellen in bestrahlten Chimären 8 Wochen nach der Knochenmarktransplantation (BMT) über 90 % betrug (Extended Data Abb. 8k, l). Durchflusszytometrie- und Echtzeit-PCR-Ergebnisse zeigten, dass Trem2−/−→WT-Chimären (Trem2−/−Ch) einen niedrigeren TREM2-Proteinspiegel in Herzmakrophagen und Trem2-mRNA-Spiegel im Herzgewebe aufwiesen als WT → WT-Chimären (Trem2+/+Ch). ) bzw. (Extended Data Abb. 8m). Acht Wochen nach der BMT wurden chimäre Mäuse CLP ausgesetzt. Wir fanden heraus, dass ein Trem2-spezifischer Mangel an Makrophagen Herzfunktionsstörungen, Myokardschäden und Herzentzündungen nach einer Sepsis verschlimmerte (Abb. 6d – j und Extended Data Abb. 8n, o). Darüber hinaus zeigten Trem2-/-Ch-Chimären eine verstärkte Mitochondrienschädigung (Abb. 6k), verringerte ATP-Spiegel (Abb. 6l) und erhöhte Laktatspiegel (Abb. 6m). Diese Ergebnisse legen nahe, dass TREM2 für Mac1 essentiell ist, um die Herzfunktion nach einer Sepsis zu schützen.

Schließlich wollten wir untersuchen, ob die Behandlung mit Mac1-Zellen die Herzfunktion nach einer Sepsis schützen kann. Die sortierten TREM2hi-Mac1- und Nicht-Mac1-Zellen aus den Herzen von CD45.1-Mäusen wurden jeweils unmittelbar nach CLP in den Perikardraum von CD45.2-Mäusen transplantiert. Den Kontrolltieren wurde das gleiche Volumen Matrigel (MG) intraperikardial injiziert (Abb. 7a). Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte, dass die transplantierten Mac1- und Nicht-Mac1-Zellen mindestens 7 Tage nach CLP überleben und in den Herzen der Empfänger verbleiben können (Extended Data Abb. 9a). Der Anteil der Mac1-Zellen an den gesamten CD45+-Zellen war in den Herzen von Mäusen, denen Mac1-Zellen injiziert worden waren, zu den untersuchten Zeitpunkten im Vergleich zu Mäusen, denen MG injiziert worden war, signifikant erhöht (Extended Data Abb. 9b, c). In ähnlicher Weise war der Anteil der Nicht-Mac1-Zellen an den gesamten CD45+-Zellen auch in den Herzen von Mäusen, denen nicht Mac1 injiziert worden war, zu den untersuchten Zeitpunkten im Vergleich zu Mäusen, denen MG injiziert worden war, erhöht (Extended Data Abb. 9d, e). Darüber hinaus wurden Mac1- und Nicht-Mac1-Zellen mit CellTracker Orange (CMTMR) markiert und dann unmittelbar nach CLP in die Herzbeutelhöhle transferiert. Nach 3 Tagen zeigte die histologische Untersuchung, dass die transplantierten Zellen weit im Myokard verteilt waren (Erweiterte Daten, Abb. 9f). Darüber hinaus haben wir die CMTMR-markierten Mac1-Zellen intraperikardisch in MitoCard-Mäuse übertragen. Drei Tage später zeigten konfokale und 3D-Bilder, dass injizierte Zellen aus Kardiomyozyten stammende Mitochondrien umhüllten (Erweiterte Daten, Abb. 9g und Zusatzvideo 6). Diese Daten zeigen zusammen, dass die transplantierten Mac1-Zellen in das Myokard eindringen, im Herzen der Empfängermäuse mindestens 7 Tage lang überleben und von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien verschlingen können.

a, Schematische Darstellung der Transplantation von TREM2hi-Mac1-Zellen in WT-Mäusen. Aus WT-Mäusen isolierte TREM2hi-Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) und Nicht-Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+ und Nicht-CD163+RETNLA+) wurden mit MG gemischt und in die Perikardhöhle von transplantiert WT-Mäuse (2 × 105 Zellen pro Tier) unmittelbar nach CLP. Kontrollmäusen wurde nur MG injiziert. Die Mäuse wurden 3 Tage nach der Transplantation getötet und analysiert. b–e, repräsentative M-Modus-Echokardiographiebilder (b) und Diagramme, die EF % (c), FS % (d) und CO (e) zeigen, gemessen durch Echokardiographie (b–e, +MG, n = 5 Mäuse; +nicht). -Mac1, n = 9 Mäuse; +Mac1, n = 10 Mäuse). f,g, Diagramme, die die Konzentrationen von cTnI und LDH im Serum zeigen. h, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Anp und Bnp im Herzgewebe zeigen. i, Diagramme, die die Proteinspiegel von ANP und BNP im Serum zeigen. j, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Tnfα, Il1β, Ccl2 und Il6 im Herzgewebe zeigen. k, Diagramme, die die Proteinspiegel von TNF-α, IL-1β, IL-6 und CCL2 im Herzgewebe zeigen. l, Repräsentative TEM-Bilder (links) und Mitochondrien-Verletzungs-Score (rechts). Maßstabsbalken, 5 μm. Jedes Symbol stellt ein FOV dar. Jede Gruppe besteht aus vier Mäusen und von jedem Tier wurden fünf FOV zufällig für den Test ausgewählt. m, Diagramm, das die ATP-Spiegel in Herzgewebelysaten zeigt. n, Diagramm, das die Serumlaktatwerte zeigt. (f–k,m,n, +MG, n = 5 Mäuse; +non-Mac1, n = 9 Mäuse; +Mac1, n = 9 Mäuse). Jedes Symbol repräsentiert ein Tier in c–k, n, m. Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung. Zweiseitige P-Werte wurden durch eine einfaktorielle ANOVA und anschließend durch den Mehrfachvergleichstest nach Games-Howell (c–h,j,n,m) oder Tukey (i,k) ermittelt. Die Ergebnisse repräsentieren vier unabhängige Experimente (b–n). Siehe auch Erweiterte Datenabbildungen. 9 und 10.

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Im Vergleich zu intraperikardial transplantierten Nicht-Mac1-Zellen oder MG-Gruppen zeigten Herzen septischer Mäuse, denen TREM2hi-Mac1-Zellen transplantiert wurden, eine signifikant verbesserte Herzfunktion (Abb. 7b – e). Konsequenterweise verbesserte die Transplantation mit TREM2hi-Mac1-Zellen Herzschäden (Abb. 7f–i), Entzündungen (Abb. 7j, k), Mitochondrienschäden (Abb. 7l), erhöhte ATP-Spiegel (Abb. 7m) und verringerte Laktatspiegel (Abb . 7n).

Als nächstes wurden WT-Mac1-Zellen und Trem2-/-Mac1-Zellen aus den Herzen von WT- oder Trem2-/-Mäusen isoliert und unmittelbar nach CLP intraperikardial (2 × 105 Zellen pro Maus) in die Herzen von Trem2-/-Mäusen transplantiert (Extended). Daten Abb. 10a). Drei und sieben Tage später ergab die Echokardiographie, dass die Transplantation mit WT-Mac1-Zellen die Herzfunktion septischer Mäuse im Vergleich zu Trem2-/−-Mäusen, denen Trem2-/−-Mac1-Zellen oder MG-Gruppen injiziert wurden, signifikant verbesserte (Extended Data Abb. 10b – d). Konsequenterweise verbesserte die Transplantation mit WT-Mac1-Zellen Herzschäden und Entzündungen (Extended Data Abb. 10e–j), erhöhte die ATP-Spiegel (Extended Data Abb. 10k) und verringerte die Laktatspiegel (Extended Data Abb. 10l). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Verabreichung von TREM2hi-Mac1-Zellen ein potenzieller therapeutischer Ansatz zur Vorbeugung und Behebung von Herzfunktionsstörungen bei Sepsis sein könnte.

Patienten mit SICM haben eine hohe Sterblichkeitsrate4,36,37 und ihre septischen Herzen sind mit einem hohen Energiestoffwechsel und katastrophalen mitochondrialen Schäden verbunden5,38. Makrophagen sind an Herzentzündungen, Efferozytose, Gewebeumbau und Homöostase beteiligt11,13,39; Die Rolle verschiedener Makrophagen-Untergruppen im septischen Herzen ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Studie untersuchten wir eine Untergruppe von Herzmakrophagen in septischen und stationären Herzen, die sich durch eine hohe Expression von TREM2 und die Fähigkeit zur Selbsterneuerung auszeichnete, definiert als TREM2hi-Mac1-Zellen. Die hohe Expression von TREM2 ist für die Funktion von Mac1-Zellen beim Reinigen defekter Mitochondrien und beim Schutz des septischen Herzens von entscheidender Bedeutung (Extended Data Abb. 10m). Darüber hinaus könnte die intraperikardiale Injektion von CD163+RETNLA+TREM2hi Mac1-Zellen die Herzfunktionsstörung septischer Mäuse verhindern.

Zahlreiche Studien haben die heterogene Zusammensetzung und gewebespezifische Veränderungen von Makrophagen im Steady State und in verschiedenen pathologischen Situationen wie Myokardinfarkt hervorgehoben8,11,19,22. Unsere scRNA-seq-Daten zeigten das Vorhandensein von fünf Makrophagenpopulationen, Mac1–5, im Steady-State-Herzen von Mäusen, was in einer früheren Studie angegeben wurde19. Mac1- und Mac2-Untergruppen waren die dominanten Herzmakrophagen-Untergruppen, die durch die Expression von Phagozytose- (Trem2) bzw. Antigen-präsentierenden (H2-Aa)-bezogenen Genen gekennzeichnet waren. Die Mac3–5-Untergruppen wiesen geringe Anteile und stark exprimierte Gene auf, die mit IFN-Stimulation (Irf7), pathologischer Entzündung (CD72) bzw. Chemokinen (Ccr2) zusammenhängen. Wir fanden heraus, dass die Mac1-Untergruppe eine dynamische Veränderung aufwies, nach 3 Tagen abnahm und sich nach 7 Tagen nach CLP erholte, was gut mit der Verschlechterung und Wiederherstellung der Herzfunktion bei Sepsis korrelierte. Sowohl Mac3- als auch Mac4-Untergruppen waren signifikant erhöht, zusammen mit verstärkten systemischen Entzündungsreaktionen und Knochenmarkmobilisierung. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass CD72 in einem Modell der transversalen Aortenverengung ein Schlüsselmarker einer entzündungsfördernden Makrophagen-Untergruppe war, in der viele Gene mit dem in unserer Studie identifizierten Mac4 überlappten22, was darauf hindeutet, dass die CD72-exprimierte Mac4-Untergruppe eng mit Entzündungen verbunden ist und Herzverletzung bei SICM.

Hinsichtlich des Ursprungs können Herzmakrophagen in aus Embryonen stammende residente CCR2−-Untergruppen (resident) und aus hämatopoetischen rekrutierten CCR2+-Untergruppen (zirkulierend) unterteilt werden11,12,13. CCR2−-Untergruppen werden durch lokale Proliferation wieder aufgefüllt, vermitteln die Stoffwechselstabilität und fördern die Erholung des Herzens nach einer Verletzung14,19. Im Gegensatz dazu verstärken rekrutierte CCR2+-Untergruppen Entzündungen und oxidativen Stress40. Dick et al. fanden heraus, dass eine TIMD4+LYVE1+MHC-IIloCCR2−-residente Herzmakrophagen-Untergruppe, die durch Selbsterneuerung aufrechterhalten wurde, unerwünschte Umbauten hemmt und die Wiederherstellung der Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt fördert14. Im Einklang mit dieser Studie identifizierten wir eine Untergruppe von CD163+RETNLA+ CRMs (Mac1-Zellen), die bei septischem Stress deutlich zurückging. Beim Fortschreiten der SICM zeigten residente Mac1-Zellen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und spielten eine schützende Rolle im septischen Herzen. Ein aktuelles Manuskript zeigte auch, dass die Anzahl der Herzmakrophagen 1 Tag nach CLP abnahm und dann nach 28 Tagen auf übernormale Werte anstieg41. Die Erholung der kardialen Makrophagenzahlen wurde hauptsächlich durch lokale Proliferation bestimmt, während die periphere Rekrutierung nur 6,2 % ausmachte41. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich selbst erneuernde residente Mac1-Zellen eine wesentliche Rolle beim Schutz der Herzfunktion bei Sepsis spielen.

Als Transmembranrezeptor der Immunglobulin-Superfamilie führt die Aktivierung von TREM2 zur DAP12-Phosphorylierung und fördert folglich die Zellproliferation und das Überleben, moduliert die Phagozytose und wirkt Entzündungen entgegen42,43. Wir beobachteten, dass die Mac1-Untergruppe über TREM2hi verfügt und dessen Proliferation während der Sepsis verstärkt wurde. Darüber hinaus hatte der Trem2-Mangel keinen Einfluss auf die Anzahl der Mac1-Zellen im gesunden Herzen, beeinträchtigte jedoch die Wiederherstellung dieser Makrophagen im septischen Herzen erheblich. Unsere vorherige Studie zeigte, dass TREM2 in Leber, Lunge und Milz von Steady-State-Mäusen kaum nachweisbar war, wohingegen die TREM2-Expression in diesen Geweben signifikant erhöht war, nachdem CLP und die Blockade von TREM2 die polymikrobielle Sepsis verschlimmerten44, was auf seine schützende Wirkung gegen Sepsis schließen lässt. Die spezifische Funktion von TREM2+-Makrophagen in anderen Organen bedarf weiterer Untersuchungen. Frühere Studien zeigten, dass ein Trem2-Mangel bei pathologischen Zuständen zu einer Verringerung der Makrophagenproliferation führte45,46 und einen Stillstand des Zellzyklus verursachte47. Ebenso stellten wir fest, dass ein Trem2-Mangel die Proliferation von Mac1-Zellen in SICM deutlich verringerte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass TREM2 eine wesentliche Rolle bei der Wiederherstellung von SICM durch die Rekonstitution der CD163+RETNLA+ Mac1-Subpopulation spielt.

Extrazelluläre Mitochondrien und mtDNA können Entzündungen auslösen und Herzschäden verursachen29,30. Eine aktuelle Studie zeigte, dass CRMs extrudierte Mitochondrientrümmer beseitigen, um die Homöostase der langlebigen Kardiomyozyten aufrechtzuerhalten, und eine Schutzfunktion ausüben14. Unsere vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass dysfunktionale Mitochondrien im extrazellulären Raum des Myokards deutlich vermehrt waren, was mit einer Herzfunktionsstörung unter septischem Stress einherging. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen41 zeigte Sepsis einen sehr geringen Einfluss auf das Überleben von Herzzellen. Mac1-Zellen zeigten eine starke Fähigkeit, aus Kardiomyozyten stammende abnormale Mitochondrien in SICM zu entfernen. Darüber hinaus regulierte die Trem2-Ablation die endozytischen Gene in CRMs herunter und verschlimmerte die Ansammlung defekter Mitochondrien im Herzen und Herzfunktionsstörungen. Darüber hinaus könnte die intraperikardiale Verabreichung von CD163+RETNLA+TREM2hi-Makrophagen überleben und von Kardiomyozyten stammende defekte Mitochondrien verschlingen, die folglich vor einer septischen Myokarddysfunktion schützen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass TREM2hi-Mac1-Zellen eine starke Endozytosefunktion hatten und die Herzhomöostase aufrechterhielten, indem sie defekte Mitochondrien während der Sepsis eliminierten.

Zusammenfassend hat unsere Studie eine CD163+RETNLA+-Makrophagen-Untergruppe (Mac1) ergeben, die eine hohe TREM2-Expression aufweist. TREM2 ist für die Selbsterneuerung und den Umbau von Mac1-Zellen im septischen Herzen unerlässlich. TREM2hi-Mac1-Zellen reinigen defekte Mitochondrien und die Transplantation von Mac1-Zellen trägt zur Wiederherstellung der Herzfunktion während SICM bei. Unsere Studie zeigt, dass die Aufrechterhaltung der Funktion dieser Untergruppe durch Nutzung von TREM2 eine potenzielle Therapiestrategie für Herzerkrankungen in der Klinik sein könnte.

C57BL/6 WT-Mäuse wurden vom Shanghai SLAC Laboratory Animal Center erhalten. M. Colonna stellte freundlicherweise Trem2-/-Mäuse von der Washington University in St. Louis zur Verfügung. M. Shang von der Zhejiang-Universität stellte freundlicherweise αMHCCre-Mäuse zur Verfügung. Die folgenden Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft: Rosa26-stop-tdTomato, Cx3cr1CreERT2–IRES–YFP, mtD2flox/+ (B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG−COX8A/Dendra2)Dcc/J) und B6;CD45. 1 Mäuse (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ). αMHCCre-Mäuse wurden mit Rosa26-stop-tdTomato oder mtD2flox/flox gekreuzt, um kardiomyozyten-fluoreszierende Reportermäuse (als CardRED-Mäuse bezeichnet) oder Kardiomyozyten-spezifische Mitochondrien-fluoreszierende Reportermäuse (als MitoCard-Mäuse bezeichnet) zu erzeugen. Die Mäuse wurden in einer spezifisch pathogenfreien Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und die Umgebungstemperatur wurde bei 22 °C gehalten. Mäuse wurden mit bestrahltem Futter (SZS9126, XIETONG BIO-ENGINEERING) und sterilem Wasser gefüttert. Die Käfige wurden einmal pro Woche autoklaviert und gewechselt. Für die Experimente wurden ausschließlich männliche Mäuse verwendet. Die Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Zhejiang University School of Medicine genehmigt und gemäß den institutionellen Richtlinien (Referenznummern 2017442 und 2021858) durchgeführt.

8 Wochen alten männlichen Mäusen wurde eine Anästhesie mit Ketamin (50 mg kg-1) und Xylazin (5 mg kg-1) verabreicht, die vor der Bauchdepilation intraperitoneal injiziert wurden. Anschließend wurde den Mäusen ein 1,5 cm langer Längsschnitt im unteren Quadranten des Abdomens angelegt und anschließend der Blinddarm isoliert. Die distalen drei Viertel des Blinddarms wurden mit 4-0-Seidennähten abgebunden und mit einer 22-Gauge-Nadel wurden zwei Einstiche in den abgebundenen Blinddarm vorgenommen, was eine subletale CLP-induzierte Sepsis auslöste. Anschließend wurde der Blinddarm nach dem Extrudieren des Stuhls wieder in die Bauchhöhle gelegt und die Wunde mit einer 4-0-Seidennaht vernäht. Jeder Maus wurde nach der Operation 1 ml sterile Kochsalzlösung verabreicht48. Die Überlebensrate wurde 7 Tage lang alle 2 Stunden bewertet.

Zur Schicksalsmarkierung von Herzmakrophagen wurden Cx3cr1CreERT2–IRES–YFP-Mäuse mit Rosa26-stop-tdTomato-Mäusen gekreuzt. Im Alter von 6 Wochen wurden Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom-Mäusen 4 mg Tamoxifen (Meilunbio) pro Maus in Maisöl verabreicht und 48 Stunden später erneut. Nach 5 Wochen wurden die Mäuse für die Tests getötet.

Knochenmarkszellen wurden aus Oberschenkelknochen und Schienbeinen von 8 Wochen alten männlichen Spendermäusen gewonnen. Zunächst wurde das Knochenmark mit vorgekühltem PBS ausgespült. Nach der Lyse der roten Blutkörperchen wurde durch einen 70-µm-Filter eine Einzelzellsuspension erhalten. Insgesamt wurden 1 × 107 Knochenmarkszellen intravenös in tödlich bestrahlte (8 Gy) männliche Empfängermäuse übertragen. Den chimären Mäusen wurden eine Woche lang Antibiotika über das Trinkwasser verabreicht. Nach 8 Wochen war der Modellbau abgeschlossen.

Rekombinante Vektoren des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 2/9 (AAV 2/9), die mt-Keima mit dem herzspezifischen Promotor cTnT tragen, wurden wie zuvor beschrieben14 entworfen und von OBiO Technology hergestellt. Jeder Maus wurde ein Titer von 3 × 1011 AAV9-Tnnt2-mt-Keima-Virus durch intrakardiale Injektion verabreicht. Nach 6 Wochen wurden Mäuse für CLP-Experimente verwendet.

Gesamt-RNA wurde aus Mausgeweben und -zellen unter Verwendung von TRIzol (Ambion) gewonnen. Komplementäre DNA-Proben wurden mit dem PrimeScript RT-Reagenzienkit (Takara) synthetisiert und die Genexpression mit qPCR unter Verwendung des SYBR-Premix Ex Taq (Takara) auf dem Lightcycler 480-System (Roche) analysiert. Die verwendeten Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Echokardiographie wurde bei Mäusen unter Isoflurananästhesie mit einem Vevo 2100-System (VisualSonics) durchgeführt. Die normale Körpertemperatur wurde durch eine Heizplattform aufrechterhalten. Zur Messung der Innenabmessungen des linken Ventrikels (LV) bei Diastole (LVIDd) und Systole (LVIDs) sowie des LV-Innenvolumens bei Diastole (LVEDV) und Systole wurde eine zweidimensionale (2D) und M-Modus-Kurzachsenansicht des parasternalen Standards verwendet (LVESV) und die Herzfrequenz (HR). Der LV EF wurde als ((LVEDV – LVESV) / ​​LVEDV) × 100 erfasst, der LV FS wurde als ((LVIDd – LVIDs) / LVIDd) × 100 erfasst und CO wurde als (LVEDV – LVESV) × HR erfasst. Für die Analyse der diastolischen Dysfunktion wurde eine apikale 2D-Ansicht mittels Pulswellen-Doppler verwendet. Früh- und spätdiastolische Geschwindigkeitsspitzenwellen (E bzw. A) wurden erkannt und das E/A-Verhältnis erfasst. Die Bildanalyse wurde offline mit Vevo LAB v.3.1.0 (VisualSonics) durchgeführt.

Frische Herzen wurden in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur eingebettet und in 10 μm große Abschnitte geschnitten. Nach einstündigem Trocknen an der Luft wurden die Objektträger 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, 15 Minuten lang mit 0,1 % Triton % Tween 20) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurden Gewebeschnitte über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Ratten-Anti-CD68 (1:250-Verdünnung; Abcam), Maus-Anti-CD163 (1:100-Verdünnung; Santa Cruz) und Ratten-Anti-TREM2 (1:100-Verdünnung) inkubiert ; R&D), Kaninchen-Anti-Tom20 (1:200-Verdünnung; Abcam), Ratten-Anti-LAMP1 (1:50-Verdünnung, DSHB) und cTnI (1:250-Verdünnung; Abcam). Nach dreimaligem Waschen mit PBST für jeweils 5 Minuten wurden die Objektträger 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert, anschließend dreimal mit DPBS gewaschen und mit DAPI-haltigem Blockierungsmittel versiegelt. Zur Analyse der Kardiomyozyten-Apoptose wurde eine TUNEL-Färbung mit einem TUNEL-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Bilder wurden mit dem konfokalen Olympus OSR-Mikroskop (OLYMPUS IX83-FV 3000-OSR) oder dem Zeiss LSM 880 (mit schnellem AiryScan) aufgenommen und mit der Software ImageJ Pro Plus v.6.0 (Media Cybernetics) verarbeitet.

Um die von Kardiomyozyten abgeleiteten Vesikel, die Mitochondrien enthalten, zu analysieren, wurden Proben von CardRED-Mäusen mit Kaninchen-Anti-Tom20-Primärantikörper (1:250-Verdünnung, Abcam) und Alexa-Fluor-488-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500-Verdünnung, Invitrogen) gefärbt ). Die Bilder wurden mit Zeiss LSM 880 (mit AiryScan) in einem Intervall von 0,38 μm pro Z-Schritt (z = 7–8 μm) für 3D-Rekonstruktionen aufgenommen. Eine 3D-Rekonstruktionsanalyse der oben genannten Experimente wurde mit der Imaris-Software v.9.7 (Bitplane) durchgeführt. Nach der Rekonstruktion von Kardiomyozyten, Vesikeln und Mitochondrien mithilfe eines Oberflächenwerkzeugs basierend auf 0,2-mm-Details und absoluter Intensität analysierten wir den Abstand zwischen Tom20+tdTomato+-Vesikeln und Kardiomyozyten, um zu zeigen, dass sich Vesikel außerhalb von Kardiomyozyten befanden. Dann haben wir Tom20+tdTomato+-Vesikel auf fünf zufälligen FOVs pro Probe quantifiziert.

Die Mt-Keima-Fluoreszenz wurde in zwei Kanälen durch zwei aufeinanderfolgende Anregungen (488 nm, grün; 561 nm, rot) unter Verwendung eines Zeiss LSM 880 (Zeiss LSM 880 mit schnellem AiryScan) abgebildet. Zum Vergleich unter verschiedenen Versuchsbedingungen wurden identische Bildgebungseinstellungen beibehalten. Alle Bilder wurden mit der Software ImageJ Pro Plus v.6.0 (Media Cybernetics) analysiert, um das Verhältnis der rot fluoreszierenden Proteinfläche zur grün fluoreszierenden Proteinfläche zu berechnen.

Alle verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Die gesammelten Herzproben wurden aus der vorderen Ventrikelwand entnommen und in 2-mm3-Würfel (2 × 1 × 1 mm) geschnitten. Diese Proben wurden 2 Tage lang bei Raumtemperatur in 2,5 % Glutaraldehyd (pH 7,2) fixiert. Anschließend wurden die Würfel nach Standardmethoden mit Epoxidpropanharz eingebettet. Die Schnitte wurden mit einem Tecnai G2 Spirit 120 kV TEM (Thermo FEI) mit einer ladungsgekoppelten Kamera beobachtet und gescannt.

Myokardiale Mitochondrien wurden mittels TEM beobachtet und semiquantitativ analysiert, wie zuvor beschrieben49. Fünf FOVs wurden zufällig für die Fotografie bei derselben Vergrößerung ausgewählt und ungefähr 20 Mitochondrien in jedem Feld wurden zufällig für die Analyse ausgewählt. Jede Probe wurde auf 100 Mitochondrien analysiert. Jedes Mitochondrium wurde entsprechend dem Grad der Verletzung auf einer Skala von 0–4 bewertet (höhere Werte deuteten auf eine schwerere Verletzung hin).

Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Serumlaktatspiegel mit einem Milchsäure-Assay-Kit (Nanjing Jiancheng) nachgewiesen, die Serum-LDH-Spiegel mit einem Laktatdehydrogenase-Assay-Kit (Nanjing Jiancheng) getestet und die Serum-cTnI-Spiegel mit einem Maus-cTnI-ELISA-Kit bestimmt ( Cloud-Klon). Der ATP-Gehalt im Herzen wurde mit einem ATP-Assay-Kit (Beyotime) gemessen und die ANP- und NT-proBNP-Spiegel im Serum wurden mit Maus-ELISA-Kits (USCN Life Science) bestimmt. Die IL-1β-, IL-6-, TNF-α- und CCL2-Proteinspiegel in Herzgewebelysaten wurden mithilfe von Maus-ELISA-Kits (NOVUS (IL-1β und IL-6) und MULTI SCIENCES (TNF-α und CCL2)) bestimmt.

Mäuse wurden durch Isofluran-Inhalation betäubt. Anschließend wurden die Herzen mit 20 ml Perfusionspuffer (1× DPBS mit 0,8 mM CaCl2) perfundiert, um peripheres Blut aus den Kammern zu entfernen. Anschließend wurden Vorhöfe und Klappen des isolierten Herzens entfernt und die Ventrikel in etwa 1 mm große Würfel zerkleinert. Die Herzen wurden mit 0,25 mg ml–1 Liberase TL (Sigma-Aldrich), 20 μg ml–1 DNase I (Sinopharm Chemical Reagent) und 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich) in serumfreiem DMEM (Gibco) bei 37 verdaut °C für 15 Min. Anschließend wurde die Gewebesuspension mit 1.000-μl-Mikropipetten verrieben. Die resultierende Zellsuspension wurde durch einen 70-μm-Filter zur Entfernung unverdauter Gewebemasse gewonnen, mit PBS mit 2 % FBS gewaschen und in 1 ml HBSS verdünnt. Dann wurde die Zellsuspension auf einer 15 % und 60 % Percoll (Yeason)-Deckschicht verteilt und einer Dichtegradientenzentrifugation bei 400 g für 20 Minuten unterzogen. Die Zellschicht zwischen den Flüssigkeitsoberflächen wurde gesammelt und mit 10 ml DPBS gewaschen, um Einzelzellsuspensionen für weitere Experimente zu erhalten.

Für die durchflusszytometrische Analyse wurden die Einzelzellsuspensionen 30 Minuten lang bei 4 °C mit relativen Antikörpern in einem Endvolumen von 200 μl angefärbt. Die Zellen wurden mit DPBS gewaschen, in einem Endvolumen von 400 μl resuspendiert und durch einen 40 μm-Filter filtriert. Die Proben wurden auf einem BD Fortessa (BD Biosciences) mit der BD FACSDiva-Software v.8.0.1 gesammelt und mit der FlowJo v.10.6.2-Software (TreeStar) analysiert. Einzelheiten zur Immunfärbung und Gating-Strategie von Immunzellen und kardialen Makrophagen-Subpopulationen im septischen Herzen sind in den Extended Data Abbs dargestellt. 2d und 3b.

Zur Messung der Mitochondrienfunktion wurden L-929-Fibroblasten als Kontrolle verwendet, um das Ansprechen auf die Behandlung im Vergleich zu isolierten Vesikeln zu bewerten. Oligomycin (Cell Signaling Technology, 5 μM) wurde eingesetzt, um die Hyperpolarisierung der Mitochondrienmembran zu fördern. Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon (Sigma-Aldrich, 2 μM) wurde angewendet, um die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien zu entkoppeln und mitochondriale Membranen zu depolarisieren. Sowohl isolierte Vesikel als auch L-929-Zellen wurden 1,5 Stunden lang bei 37 °C verabreicht. Anschließend wurden Zellen oder Vesikel in Kulturmedium, ergänzt mit 1× MitoNIR (Abcam), einer fluoreszierenden Sonde zur Messung des mitochondrialen Membranpotentials, 20 Minuten lang bei 37 °C gefärbt. Zellen oder Vesikel wurden von einem BD Fortessa (BD Biosciences) erworben. MFI wurde mit der FlowJo-Software (TreeStar) analysiert.

Wir bewerteten die Ki67-Expression, indem wir Zellen mit einem Foxp3-Transkriptionsfaktor-Färbepufferset (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers fixierten und permeabilisierten und dann die Zellen wie oben erwähnt mit Anti-Ki67-Antikörper färbten.

Zur FACS-Sortierung wurden die Einzelzellsuspensionen 30 Minuten lang bei 4 °C mit entsprechenden Antikörpern angefärbt und anschließend mit DPBS gewaschen. Pellets wurden mit 200 μl DPBS resuspendiert. Für scRNA-seq-Experimente wurden Calcein Blue AM (Thermo Fisher Scientific, 4 μg ml−1) und Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher Scientific, 10 μM) in 200 μl-Lösungen zugegeben und 10 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden lebende, kernhaltige CD45+-Zellen auf einem Beckman MoFlo Astrios EQ mit einer 100-μm-Düse (Beckman) erhalten. Für Mac1-Transplantationsexperimente wurden TREM2hi Mac1- (CD45+ CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) und Nicht-Mac1-Herzmakrophagen (CD45+CD11b+F4/80+ und Nicht-CD163+RETNLA+) sortiert und für weitere Experimente getrennt gesammelt.

Einzelne Zellen wurden in RPMI 1640 mit 5 % FBS gesammelt. Der Ausschluss von Trypanblau bestätigte die Lebensfähigkeit der Zellen. Die sortierten Zellen wurden gezählt und die Konzentration auf 700–1.200 Zellen μl-1 eingestellt. Dann wurden Einzelzellsuspensionen mit Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v.3 (10x Genomics) auf ein 10x Chromium geladen, um nicht mehr als 10.000 Einzelzellen einzufangen. Die Zellen wurden im Chromium-Instrument in Gelkügelchen aufgeteilt, wo Zelllyse und Barcode-Reverse-Transkription der RNA stattfanden. Es wurden DNA-Amplifikation und Bibliotheksaufbau durchgeführt. Die Bibliotheken wurden auf einem Novaseq 6000 (Illumina) von LC-Bio Technology sequenziert. Die Daten wurden mithilfe von CellRanger v.4.0 (10x Genomics) mit dem GRCm38-Referenzgenom abgeglichen.

Die CellRanger-Ausgabe wurde für unbeaufsichtigtes Clustering in Seurat (v.3.1.1) geladen. Alle Gene, die in weniger als einer Zelle exprimiert wurden, wurden entfernt. Zellen, die weniger als 200 und mehr als 6.000 Gene exprimieren, eindeutige molekulare Identifikatoren mehr als 40.000 zählen und der Prozentsatz der Genexpression der mitochondrialen DNA (mtDNA) mehr als 20 % beträgt, wurden ausgeschlossen. Mitochondriale Gene wurden aus der Expressionsmatrix ausgeschlossen.

Um die Daten zu visualisieren, verwendeten wir für die weitere Analyse das Seurat-Paket. Zunächst verwendeten wir die LogNormalize-Methode der Normalisierungsfunktion des Seurat-Pakets, um den Expressionswert von Genen zu bewerten. Zweitens führten wir eine Hauptkomponentenanalyse der normalisierten Expressionsmatrix mit hochvariablen Genen durch, die durch die Funktion FindVariableGenes identifiziert wurden. Basierend auf den zehn wichtigsten Hauptkomponenten haben wir das Ergebnis des unbeaufsichtigten Zellclusters durch die gewichtete, gemeinsam genutzte, auf einem Nächsten-Nachbarn-Graph basierende Clustering-Methode erhalten. Um Cluster-spezifische Gene zu erkennen, haben wir die Markergene mithilfe des Bimod (Likelihood-Ratio-Test) der FindAllMarkers-Funktion in Seurat identifiziert. Im Vergleich zu anderen Clustern wurden die Gene, deren Expression mehr als 25 % der Zellen betrug und deren durchschnittlicher Log (Fold Change) >0,26 im Zielcluster war, als Markergene definiert. Zelltypen wurden basierend auf bekannten Markern definiert. Zellen, die nicht-immune Zellmarker exprimierten, wurden ausgeschlossen.

Zell-Reclustering, Markergen-Visualisierung, DEG-Analyse, GO-Anreicherungsanalyse und andere bioinformatische Analysen wurden mit den OmicStudio-Tools (https://www.omicstudio.cn/tool) durchgeführt. DEGs wurden vom Bimod mit Standardparametern über die FindAllMarkers-Funktion unter den folgenden Kriterien identifiziert: (1) log (Faltungsänderung) > 0,26; (2) P-Wert <0,01; und (3) min.pct > 0,1.

Monozyten und Makrophagen aus den vier WT-Proben sind in Abb. 2a – d dargestellt. Abb. 4e, f zeigt Trem2-/-Proben und WT-Wurfgeschwister-Kontrollproben 7 Tage nach CLP, aggregiert und analysiert wie oben beschrieben, um den Einfluss von Trem2-/- auf das Monozyten-Makrophagen-Kompartiment zu vergleichen.

Für die Einzelzell-Trajektorienanalyse verwendeten wir Monocle v.2.4.0, um Entwicklungstrajektorien zwischen Makrophagen-/Monozyten-Untergruppen zu untersuchen19,27. scRNA-seq-Daten wurden mit dem Seurat-Tool skaliert, normalisiert und geclustert, dann auf 1.500 Zellen heruntergerechnet und in ein Monocle-Objekt geladen. Die DifferentialGeneTest-Funktion wurde verwendet, um DEGs aus jedem Cluster abzuleiten, und wir verwendeten die 800 besten Gene mit dem niedrigsten q-Wert, um die Zellen in der Pseudozeitanalyse zu sequenzieren. Die Entwicklungsbahn wurde mit dem Befehl plot_cell_trajectory aufgezeichnet. Der „root_state“ (der Startpunkt) der Trajektorie wurde als Terminal mit geringerer Expression von Monozytengenen definiert. Nachdem die Zelltrajektorien konstruiert wurden, wurden DEGs entlang der Pseudozeit von der DifferentialGeneTest-Funktion erkannt. Veränderungen in den Top-50-Genen durch Pseudozeit mit den niedrigsten q-Werten wurden durch eine Wärmekarte unter Verwendung der Funktion plot_pseudotime_heatmap visualisiert. Die Funktion Plot_genes_in_pseudotime wurde verwendet, um den dynamischen Trend der ausgewählten signifikanten Genexpressionsniveaus anzuzeigen.

CardRED-Mäuseherzen wurden in kleine Stücke geschnitten und in DPBS mit 0,25 mg ml–1 Liberase TL (Sigma-Aldrich), 20 μg ml–1 DNase I (Sinopharm Chemical Reagent) und 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich) für 15 verdaut min. bei 37 °C. Anschließend wurden Gewebesuspensionen durch vorsichtiges Pipettieren gewonnen. Wir haben diese Suspensionen nacheinander bei 50 g und 300 g zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde dann bei 1.000 g zentrifugiert und mit DPBS gewaschen. Pellets wurden mit 200 μl DPBS resuspendiert. Wir verwendeten die endogene Expression von tdTomato, CD31 und Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher Scientific, 10 μM), um Herzbläschen zu definieren. Die Gating-Strategie für Herzvesikel ist in Extended Data Abb. 6c dargestellt. Das Material wurde in einem Beckman MoFlo Astrios EQ (Beckman) mit einer 100-μm-Düse sortiert.

FACS-sortierte Zellen wurden mit DPBS gewaschen und quantifiziert. Herzmakrophagen (2 × 105 Zellen) wurden in 25 μl MG (Corning) resuspendiert. Nach der Betäubung und Intubation der Empfängermäuse wurde der Brustkorb der Mäuse geöffnet und MG, das Herzmakrophagen enthielt, mit einer 30-Gauge-Nadel in die Herzbeutelhöhle injiziert. Den Kontrolltieren wurden lediglich 25 µl MG intraperikardial injiziert.

Für Zellüberlebens- und Verteilungsexperimente wurden die sortierten Mac1- und Nicht-Mac1-Zellen 20 Minuten lang bei 37 °C mit CMTMR (50 nM) gefärbt und dann mit DPBS gewaschen. Markierte Makrophagen (2 × 105 Zellen) wurden in 25 μl MG resuspendiert und dann unmittelbar nach der CLP in die Perikardhöhle transplantiert. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet. Es wurden Herzproben entnommen und Kryoschnitte angefertigt. Die Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 880 (mit schnellem AiryScan) gemäß Standardverfahren aufgenommen und mit der Software ImageJ Pro Plus v.6.0 analysiert.

Das Gesamtprotein wurde mithilfe von RIPA (Applygen) aus dem Herzen der Maus isoliert und der Überstand wurde mit einem Antikörper-Mikroarray auf Glas- und Sandwich-Basis analysiert, um 20 Zytokine quantitativ zu messen (RayBiotech). Jedes Zytokin wurde pro Array vierfach analysiert. Anschließend wurden 100 µl Überstand in jede Vertiefung gegeben, über Nacht bei 4 °C inkubiert und anschließend gründlich gewaschen. Ein mit Biotin markierter Nachweisantikörper wurde 2 Stunden lang inkubiert, gefolgt von der Anwendung von AlexaFluor 555-konjugiertem Streptavidin bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Die Objektträger wurden mit einem InnoScan 300-Scanner (Innopsys) mit 532-nm-Anregung und 635-nm-Emission analysiert. Mit der Software Mapix v.7.3.1 haben wir Rohdaten (Bilder) vom Scanner erhalten und Punktintensitäten (tabulatorgetrennte TXT-Datei) integriert. Die Datenvisualisierung erfolgte durch Q-Analyzer Software (RayBiotech). Alle Rohdaten wurden zur statistischen Analyse log2-konvertiert.

Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS v.21.0 (IBM) oder Prism v.8.0 (GraphPad Software) durchgeführt. Zum Vergleich zwischen zwei Gruppen wurden normalverteilte Daten mit dem ungepaarten zweiseitigen Student-T-Test und Daten ohne Normalverteilung mit dem Mann-Whitney-U-Test ausgewertet. Für mehr als zwei Gruppen wurden normalverteilte Daten durch eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA ausgewertet, gefolgt von den Mehrfachvergleichstests nach Games-Howell, Sidak oder Tukey, und Daten ohne Normalverteilung wurden durch den Kruskal-Wallis-Mehrfachvergleich mit Dunn ausgewertet prüfen. Korrelationen wurden anhand des Pearson-Korrelationskoeffizienten analysiert. Die Überlebensrate wurde mittels Kaplan-Meier-Analyse und Log-Rank-Test analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median mit Interquartilbereich dargestellt

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

scRNA-seq-Daten für diese Studie wurden beim Gene Expression Omnibus unter dem Zugangscode GSE190856 hinterlegt. Alle Daten und Materialien sind in der Arbeit und den ergänzenden Informationen verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir widmen diese Arbeit Prof. Andreas Höft (Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Universitätsklinikum Bonn), der leider verstarb, bevor die Arbeit zur Veröffentlichung eingereicht wurde. Prof. Hoeft spielte eine wichtige Rolle in dieser Studie und wir danken ihm besonders für seinen Beitrag zur Konzeptualisierung. Wir danken außerdem D. Neculai (Abteilung für Zellbiologie und Abteilung für Pathologie, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine) und M. Guan (Institut für Genetik, Zhejiang University) für hilfreiche Diskussionen und sprachliche Ratschläge. Wir danken C. Yang (Center of Cryoelectron Microscopy, Zhejiang University); L. Xie und J. Li (Zentrum für Elektronenmikroskopie, Zhejiang-Universität); S. Liu, G. Xiao, J. Xuan, X. Song und Y. Li (Core Facilities, School of Medicine, Zhejiang University) für technische Unterstützung; L. Wang und H. Lou (Laboratory Animal Center, Zhejiang University) für Unterstützung bei Tierstudien; J. Zhao und J. Lin (Zweites angeschlossenes Krankenhaus der Zhejiang University School of Medicine) für Hilfe bei der Echokardiographie, X. Wang und H. Zhu (First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine) für Hilfe bei der Isolierung und Statistik von Kardiomyozyten Analyse. Wir danken auch den Mitarbeitern von LC-Bio Technology für die Sequenzierungsdienste. Diese Studie wurde teilweise von der Natural Science Foundation of China (82230074, 81720108025 an Entwicklungsprogramm Chinas (2018YFC2001904 bis XF und 2017YFE0196600 bis XL).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kai Zhang, Yang Wang, Shiyu Chen, Jiali Mao

Verstorben: Andreas Höft.

Abteilung für Anästhesiologie und Intensivmedizin, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, China

Kai Zhang, Yang Wang, Shiyu Chen, Jiali Mao, Yue Jin, Hui Ye und Xiangming Fang

Abteilung für Intensivmedizin, angegliedertes Hangzhou First People's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, China

Yang Wang

Das Kinderkrankenhaus, Nationales klinisches Forschungszentrum für Kindergesundheit, Medizinische Fakultät der Zhejiang-Universität, Hangzhou, China

Yan Zhang, Xiwang Liu, Chenchen Gong, Xuejun Cheng, Xiaoli Huang, Qixing Chen und Xuekun Li

Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Universitätsklinikum Bonn, Bonn, Deutschland

Andreas Höft

Das Institut für Translationale Medizin, School of Medicine, Zhejiang-Universität, Hangzhou, China

Xuekun Li

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KZ, YW, SC, JM und XF konzipierten und gestalteten das Projekt. KZ und YW führten Durchflusszytometriestudien durch und führten eine scRNA-seq-Analyse durch. KZSC, JM, HY, CG und YZ führten In-vivo-Studien durch. SC, JM, XL, YJ, XC und XH führten In-vitro-Experimente durch. YJ und SC führten eine statistische Analyse der Daten durch. AH lieferte wichtige Einblicke und Ratschläge. XF, XL, KZ, SC, QC und YW erhielten die Daten und verfassten das Manuskript. XF, XL und QC überwachten die Studie.

Korrespondenz mit Qixing Chen, Xuekun Li oder Xiangming Fang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Metabolism dankt Andres Hidalgo, José Ángel Nicolás und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handhabung: Ashley Castellanos-Jankiewicz, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

ad, Repräsentative Echokardiographiebilder (a) und EF% (b), FS% (c) und CO (d), gemessen durch Echokardiographie in Wildtyp-Mäusen (WT) im Steady State (SS), 1, 3, 7, und 21 Tage nach CLP (SS, n = 6 Mäuse; CLP 3 Tage, n = 6 Mäuse; CLP 7 Tage, n = 5 Mäuse; CLP 21 Tage, n = 6 Mäuse). e,f, Diagramme, die die Konzentrationen von cTnI (e) und LDH (f) im Serum zeigen. g,h, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Anp (g), Bnp (h) im Herzgewebe zeigen; n = 5-6 (e,f,g,h) Mäuse für jede Behandlung. i, Wärmekarte, die die skalierte Expression von 14 ausgewählten Zytokinen (Zeile) in 22 Herzgewebe-Lysatproben (Spalte) zeigt, gefärbt nach verschiedenen Bedingungen. In bh stellt jedes Symbol ein Tier dar und die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA bestimmt, gefolgt von Games-Howells (bd,f) oder Tukeys (g) Mehrfachvergleichstest, Kruskal-Wallis mit Dunns Mehrfachvergleichstest (e,h). Es werden genaue P-Werte angezeigt. Die Ergebnisse repräsentieren vier unabhängige Experimente (bh).

Quelldaten

a, Violindiagramme der durchschnittlichen Anzahl eindeutiger molekularer Identifikatoren (UMI) (links) und der Genzahlen (rechts) von scRNA-seq in verschiedenen Stadien der Sepsis. Jeder Punkt repräsentiert eine Zelle. b, UMAP-Diagramme, die die Expression ausgewählter Markergene für die definierten Zelltypen in Abb. 1c zeigen. c, Violindiagramme, die die Expression ausgewählter Markergene in allen definierten Zelltypen entsprechend Abb. 1c zeigen. d, Gating-Strategie der 10-Farben-Durchflusszytometrie zur Identifizierung verschiedener Arten von Immunzellen in Mäuseherzen. e, Diagramm, das den Prozentsatz der Herzimmunzellen während des Fortschreitens der Sepsis zeigt (n = 4 – 5 Mäuse für jede Behandlung). Jedes Symbol repräsentiert ein Tier in z. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden durch eine einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, bestimmt, ns, nicht signifikant. In e wurden die Experimente viermal durchgeführt.

Quelldaten

a, UMAP-Diagramme, die die Expression ausgewählter Markergene für die Monozyten-Makrophagen-Subpopulationen zeigen. b, Gating-Strategie für identifizierte Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+). c, Diagramm, das den Prozentsatz der CD163+RETNLA+-Herzmakrophagen während des Fortschreitens der Sepsis zeigt (SS, n = 8 Mäuse; CLP 3 Tage, n = 8 Mäuse; CLP 7 Tage, n = 9 Mäuse; CLP 21 Tage, n = 10 Mäuse). Jedes Symbol repräsentiert ein Tier. Die Balken zeigen den Mittelwert ± SEM. Zweiseitige P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Games-Howell bestimmt. d: Repräsentative Immunfluoreszenzbilder, die das Vorhandensein von CD163 (grün), CD68 (rot) und Kernen (blau) im Herzgewebe während des Fortschreitens der Sepsis zeigen. n = 6 Mäuse pro Gruppe. Maßstabsbalken, 20 μm. Es werden genaue P-Werte angezeigt. Die Ergebnisse repräsentieren vier unabhängige Experimente (c,d). SS, stationärer Zustand.

Quelldaten

a, Monokelvorhersage der Entwicklungsbahn des Monozyten-Makrophagen-Kompartiments mit entlang der Pseudozeit kartierter Zeit. b: Cluster-definierende Genexpression, aufgetragen entlang der Pseudozeit, mit Kartierung des Seurat-Clusters entlang. c, Schematische Darstellung der Abstammungsverfolgung von Mac1-Zellen in Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom-Mäusen. d, Repräsentative Konturdiagramme, die die Expression von tdTomato (CX3CR1) auf gesteuerten CD115+CD11b+-Blutmonozyten, CD45+CD11b+F4/80+-Herzmakrophagen, CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen zeigen, und Diagramm, das die Prozentsätze von tdTomato zeigt -markierte Zellen in diesen Zellen (0 Woche, n = 4 Mäuse; 1 Woche, n = 5 Mäuse; 3 Wochen, n = 5 Mäuse; 5 Wochen, n = 2 Mäuse; 6 Wochen, n = 3 Mäuse). Balken sind Mittelwerte ± SEM. e, Repräsentative Konturdiagramme, die die Expression von Ki67 auf gesteuerten CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen zeigen, und Diagramm, das den Prozentsatz von Ki67 zeigt, der in CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen im Steady State (SS) exprimiert wird. , 3 Tage und 7 Tage nach CLP. Jedes Symbol repräsentiert ein Tier. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Games-Howell bestimmt. Es werden genaue P-Werte angezeigt. Die Ergebnisse repräsentieren fünf (d) und zwei (e) unabhängige Experimente.

Quelldaten

a, Vulkandiagramme, die die Faltungsänderung der Genexpression (x-Achse, log2-Skala) und die p-Wert-Signifikanz (y-Achse, -log10-Skala) in der Mac1-Untergruppe des Steady State (SS) im Vergleich zur Mac2-Untergruppe (links), Mac3-Untergruppe zeigen (Mitte) oder Mac4-Teilmenge (rechts) von 3 Tagen nach CLP. Ausgewählte signifikante Gene wurden markiert. Zweiseitige P-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test bestimmt. b, Violindiagramme, die die Expression von Trem2 in allen definierten Immunzelltypen entsprechend Abb. 1c zeigen. c, Diagramm, das die Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der TREM2-Expression in CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ und CD45+CD11b+F4/80+(nicht-CD163+RETNLA+) Herzmakrophagen im Steady State zeigt und 7 Tage nach CLP (n = 8 Mäuse für jede Gruppe). Jedes Symbol repräsentiert ein Tier. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden von Kruskal-Wallis mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn bestimmt. d, UMAP-Diagramme, die Zellclusterungsergebnisse des Monozyten-Makrophagen-Kompartiments aus Herzen von WT-Wurfgeschwister-Kontrollen und Trem2-KO-Mäusen im Steady State und 3 Tage nach CLP zeigen. Monozyten-Makrophagen werden unter jeder Bedingung auf 1000 Zellen heruntergerechnet. Die von Seurat erhaltenen Subpopulationen waren hinsichtlich ihrer Markergene identisch mit den zuvor in Abb. 2a identifizierten. e, Balkendiagramme, die die Clusterverteilung der Monozyten-Makrophagen-Untergruppen in WT-Wurfgeschwister-Kontrollen und Trem2-KO-Mäusen im Steady State und 3 Tage nach CLP zeigen. f, Diagramm, das den Prozentsatz der kardialen Immunzellen in WT-Kontrollen und Trem2-KO-Mäusen 0, 3 und 7 Tage nach CLP zeigt (n = 4–5 Mäuse für jede Behandlung). Jedes Symbol stellt eine Maus dar. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die zweiseitigen P-Werte wurden durch den Mann-Whitney-U-Test bestimmt, ns, nicht signifikant. Die Ergebnisse stellen drei unabhängige Experimente dar (c,f).

Quelldaten

a, TEM-Bilder, die Vesikel in Herzen von WT-Mäusen 3 Tage nach CLP zeigen. b, TEM-Bilder, die interstitielle Mitochondrienvesikel des Herzens (rote Pfeilspitzen) von WT-Mäusen im Steady State (SS) oder 3 Tage nach CLP zeigen. Balkendiagramm, das die Anzahl der freien Mitochondrien pro Sichtfeld (FOV) zeigt. Jedes Symbol stellt ein FOV dar. Von jedem Tier (n = 3) werden fünf Sichtfelder zufällig für die Untersuchung ausgewählt. c, Schematische Darstellung der Gating-Strategie zum Sammeln von Vesikeln aus Mäuseherzen. d, Durchflusszytometrische Analyse gereinigter Vesikel, gefärbt mit den Mitochondrien-selektiven Sonden MitoTracker Green und MitoNIR (n = 3 pro Gruppe). e, Mitochondriales Membranpotential in Herzbläschen und kultivierten Fibroblasten, bewertet anhand der MFI-Spiegel von MitoNIR unter Grundbedingungen und in Gegenwart von depolarisierenden (FCCP) oder hyperpolarisierenden (Oligomycin) Wirkstoffen (n = 3–4 pro Gruppe). f, Pseudofarbige repräsentative TEM-Bilder von zwei mononukleären Zellen (grau), die 7 Tage nach CLP Vesikel mit Mitochondrien (braun) aus Kardiomyozyten (grün) von WT-Mäusen aufnehmen. g, Der Einbau von aus Kardiomyozyten stammendem tdTomato-Protein in CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen, CD45+CD11b+F4/80+ (Nicht-CD163+RETNLA+)-Makrophagen und CD45+CD11b+F4/80-LY6C+ Monozyten von αMHCCre/+ (Kontrolle) und αMHCCre/+:Rosa26TdTom (CardRED) Mäusen bei SS und 7 Tage nach CLP (Kontrollmäuse, n = 4; CardRED SS, n = 5; CardRED CLP 7d, n = 8). h, Der Einbau von aus Kardiomyozyten stammendem mt-Dendra2-Protein in CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+-Makrophagen, CD45+CD11b+F4/80+(Nicht-CD163+RETNLA+)-Makrophagen und CD45+CD11b+F4/80 -LY6C+ Monozyten aus αMHCCre/+ (Kontrolle) und αMHCCre/+:mtD2Flox/Flox (MitoCard) Mäusen bei SS und 7 Tage nach CLP (Kontrollmäuse, n = 4; MitoCard SS, n = 6; MitoCard CLP 7d, n = 6). i, Anteile von TUNEL+- und TUNEL+cTnI+-Zellen im Herzen von WT-Mäusen bei SS und 3 Tage nach CLP (n = 6 Mäuse pro Gruppe). Alle Maßstabsbalken sind in den Bildern angegeben. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (b, e, g, h, i) dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden durch den Mann-Whitney-U-Test (b) oder durch Kruskal-Wallis mit Dunns Mehrfachvergleichstest (e,g,h,i) bestimmt. Die Ergebnisse repräsentieren drei (a,b,d,gi) und zwei (e,f) unabhängige Experimente.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der mit dem AAV9-Tnnt2-mt-Keima-Virus markierten Kardiomyozyten-Mitochondrien. Rechtes Feld zeigt die mt-Keima-Fluoreszenzsignale in den Herzen von WT-Mäusen jeweils in den Wochen 0, 3 und 6 nach der Virusinfektion. Keima-markierte Mitochondrien wurden durch unterschiedliche Fluoreszenz in neutralen (Keima 458 nm; grün) und sauren (Keima 561 nm; rot) Umgebungen angezeigt. Maßstabsbalken, 20 μm. b, Streudiagramme, die die durchschnittlichen Expressionsniveaus (log10(FPKM+1)-Skala) der gesamten Makrophagenpopulationen von WT-Wurfgeschwister-Kontrollen (y-Achse) und Trem2-/--Mäusen (x-Achse) zeigen. c, Violindiagramme, die die ausgewählte endozytische Genexpression in Gesamtmakrophagen von WT-Wurfgeschwister-Kontrollen und Trem2-/--Mäusen zeigen. d, Studienprotokoll der Knochenmarktransplantation von WT- oder Trem2-/-Spendern in CardRED-Empfängermäuse. e,f, Repräsentative TEM-Bilder, die interstitielle Mitochondrienvesikel des Herzens von WT- und Trem2-/--Mäusen im Steady State (f) und 7 Tage nach CLP (e) zeigen, Maßstabsbalken, 5 μm. Balkendiagramm, das die Quantifizierung der Anzahl freier Mitochondrien pro Sichtfeld (FOV) zeigt. Jedes Symbol stellt ein FOV dar (n = 3 Mäuse für jede Behandlung). Für die Untersuchung werden von jedem Tier zufällig fünf Sichtfelder ausgewählt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (e, f) dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test (e, f) bestimmt. Die Ergebnisse stellen zwei unabhängige Experimente dar (e,f).

Quelldaten

ai-, WT- und Trem2-/--Mäuse wurden CLP unterzogen und die Herzfunktion wurde im Steady State (SS) und 3, 7 und 21 Tage nach CLP untersucht. Diagramm mit FS% (a); CO (b) gemessen durch Echokardiographie; Diagramm, das die LDH-Spiegel im Serum zeigt (c); Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Anp (d), Bnp (e), Tnfα (f), Il-1β (g), Ccl2 (h) und Il-6 (i) in den Herzgewebelysaten (ab, n = 7–) zeigen. 8 Mäuse; c, n = 6–8 Mäuse; di, n = 6–7 Mäuse für jede Behandlung). j, Studienprotokoll zur Knochenmarktransplantation (BMT) von WT- und Trem2-/-Spendern (CD45.2-Hintergrund) in WT-Empfänger (CD45.1-Hintergrund). k, Repräsentative Konturdiagramme der CD45.1- und CD45.2-Expression auf der gesteuerten CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ Mac1-Untergruppe in Empfängermäusen 1, 3, 5 und 8 Wochen nach der BMT. l, Diagramm, das die Prozentsätze von CD45.2+-Zellen in der CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ Mac1-Untergruppe nach BMT zeigt (n = 4–7 Mäuse für jede Gruppe).m, Repräsentative Konturdiagramme der TREM2-Expression auf gesteuertem CD45+CD11b +F4/80+CD163+-Makrophagen im Herzen von WT→WT-Chimären (Trem2+/+Ch) und Trem2-/-→WT-Chimären (Trem2-/-Ch) 8 Wochen nach BMT. Diagramm, das die Trem2-mRNA-Spiegel in Herzgewebelysaten zeigt (n = 6 Mäuse für jede Gruppe). n, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Anp und Bnp in den Herzgewebelysaten 7 Tage nach CLP zeigen (n = 11 Mäuse für jede Gruppe). o, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Tnfα, Il1β, Ccl2 und Il6 in den Herzgewebelysaten 7 Tage nach CLP zeigen (n = 11 Mäuse für jede Gruppe). Jedes Symbol repräsentiert ein Tier. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitige P-Werte wurden durch den Mann-Whitney-U-Test (ai,mo) oder durch Kruskal-Wallis mit Dunns Mehrfachvergleichstest (l) bestimmt. Die Ergebnisse repräsentieren mindestens vier (ai,l) und drei (mo) unabhängige Experimente.

Quelldaten

a: TREM2hi-Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) und Nicht-Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+ und Nicht-CD163+RETNLA+) wurden aus CD45.1-Mäusen isoliert. Mac1- oder Nicht-Mac1-Zellen (2 × 105 Zellen pro Maus) wurden mit Matrigel (MG) gemischt und jeweils in die Herzen von CD45.2-Mäusen transplantiert. Sieben Tage nach der Transplantation wurden Makrophagen aus den Herzen der Empfänger (CD45.2) mit einem Durchflusszytometrie-Assay analysiert. b,c, Diagramme, die den Prozentsatz der gesamten Mac1- (b) und CD45.1+ Mac1-Zellen (c) innerhalb der CD45+-Populationen aus den Herzen von Empfängern (CD45.2) 1, 3 und 7 Tag(e) nach der Zelle zeigen Transplantation (n = 6 Mäuse für jede Behandlung). d,e, Diagramme, die den Prozentsatz der gesamten Nicht-Mac1-Zellen (d) und CD45.1+-Nicht-Mac1-Zellen (e) innerhalb der CD45+-Populationen aus den Herzen von Empfängern (CD45.2) nach 1, 3 und 7 Tagen zeigen ) nach der Zelltransplantation (n = 5-6 Mäuse für jede Behandlung). f,g, TREM2hi Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) und Nicht-Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+ und Nicht-CD163+RETNLA+) wurden aus den Herzen von WT-Mäusen gewonnen FACS und gefärbt durch CMTMR. Anschließend wurden beide Zelltypen (2 × 105 Zellen/Maus gemischt mit Matrigel) jeweils unmittelbar nach der CLP in die Herzbeutelhöhle der Empfängermäuse injiziert. f, Repräsentative Immunfluoreszenzbilder, die die transplantierten Zellen im Epikard (Epi), Intermyokard (Inter) und Endokard (Endo) von Empfängermäusen 3 Tage nach der Zelltransplantation zeigen. CMTMR-Signale (rot), die Mac1- oder Nicht-Mac1-Zellen anzeigen; Epikardschicht (EL); Myokard (Myo); innere Schicht (IL). Maßstabsbalken, 20 μm. g: Repräsentative Immunfluoreszenzbilder, die die transplantierten CMTMR-markierten Mac1-Zellen in MitoCard-Mäusen 3 Tage nach CLP zeigen. 3D-Rekonstruktionsbilder des gestrichelten Kastenbereichs, die veranschaulichen, dass von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mtDendra2+, grün) in den transplantierten Zellen (CMTMR+, rot) vorhanden sind. Kerne wurden blau dargestellt (DAPI). Maßstabsbalken, 10 μm. n = 6 Mäuse pro Gruppe (f,g). Balken zeigen den Mittelwert ± SEM. Zweiseitige P-Werte wurden durch einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichen bestimmt (be). Die Ergebnisse repräsentieren vier (be) und zwei (f,g) unabhängige Experimente.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der Transplantation von Mac1-Zellen in Trem2-/- Mäusen. Aus WT- und Trem2-/--Mäusen isolierte Mac1-Zellen (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) wurden jeweils mit Matrigel (MG) gemischt und dann in die Perikardhöhle von Trem2-/--Mäusen transplantiert (2×). 105 Zellen/Tier) unmittelbar nach CLP. Kontrollmäusen wurde nur MG injiziert. Die Mäuse wurden 3 oder 7 Tage nach der Transplantation analysiert. bd, Diagramme, die EF% (b), FS% (c) und CO (d) zeigen, gemessen durch Echokardiographie. e,f, Diagramme, die die Konzentrationen von cTnI (e) und LDH (f) im Serum zeigen. g,h, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Anp (g) und Bnp (h) in den Herzgewebelysaten zeigen. i,j, Diagramme, die die mRNA-Spiegel von Tnfα, Il1β, Ccl2 und Il6 in den Herzgewebelysaten 3 (i) und 7 (j) Tage nach CLP zeigen. k, Diagramm, das den ATP-Gehalt in Herzgewebelysaten zeigt. l, Diagramme, die den Serumlaktatspiegel zeigen. bl, jedes Symbol stellt ein Tier dar (n = 6 Mäuse für jede Behandlung). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitige P-Werte von Kruskal-Wallis mit Dunns Mehrfachvergleichstest, ns, nicht signifikant. m, Schematische Darstellung, die TREM2hi Mac1-Phagozytosen zeigt. Von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien schützen das septische Herz. scRNA-seq deckt eine Untergruppe von Herzmakrophagen auf, die TREM2 und CD163 stark exprimierte; Sepsis stimuliert die Freisetzung massiv von Kardiomyozyten abgeleiteter Mitochondrien; TREM2hi-Mac1-Zellen reinigen defekte Mitochondrien und schützen das septische Herz. Die Ergebnisse stellen zwei (bl) unabhängige Experimente dar.

Quelldaten

Ergänzende Tabellen 1–3 und Legenden für ergänzende Videos 1–6.

Sepsis induziert die Freisetzung von aus Kardiomyozyten stammenden Exophern. Die 3D-Rekonstruktion von Herzschnitten von CardRED-Mäusen zeigt das Vorhandensein von Mitochondrien (Tom20, cyan) in von Kardiomyozyten abgeleiteten Exophern (rot) und die Ansammlung von mit Tom20 kolokalisierten Tomato+-Exophern in septischen Herzen.

Mac1-Zellen nehmen in SICM kardiale Exopher auf, die Mitochondrien enthalten. 3D-Rekonstruktion der Herzschnitte von CardRED-Mäusen. Mac1-Zellen (TREM2, grün) phagozytierten von Kardiomyozyten abgeleitete Exopheren (rot). Zu den Exophern in Mac1-Zellen gehörten Mitochondrien (Tom20, weiß).

Übertragung von Mitochondrien aus Kardiomyozyten auf Mac1-Zellen. 3D-Rekonstruktion der Herzschnitte von MitoCard-Mäusen. Mac1-Zellen (TREM2, rot) nahmen von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mtDendra2, grün) auf.

Von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien, die mit LAMP1+-Phagolysosomen in Mac1-Zellen verarbeitet wurden. 3D-Rekonstruktion der Herzschnitte von MitoCard-Mäusen. Von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mtDendra2, grün), die von Mac1-Zellen (TREM2, rot) phagozytiert werden und teilweise in Lysosomen lokalisiert sind (LAMP1, weiß).

Ein Trem2-Mangel beeinträchtigt die Aufnahme von aus Kardiomyozyten stammenden Mitochondrien durch die Mac1-Untergruppe im septischen Herzen. Teil 1: Schematische Darstellung der mit dem AAV9-Tnnt2-mt-Keima-Virus markierten Kardiomyozyten-Mitochondrien. Keima-markierte Mitochondrien wurden durch unterschiedliche Fluoreszenz in neutralen (Keima 458 nm, grün) und sauren (Keima 561 nm, rot) Umgebungen angezeigt. Teil 2: Die 3D-Rekonstruktion zeigte, dass TREM2+-Makrophagen (grün) von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mtKeima-458, cyan) und einige Mitochondrien in einer sauren Umgebung (mtKeima-561, rot) in den Herzen von AAV9-Tnnt2-mt-Keima aufnahmen -infizierte Mäuse. Teil 3: CD163+-Makrophagen (grün) nahmen von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mtKeima-458, cyan; mtKeima-561, rot) in Herzen von WT- und Trem2−/−-Mäusen auf, die mit AAV9-Tnnt2-mt-Keima infiziert waren.

Transplantierte Mac1-Zellen verschlingen in SICM von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien. 3D-Rekonstruktion der Herzschnitte von MitoCard-Mäusen. Injizierte Mac1-Zellen (CMTMR, rot) phagozytierte von Kardiomyozyten abgeleitete Mitochondrien (mtDendra2, grün).

Einzelzell-RNA-seq-Daten und statistische Quelldaten.

Einzelzell-RNA-seq-Daten und statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Statistische Quelldaten.

Einzelzell-RNA-seq-Daten und statistische Quelldaten.

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Einzelzell-RNA-seq-Daten und statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, K., Wang, Y., Chen, S. et al. TREM2hi-residente Makrophagen schützen das septische Herz, indem sie die Homöostase der Kardiomyozyten aufrechterhalten. Nat Metab 5, 129–146 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00715-5

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Eingegangen: 04. Februar 2022

Angenommen: 22. November 2022

Veröffentlicht: 12. Januar 2023

Ausgabedatum: Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00715-5

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Aktuelle kardiologische Berichte (2023)