Produktion von rekombinantem humanem IgG1-Fc mit nützlichem N

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 589 (2023) Diesen Artikel zitieren

445 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Intravenöses Immunglobulin (IVIG) ist ein aus Plasma gewonnenes polyklonales IgG, das zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt wird. Studien zeigen, dass die α-2,6-Sialylierung des Fc die entzündungshemmende Aktivität verbessert. Außerdem blockiert die Afucosylierung des Fc effizient FcγRIIIA, indem sie die monovalente Affinität zu diesem Rezeptor erhöht, was für die Behandlung refraktärer Immunthrombozytopenie (ITP) von Vorteil sein kann. Hier haben wir genomeditierte Hühner erzeugt, die menschliches IgG1-Fc in der Leber synthetisieren und α-2,6-sialyliertes und niedrig-fucosyliertes menschliches IgG1-Fc (rhIgG1-Fc) in Serum und Eigelb absondern. Außerdem hat rhIgG1 Fc eine höhere Affinität für FcγRIIIA als kommerzielles IVIG. Somit hemmt rhIgG1 Fc effizient die durch Immunkomplexe vermittelte FcγRIIIA-Vernetzung und die anschließende ADCC-Reaktion. Darüber hinaus übt rhIgG1 Fc in einem passiven ITP-Modell eine entzündungshemmende Aktivität aus, was zeigt, dass rhIgG1 Fc aus Hühnerleber die Wirksamkeit von IVIG erfolgreich rekapituliert. Diese Ergebnisse zeigen, dass genomeditierte Hühner als Produktionsplattform für rhIgG1-Fc mit vorteilhaftem N-Glykosylierungsmuster für entzündungshemmende Aktivitäten verwendet werden können.

Autoimmunerkrankungen (ADs) werden durch eine fehlerhafte Immunantwort gegen körpereigene Antigene verursacht1. Im Allgemeinen lösen Autoantikörper, die Selbstantigene erkennen, Entzündungsreaktionen aus, indem sie Effektorzellen wie Makrophagen, Neutrophile und natürliche Killerzellen aktivieren, was zur Zerstörung von Geweben oder Zellen führt2. Daher ist es für die Behandlung von Alzheimer wichtig, die Aktivierung von Effektorzellen zu hemmen und Entzündungsreaktionen zu dämpfen. Das entzündungshemmende Mittel intravenöses Immunglobulin (IVIG) wird häufig zur Behandlung entzündlicher ADs3 eingesetzt. Wenn IVIG in hohen Dosen (d. h. 1–2 g/kg) infundiert wird, kann es bei Patienten mit Immunthrombozytopenie (ITP) Entzündungen lindern und die Thrombozytenzahl wiederherstellen4. Da IVIG eine entzündungshemmende Wirkung gegen zahlreiche ADs zeigt, steigt die weltweite Nachfrage kontinuierlich5. Da IVIG jedoch aus gespendetem menschlichem Plasma hergestellt wird, stellen Lieferengpässe und hohe Kosten große Einschränkungen dar6. Daher ist es wünschenswert, ein effizientes System für die Produktion und Bereitstellung von IVIG-Alternativen zu entwickeln, das die entzündungshemmende Wirkung von aus Plasma gewonnenem IVIG rekapituliert.

Obwohl IVIG über verschiedene Mechanismen wirkt, ist sein Fc-Fragment für die entzündungshemmende Aktivität von entscheidender Bedeutung7,8,9. Es ist bekannt, dass α-2,6-sialyliertes Fc die Expression von FcγRIIB in Effektormakrophagen fördert, indem es die Sekretion von TH2-Zytokinen wie IL-33 und IL-4 fördert, und das reichliche Verhältnis von α-2,6-sialyliertem Fc erhöht die Anti- Entzündungsaktivität von IVIG signifikant10,11,12,13,14,15. Daher ist stark α-2,6-sialyliertes Fc eine potenzielle IVIG-Alternative, die eine erhöhte entzündungshemmende Aktivität zeigt.

Der andere Hauptmechanismus, der der Aktivität von IVIG zugrunde liegt, ist die kompetitive Blockade der Aktivierung von Fcγ-Rezeptoren (FcγRs)7,16. Wenn IVIG in hohen Dosen verabreicht wird, besetzt es aktivierende FcγRs und verhindert, dass Immunkomplexe diese Rezeptoren binden und vernetzen17,18. Insbesondere ist die entzündungshemmende Aktivität von IVIG FcγRIIIA-abhängig, was darauf hindeutet, dass die Blockierung von FcγRIIIA ein potenzieller Mechanismus der IVIG-Aktivität ist19,20,21. Diese Annahme wird durch eine Studie gestützt, die zeigt, dass die Blockade von FcγRIIIA durch monoklonale Antikörper die IVIG-Aktivität rekapituliert und Entzündungsreaktionen bei refraktären ITP-Patienten wirksam lindert, obwohl die FcγRIIIA-Vernetzung zu unerwünschten Nebenwirkungen führt22. Da das Fehlen einer Kernfucosylierung (Afucosylierung) die monovalente Affinität von IgG zu FcγRIIIA23 deutlich erhöht, kann davon ausgegangen werden, dass afucosyliertes Fc FcγRIIIA effizient besetzt und sich positiv auf die Auslösung entzündungshemmender Aktivität und die Behandlung refraktärer ITP auswirkt. Kürzlich wurde gezeigt, dass FcγRIIIA von NK-Zellen reichlich mit afucosyliertem IgG24 besetzt war. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass afucosylierte Antigen-aspezifische Antikörper FcγRIIIA effizient blockieren und entzündungshemmend wirken können, indem sie die Fc-Effektorfunktionen von Antigen-spezifischen Antikörpern hemmen25.

Wenn wir daher eine hIgG1-Fc-Region erzeugen können, die einen hohen Anteil an α-2,6-sialylierten N-Glykanen aufweist und gleichzeitig über Afucosylierung eine hohe Affinität für FcγRIIIA aufweist, können wir die vielfältigen Wirkungsweisen von IVIG hervorrufen und dadurch die Anti- entzündliche Aktivität. Allerdings enthält aus Plasma gewonnenes IVIG geringe Mengen an sialyliertem Fc (etwa 10 % der gesamten N-Glykane) und hat einen großen Anteil an fucosylierten N-Glykanen26. Rekombinantes hIgG1-Fc aus Säugetierzellkulturen weist ebenfalls geringe Mengen an sialylierten und hohe Mengen an fucosylierten Glykanen auf, es sei denn, es werden spezifische Modifikationen an den exprimierenden Zelllinien vorgenommen27. Daher ist für die Entwicklung einer IVIG-Alternative mit erhöhter entzündungshemmender Aktivität ein alternatives System zur Produktion von hIgG1-Fc erforderlich, das einen hohen Anteil an α-2,6-sialylierten und afucosylierten N-Glykanen enthält.

Hühner sind eine effiziente Plattform für die Produktion von Biopharmazeutika; Dies liegt daran, dass Hühnereier reichlich Proteine enthalten und Hühner pro Jahr über 300 Eier legen28. Außerdem ähnelt das Glykosylierungsmuster von Hühnereiproteinen dem von menschlichen Proteinen, und was noch wichtiger ist, Hühner produzieren nur menschenähnliche Glykane und keine immunogene α-Galaktose und Neu5Gc28,29. Aus diesen Gründen wurden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der Anreicherung von Biopharmazeutika in Eiern, insbesondere Eiweiß, untersucht30,31,32,33,34,35,36,37. Mittlerweile wird der Großteil der Eigelbproteine in der Leber synthetisiert und aus dem Blutkreislauf übertragen, wenn das Eigelb im Eierstock zu reifen beginnt. Hühnerleber exprimiert hohe Konzentrationen an α-2,6-Sialyltransferase (ST6GAL1), und es wird angenommen, dass Hühnerleber sehr niedrige Konzentrationen an Fucosyltransferase (FUT8) aufweist; Dies liegt daran, dass die meisten N-Glykane im Eigelbprotein afucosyliert sind38,39. Daher wird erwartet, dass in Hühnerleber synthetisierte Proteine eine stark α-2,6-sialylierte und afucosylierte N-Glykanstruktur aufweisen und dass diese Proteine im Blutkreislauf zirkulieren und sich letztendlich im Eigelb ansammeln40. Wenn also hIgG1-Fc auf Hühnerleber-spezifische Weise synthetisiert werden kann, kann hIgG1-Fc aus Serum und Eigelb mit einem hohen Maß an α-2,6-Sialylierung und -Afucosylierung gewonnen werden, was sich positiv auf die entzündungshemmende Aktivität auswirkt.

Hier berichten wir über die Entwicklung genomeditierter Hühner, die menschliches IgG1-Fc leberspezifisch absondern. Zu diesem Zweck markierten wir die kodierende Sequenz von menschlichem IgG1 Fc mit dem Albumin (ALB)-Gen, einem wichtigen Serumprotein, das in der Leber exprimiert wird, und erzeugten genomeditierte Hühner (im Folgenden als ALB::hIgG1 Fc-Hühner bezeichnet). . Zur Markierung verwendeten wir selbstspaltendes 2A-Peptid des Thatsa-Asigna-Virus (T2A) zwischen ALB- und IgG1-Fc-Kodierungssequenzen, wodurch IgG1-Fc nach der Translation von ALB getrennt werden kann. Mit dieser Strategie produzierten wir effizient hochgradig α-2,6-sialyliertes und afucosyliertes menschliches IgG1-Fc in Hühnerserum und letztendlich in Eigelb. Das rekombinante humane IgG1 Fc (rhIgG1 Fc), das von ALB::hIgG1 Fc-Hühnern stammt, hat die FcγRIIIA-Blockierungsaktivität verbessert und die entzündungshemmenden Aktivitäten von IVIG in vivo erfolgreich rekapituliert. Daher zeigen wir hier, dass genomeditierte Hühner, die hIgG1 Fc leberspezifisch exprimieren, eine potenzielle alternative Quelle für IVIG zu menschlichem Plasma sein können.

Um rhIgG1 Fc in Serum und Eigelb zu akkumulieren, haben wir mit Albumin (ALB)::hIgG1 Fc genomeditierte Hühner mithilfe der CRISPR/Cas9-NHEJ-vermittelten Genomeditierungstechnologie in primordialen Keimzellen (PGCs) von White Leghorn (WL) erzeugt, wie bereits berichtet41 ,42. Um die hIgG1-Fc-Kodierungssequenz (CDS) in das ALB-Gen einzuführen, konstruierten wir ein CRISPR/Cas9-Plasmid, das Intron 13 des ALB-Gens erkennt, und ein Donorplasmid, das Intron 13 und Exon 14 (ohne Stoppcodon) des ALB enthält Gen, gefolgt von der T2A-Sequenz und dem hIgG1-Fc-CDS, das das hIgG1-Gelenk und die CH2- und CH3-Domänen enthält (Abb. 1a). T2A ist eines der viralen 2A-Selbstspaltungspeptide, die das Fehlen der Bildung von Peptidbindungen während der Translation bewirken und so die gleichzeitige Expression von zwei verschiedenen Proteinen ermöglichen43. Obwohl die Spaltungseffizienz von 2A-Peptiden nicht 100 % betrug44, wollten wir rhIgG1 Fc mithilfe von T2A von ALB trennen, ohne die ALB-Bildung und -Sekretion zu beeinträchtigen, und so unbekannte schädliche Auswirkungen durch ALB-Depletion verhindern.

a Schematische Darstellung des Spenderplasmids, das die kodierende Sequenz für menschliches IgG1 Fc (hIgG1 Fc) zur Markierung des Albumin (ALB)-Gens enthält. Der Donorvektor umfasst ALB-Intron 13, ALB-Exon 14 ohne Stoppcodon, die T2A-Sequenz, die kodierende Sequenz des ALB-Signalpeptids (sig pep), die kodierende Sequenz für hIgG1 Fc, die ALB 3' UTR und eine Puromycin-Resistenz (PuroR). Gen. Als der Donorvektor und die Single Guide RNA (sgRNA), die auf das ALB-Intron 13 abzielt, in primordiale Keimzellen (PGCs) co-transfiziert wurden, wurde der Donorvektor in die sgRNA-Zielstelle eingefügt. Das resultierende modifizierte Allel enthält das ALB-Exon 14 ohne das Stoppcodon, die T2A-Kodierungssequenz, die ALB-Signalpeptid-Kodierungssequenz und die hIgG1-Fc-Kodierungssequenz. b Knock-in (KI)-Validierung von PGCs nach Puromycin-Selektion unter Verwendung von Primern, die für die 5'-Verbindung und die 3'-Verbindung spezifisch sind. c Sequenzanalyse von drei TA-klonierten PCR-Produkten der 5'-Verbindung und der 3'-Verbindung genomeditierter PGCs. d Produktion von Spender-PGC-abgeleiteten Nachkommen durch Testkreuzung. e Sequenzanalyse von drei TA-klonierten PCR-Produkten der 5'-Verbindung und der 3'-Verbindung von drei genomeditierten ALB::hIgG1 Fc-G1-Nachkommen.

Nach der Transfektion von CRISPR/Cas9 und Spenderplasmiden wurden genomeditierte PGCs durch Puromycin-Selektion ausgewählt. Die Integration des Spenderplasmids in ausgewählte PGCs wurde durch PCR und Sequenzanalyse der 5'- und 3'-Verbindung zwischen den endogenen und Spenderplasmidsequenzen validiert; Dies bestätigte, dass das Spenderplasmid mit mehreren Indels erfolgreich an der Zielstelle integriert wurde (Abb. 1b, c). Diese etablierten genomeditierten WL-PGCs wurden in koreanische Ogye (KO)-Empfängerembryonen transplantiert. Nach der Geschlechtsreife wurden zwei Empfänger-KO-Männchen mit Wildtyp-WL-Hühnern getestet, und die von der Spender-PGC abgeleiteten G1-Nachkommen wurden geschlüpft (Abb. 1d und Ergänzungstabelle 1). Aus den von Spender-PGC abgeleiteten G1-Nachkommen erhielten wir ALB::hIgG1-Fc-Nachkommen, bei denen die Integration des Spenderplasmids durch 5'- und 3'-Verbindungs-spezifische PCR und Sequenzanalyse genomischer DNA validiert wurde. Bei genomeditierten Nachkommen wurde das Donorplasmid erfolgreich integriert, mit einer Ein-Basenpaar-Insertionsmutation sowohl an der 5'- als auch an der 3'-Verbindungsstelle (Abb. 1e).

Als nächstes wurde ein geschlechtsreifer heterozygoter G1-Hahn (ALB+/hIgG1 Fc) mit Wildtyp-Hühnern (ALB+/+) gepaart, und es wurden G2 ALB::hIgG1 Fc-Nachkommen (ALB+/hIgG1 Fc) geschlüpft. Nach der Geschlechtsreife wurden diese heterozygoten G2-Nachkommen gepaart und die G3-Nachkommen wurden erfolgreich ausgebrütet. Die Genotypisierung der G3-Nachkommen bestätigte, dass homozygote ALB :: hIgG1 Fc-Nachkommen (ALB hIgG1 Fc / hIgG1 Fc) gemäß der Mendelschen Vererbung erfolgreich erzeugt wurden (ergänzende Abbildung 1a, b). Obwohl die Konzentration von ALB im Serum bei homozygoten Hühnern tendenziell abnahm, beobachteten wir, dass homozygote Hühner auch ALB ins Blut absondern, gesund sind, die Geschlechtsreife erreichen und Eier legen (Ergänzende Abbildungen 2a – c, e). Diese Ergebnisse zeigen, dass ALB::hIgG1 Fc-Hühner erfolgreich produziert werden können, dass sie die Geschlechtsreife erreichen und Eier legen.

Um das Expressionsmuster von hIgG1-Fc-Transkripten in ALB::hIgG1-Fc-Hühnern zu identifizieren, extrahierten wir RNA aus mehreren Organen und bestätigten die Expression von hIgG1-Fc-Transkripten durch RT-PCR. Als Ergebnis identifizierten wir eine starke Expression von rhIgG1-Fc-Transkripten in der Leber (Abb. 2a), was darauf hindeutet, dass rhIgG1-Fc erfolgreich auf leberspezifische Weise transkribiert wurde.

a Validierung der Expression des hIgG1-Fc-Transkripts durch RT-PCR von Gewebe aus mehreren Organen, die von Wildtyp- und ALB::hIgG1-Fc-Genom-editierten Hühnern stammen. b Validierung der rhIgG1-Fc-Sekretion in Serum und Eigelb von genomeditierten ALB::hIgG1-Fc-Hühnern durch Western Blot. Den Proben wurde β-Mercaptoethanol zugesetzt, um Disulfidbindungen aufzubrechen (reduzierende Bedingungen). Als Negativkontrolle wurde Wildtyp-Hühnerserum verwendet. c Konzentration von rhIgG1 Fc im Serum von heterozygoten ALB+/hIgG1 Fc-Küken 4, 18 und 40 Wochen nach dem Schlüpfen. Jeder Punkt repräsentiert einzelne Hühner. (n = 5–12 unabhängige Proben) d Konzentration von rhIgG1-Fc in heterozygoten ALB+/hIgG1-Fc-Eidottern 24, 30 und 36 Wochen nach dem Schlüpfen. Jeder Punkt repräsentiert einzelne Eigelbe. (n = 6–8 unabhängige Stichproben) Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einfaktorielle ANOVA bestimmt. ns, nicht signifikant. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Als nächstes haben wir Serum und Eigelb entnommen und die Sekretion von rhIgG1 Fc durch Western Blot validiert (Abb. 2b). Die Daten bestätigten die Sekretion von hIgG1-Fc in den Blutkreislauf und das Eigelb (Abb. 2b). Unter nicht reduzierenden Bedingungen wurde sowohl im Serum als auch im Eigelb eine Bande nachgewiesen, die mit rhIgG1 Fc ((CH2 + CH3)2) übereinstimmt. Unter reduzierenden Bedingungen wurde eine Bande von etwa 35 kDa nachgewiesen, was größer ist als die erwartete Molekülmasse von deglykosyliertem CH2 + CH3 (25 kDa) (Abb. 2b). Dieses Ergebnis zeigt, dass rhIgG1 Fc in seiner glykosylierten Form in das Serum und Eigelb sezerniert wird. Interessanterweise wurde im Serum unter reduzierenden Bedingungen auch eine große Bande von etwa 110 kDa (im Einklang mit der Molekülmasse von ALB + T2A + CH2 + CH3) sowie die ALB-Fc-Fusion (eine große Bande von > 100 kDa) nachgewiesen ) unter nicht reduzierenden Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die T2A-Spaltung nicht vollständig durchgeführt wurde (Abb. 2b). Im Gegensatz zum Serum wurde im Eigelb sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen nur rhIgG1 Fc nachgewiesen (Abb. 2b).

Als nächstes überprüften wir die rhIgG1-Fc-Konzentration im Serum und Eigelb von G2-heterozygoten ALB+/hIgG1-Fc-Hühnern. Die durchschnittliche rhIgG1-Fc-Konzentration im Serum heterozygoter ALB+/hIgG1-Fc-Nachkommen betrug 4, 18 und 40 Wochen nach dem Schlüpfen 170,70 ± 71,65 (n = 8) μg/ml, 162,98 ± 27,34 (n = 12) μg/ml. bzw. 149,39 ± 42,34 μg/ml (n = 5) (Abb. 2c). Die rhIgG1-Fc-Konzentration im Eigelb von G2-heterozygoten ALB+/hIgG1-Fc-Hühnern betrug durchschnittlich 152,85 ± 85,87 (n = 7) μg/ml, 149 ± 45,52 (n = 8) μg/ml und 143,89 ± 55,57 (n =). 6) μg/ml nach 24, 30 bzw. 36 Wochen (Abb. 2d). Außerdem haben wir bestätigt, dass rhIgG1 Fc kontinuierlich in den Blutkreislauf ausgeschieden wird, unabhängig von der Nachkommenschaft in mehreren Generationen (Ergänzungstabelle 2). Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass rhIgG1 Fc auch im Serum und Eigelb homozygoter ALBhIgG1 Fc/hIgG1 Fc-Hühner sezerniert und angereichert wird (ergänzende Abbildungen 2d und e). Diese Ergebnisse zeigen, dass ALB::hIgG1 Fc-Hühner rhIgG1 Fc effizient in Serum und Eigelb absondern.

Um das Muster der N-Glykosylierung auf rhIgG1-Fc zu untersuchen, das von ALB::hIgG1-Fc-Hühnern stammt, haben wir rhIgG1-Fc aus Serum und Eigelb mithilfe der Protein-A-Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie gereinigt. rhIgG1 Fc wurde sowohl aus Serum als auch aus Eigelb erfolgreich gereinigt. (Abb. 3a). Als nächstes wurden N-Glykane durch Verdauung mit PNGase F entfernt und mittels UPLC-MS/MS analysiert. Im Fall von rhIgG1 Fc, das aus Serum gereinigt wurde, identifizierten wir sechs Arten von N-Glykanen, und alle waren biantennäre und afucosylierte komplexe Formen (Abb. 3b – d). Aus diesem N-Glykan-Profil haben wir den Prozentsatz der einzelnen N-Glykane ermittelt (Tabellen 1 und 2). Serum von jugendlichen weiblichen und männlichen Hühnern enthielt etwa 2,5 % degalaktosylierte G0-Glykoformen, wohingegen der Großteil der N-Glykane terminal galaktosyliert und sialyliert war (Abb. 3b und Tabelle 1). Unter diesen betrug die Gesamtzusammensetzung der N-Glykane im juvenilen weiblichen und männlichen Serum, das terminale Sialinsäurereste enthielt, 36,01 % bzw. 39,00 % (Tabelle 1). In ähnlicher Weise war sowohl im erwachsenen weiblichen als auch im männlichen Serum die degalactosylierte G0-Glykoform zu etwa 3,3 % und die terminale Sialinsäure zu etwa 28,66 % bzw. 34,44 % vorhanden (Abb. 3c und Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass ALB::hIgG1-Fc-Hühner höhere Mengen an sialyliertem und afucosyliertem rhIgG1-Fc ins Serum absondern.

Ein rhIgG1-Fc wurde mithilfe einer Protein-A-Säule und Größenausschlusschromatographie aus Serum und Eigelb gereinigt. Gereinigtes rhIgG1-Fc wurde auf einem 10 %igen SDS-PAGE-Gel laufen gelassen, das dann mit Coomassie-Brilliantblau-Lösung gefärbt wurde. b Das N-Glykosylierungsprofil von rhIgG1 Fc, gereinigt aus juvenilem Serum, c adultem Serum und d Eigelb, nach 24 und 40 Wochen, analysiert durch UPLC-MS/MS. e Sambucus nigra (SNA)-Lektin und Maackia amurensis-Lektin II (MAL II)-Blot von rhIgG1-Fc, gereinigt aus Serum und Eigelb. Aus CHO-Zellen stammendes rekombinantes Erythropoietin (EPO), das nur α-2,3-Sialinsäure enthält, wurde als Negativkontrolle für den SNA-Blot und als Positivkontrolle für den MAL II-Blot verwendet.

Als nächstes analysierten wir rhIgG1 Fc, das nach 24 und 40 Wochen aus Eigelb gereinigt wurde. Ursprünglich gingen wir davon aus, dass das N-Glykan-Profil von rhIgG1 Fc im Eigelb mit dem im Serum identisch sein würde, da Eigelbproteine aus dem Serum transportiert werden. Obwohl die wichtigsten N-Glykan-Typen mit denen im Serum identisch waren, identifizierten wir fünf zusätzliche kleinere N-Glykan-Typen: A3G1F, M3G1S1, M5A1S1F, A3G2S1F und M9. Diese machten 6,04 % bzw. 10,99 % der gesamten N-Glykane im Eigelb nach 24 bzw. 40 Wochen aus (Abb. 3d und Tabelle 2). Unter diesen waren kernfucosylierte N-Glykane mit 3,53 % bzw. 5,71 % der gesamten N-Glykane nach 24 bzw. 40 Wochen vorhanden (Tabelle 2). Der Prozentsatz der rhIgG1-Fc-N-Glykane, die terminale Sialinsäurereste enthielten, betrug 32,07 % bzw. 30,77 % nach 24 bzw. 40 Wochen (Tabelle 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass das N-Glykan-Profil von rhIgG1 Fc im Eigelb weitgehend mit dem im Serum übereinstimmt, jedoch mit einigen geringfügigen Unterschieden.

Als nächstes führten wir ein Lektin-Blotting mit HRP-markiertem Sambucus nigra-Lektin (SNA) und Maackia amurensis durch, um den Hauptbindungstyp zwischen terminaler Sialinsäure und Galaktoseresten zu identifizieren, der einer der Hauptfaktoren für die entzündungshemmende Aktivität von hIgG1 Fc11 ist Lektin II (MAL II), das spezifisch an α-2,6- bzw. α-2,3-verknüpfte Sialinsäurereste bindet. SNA-Blots zeigten ein starkes Signal sowohl für Serum- als auch für Eigelb-rhIgG1-Fc. Der MAL II-Blot zeigte jedoch ein vernachlässigbares Signal sowohl für Serum- als auch für Eigelb-rhIgG1-Fc, was darauf hindeutet, dass der Hauptbindungstyp α-2,6 ist (Abb. 3e). Diese Ergebnisse zeigen, dass hohe Mengen an α-2,6-sialyliertem und afucosyliertem rhIgG1-Fc von ALB::hIgG1-Fc-Hühnern effizient synthetisiert und sowohl aus Serum als auch aus Eigelb gereinigt werden können.

Zusätzlich wurde die Serumhalbwertszeit von ALB::hIgG1 Fc, aus Hühnern stammendem rhIgG1 Fc, aus HEK293T-Zellen stammendem rekombinantem Fc und IVIG in C57BL/6-Mäusen analysiert. Als Ergebnis wurde die Halbwertszeit von ALB::hIgG1 Fc, aus Hühnern stammendem rhIgG1 Fc und aus HEK293T-Zellen stammendem rekombinanten Fc zu 39,14 bzw. 36,37 Stunden bestimmt (ergänzende Abbildung 3).

Da verschiedene biologische Aktivitäten von IgG1 auf der Wechselwirkung zwischen seiner Fc-Region und Fcγ-Rezeptoren (FcγR) beruhen, haben wir die Dissoziationskonstante (KD) für die Bindung von rhIgG1 Fc an menschliche Fcγ-Rezeptoren vom Typ I (FcγRIA, FcγRIIA und FcγRIIIA) gemessen. dendritische zellspezifisches ICAM-Grabbing-Nonintegrin (DC-SIGN) (ein Rezeptor für α-2,6-sialyliertes Fc) und FcRn durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Die KD-Werte für die Bindung von rhIgG1 Fc an FcRn, FcγRIA und FcγRIIIA betrugen 9,088 × 10–9, 1,275 × 10–9 bzw. 9,980 × 10–9 M (Abb. 4a). Die KD-Werte für die Bindung von rhIgG1 Fc an FcγRIIA und DC-SIGN konnten jedoch nicht bestimmt werden, hauptsächlich aufgrund unspezifischer Bindung und geringer Affinität (ergänzende Abbildung 4 und Tabelle 3). Darüber hinaus haben wir die KD-Werte für die Bindung von kommerziellem IVIG an FcRn, FcγRIA und FcγRIIIA gemessen: Diese betrugen 2,142 × 10–8, 2,480 × 10–9 bzw. 2,870 × 10–7 M (Abb. 4a). . Anhand der ausgewerteten KD-Werte bestätigten wir, dass die Affinität von rhIgG1 Fc für FcγRIA und FcRn 1,94 bzw. 2,35-fach höher war als die von kommerziellem IVIG (Tabelle 3). Insbesondere war die Affinität von rhIgG1 Fc für FcγRIIIA 28,75-fach höher als die von kommerziellem IVIG (Tabelle 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass rhIgG1-Fc eine deutlich höhere monovalente Affinität zu FcγRIIIA aufweist als IVIG, was höchstwahrscheinlich auf seinen hohen Grad an Afucosylierung zurückzuführen ist.

a Sensorgramme, die die Bindung von IVIG und rhIgG1 Fc an FcRn, FcγRIA und FcγRIIIA zeigen (Biacore-Analyse). Die Bindung wurde unter Verwendung eines Steady-State-Gleichgewichtsmodells für FcRn und einer Einzelzykluskinetik für FcγRIA und FcγRIIIA bewertet. KD-Werte sind auf jedem Sensorgramm vermerkt. b Antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) eines Anti-CD20-Antikörpers gegen menschliche WIL2-S-B-Lymphoblasten in Gegenwart von IVIG und rhIgG1 Fc. FcγRIIIA-exprimierende Jurkat-Zellen wurden als Effektorzellen hinzugefügt und die ADCC-Aktivität wurde durch Messung der Luciferase-Aktivität bewertet. c Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) eines Anti-CD20-Antikörpers gegen menschliche Raji-Lymphomzellen in Gegenwart von IVIG und rhIgG1 Fc. FcγRIIA-exprimierende Jurkat-Zellen wurden als Effektorzellen verwendet, und die ADCP-Aktivität wurde durch Messung der Luciferase-Aktivität bewertet. (n = 3 unabhängige Stichproben) Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einfaktorielle ANOVA bestimmt. ns, nicht signifikant; * P < 0,05; und *** P < 0,001. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Da die Vernetzung von FcγRIIIA durch Immunkomplexe Immunzellen dazu anregt, entzündliche Zytokine abzusondern und Gewebeschäden auszulösen, ist die FcγRIIIA-Blockade eine wirksame entzündungshemmende Strategie. Tatsächlich wird die entzündungshemmende Aktivität von IVIG durch die Blockade von FcγRIIIA über die Fc-Region vermittelt19,21,45,46,47. Daher haben wir gefragt, ob rhIgG1 Fc die durch Immunkomplexe vermittelte Vernetzung von FcγRIIIA und die anschließende Aktivierung von Immunzellen hemmt. Zu diesem Zweck untersuchten wir die humane FcγRIIIA-vermittelte ADCC-Aktivität eines Anti-CD20-Antikörpers in Gegenwart von IVIG oder rhIgG1 Fc. WIL2-S-Lymphoblastenzellen, die menschliches CD20 exprimieren, und transgene Jurkat-Zellen, die FcγRIIIA und das Luciferase-Reportergen exprimieren, das durch das Antwortelement „Nuclear Factor of Activated T-Cell“ (NFAT) gesteuert wird, wurden mit einem seriell verdünnten Anti-CD20 co-inkubiert Antikörper in Gegenwart von IVIG oder rhIgG1 Fc. Die Bindung des immunkomplexierten Anti-CD20-Antikörpers an FcγRIIIA, das von Jurkat-Zellen exprimiert wird, induziert die Vernetzung von FcγRIIIA und aktiviert den NFAT-Weg, was zur Luciferase-Expression führt.

Bei Zugabe von 1,8 mg/ml IVIG betrug der EC50-Wert des Anti-CD20-Antikörpers 83,36 ng/ml, was 3,46-fach höher war als der in der PBS-Behandlungsgruppe gemessene Wert (Abb. 4b). Dies deutete darauf hin, dass IVIG eine FcγRIIIA-blockierende Aktivität aufweist und die durch Immunkomplexe vermittelte FcγRIIIA-Vernetzung behindert. Interessanterweise betrug der EC50-Wert des Anti-CD20-Antikörpers 2218,19 ng/ml, was 26,60-fach höher war als der des IVIG, wenn rhIgG1 Fc in einer Menge von 600 μg/ml zugegeben wurde, was dem gleichen Molverhältnis wie 1,8 mg/ml IVIG entspricht -behandelte Gruppe (Abb. 4b). Dieser Unterschied in der Faltungsänderung steht im Einklang mit dem Unterschied in der Affinität von IVIG und rhIgG1-Fc für FcγRIIIA (Abb. 4a und Tabelle 3). Wenn die Konzentration von rhIgG1 Fc abnahm, stieg der EC50-Wert proportional an (Abb. 4b). Diese Ergebnisse zeigen, dass rhIgG1 Fc kommerziellem IVIG hinsichtlich der Besetzung von FcγRIIIA überlegen ist und dass es die Bindung von Immunkomplexen an diesen Rezeptor wirksam blockiert.

Außerdem haben wir versucht zu bestätigen, dass rhIgG1 Fc FcγRIIA, einen Hauptinduktor von ADCP, blockiert, indem wir transgene Jurkat-Zellen verwendet haben, die FcγRIIA und das durch das NFAT-Antwortelement gesteuerte Luciferase-Reportergen exprimieren. Die CD20-exprimierenden Raji-Zellen und transgenen Jurkat-Zellen wurden mit einem seriell verdünnten Anti-CD20-Antikörper in Gegenwart von 1,8 mg/ml IVIG oder 0,6 mg/ml rhIgG1 Fc koinkubiert. Die ADCP-Induktionsniveaus wurden durch Messung der Luciferase-Aktivität in jeder Gruppe untersucht. Allerdings konnten wir weder in der 1,8 mg/ml IVIG- als auch in der 0,6 mg/ml rhIgG1 Fc-Behandlungsgruppe eine hemmende Wirkung auf die durch immunkomplexierte Anti-CD20-Antikörper vermittelte FcγRIIA-Vernetzung feststellen (Abb. 4c). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der relativ geringen Affinität von IVIG und rhIgG1 Fc für FcγRIIA im Vergleich zu FcγRIIIA (Tabelle 3 und ergänzende Abbildung 4).

Um zu überprüfen, ob rhIgG1 Fc die durch Autoantikörper vermittelte Thrombozytendepletion blockiert, verwendeten wir ein passives ITP-Mausmodell, bei dem Thrombozyten durch Injektion eines monoklonalen Rattenantikörpers (MWReg30) depletiert werden, der murines plättchenspezifisches Integrin αIIbβ348 erkennt. Wir verabreichten der Maus 2 Stunden vor der Injektion des Anti-Thrombozyten-Antikörpers MWReg30 IVIG oder rhIgG1 Fc und analysierten dann die Thrombozytenzahl nach 4 Stunden der MWReg30-Injektion (Abb. 5a). Wenn IVIG in einer Menge von 1 g/kg und 0,33 g/kg verabreicht wurde, verhinderte es den durch MWReg30 vermittelten Blutplättchenabbau (Abb. 5b). Wenn rhIgG1 Fc in einer Menge von 0,33 g/kg und 0,12 g/kg verabreicht wurde, was dem gleichen Molverhältnis wie 1 g/kg und 0,33 g/kg IVIG entspricht, verhinderte es ebenfalls die Erschöpfung der Blutplättchen (Abb. 5c). Wenn IVIG jedoch in einer Menge von 0,1 g/kg verabreicht wurde, konnte die Thrombozytenverarmung durch MWReg30 nicht verhindert werden (Abb. 5b). Im Gegensatz zu IVIG verhinderte die Verabreichung von rhIgG1 Fc bei 0,033 g/kg, was dem gleichen Molverhältnis wie 0,1 g/kg IVIG entspricht, die Plättchenverarmung durch MWReg30 (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass rhIgG1 Fc den durch den MWReg30-Immunkomplex vermittelten Blutplättchenabbau wirksam blockiert.

a Schematische Darstellung des In-vivo-Experiments unter Verwendung eines passiven ITP-Mausmodells. Zwei Stunden vor der Injektion eines Anti-Blutplättchen-Antikörpers MWReg30 (0,1 μg/g) erhielten Mäuse eine intraperitoneale Injektion von IVIG oder rhIgG1 Fc. 4 Stunden nach der Injektion von MWReg30 wurde Blut aus der Schwanzvene entnommen und die Blutplättchen mit Rees-Ecker-Verdünnungsflüssigkeit angefärbt und unter einem Phasenkontrastmikroskop gezählt. b Die verbleibende Thrombozytenzahl wurde 4 Stunden nach der Injektion von MWReg30 quantifiziert, das selbst 2 Stunden nach IVIG injiziert wurde (1 g/kg, 0,33 g/kg oder 0,12 g/kg). Jeder Punkt repräsentiert einzelne Mäuse. (n = 4–7 unabhängige Stichproben). c Die verbleibende Thrombozytenzahl wurde 4 Stunden nach der Injektion von MWReg30 quantifiziert, das 2 Stunden nach hIgG1-Fc verabreicht wurde (0,33 g/kg, 0,12 g/kg oder 0,033 g/kg). (n = 5–7 unabhängige Stichproben). d Repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die die Ausbreitung der endogenen CD4+/Foxp3+-Treg-Population in der Milz zeigen. Milzen aus den Behandlungsgruppen PBS, IVIG (1 g/kg) und rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) wurden analysiert. e Treg-Populationsprozentsätze der Milzen aus den Behandlungsgruppen PBS, IVIG (1 g/kg) und rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) nach 6-stündiger Behandlung, analysiert durch Durchflusszytometrie. Jeder Punkt repräsentiert einzelne Mäuse. f Gesamt-RNA wurde aus der Milz isoliert und für die quantitative Echtzeit-PCR zur Messung der IL-4-, IL-33- und FcγRIIB-mRNA-Spiegel verwendet. Milzen aus den Behandlungsgruppen PBS, IVIG (1 g/kg) und rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) wurden analysiert. (n = 3 unabhängige Stichproben) Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA und einen gepaarten t-Test bestimmt. * P < 0,05, ** P < 0,01 und ***P < 0,001. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Da α-2,6-sialyliertes IgG1-Fc in IVIG eine entzündungshemmende Aktivität ausübt, indem es die Population regulatorischer T-Zellen (Treg) erweitert und die Expression von FcγRIIB über die TH2-Zytokine IL-33 und IL-412,13 fördert, haben wir untersucht, ob auch rhIgG1-Fc Rekapitulieren Sie die entzündungshemmende Aktivität von α-2,6-sialyliertem IgG1-Fc, indem Sie die Treg-Population und die Expression von IL-33, IL-4 und FcγRIIB in der Milz untersuchen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die CD4+/Foxp3+-regulatorische T-Zellpopulation nach 6-stündiger Behandlung sowohl in der IVIG- als auch in der rhIgG1-Fc-Gruppe tendenziell zunimmt, obwohl dies keine statistische Signifikanz erreicht (Abb. 5d, e). Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass die Expression von IL-33, IL-4 und FcγRIIB in den IVIG- und rhIgG1-Fc-Behandlungsgruppen signifikant zunahm (Abb. 5f). Diese Ergebnisse zeigen, dass aus Hühnern stammendes rhIgG1-Fc die Expression von TH2-Zytokinen und FcγRIIB fördert und dadurch die Mechanismen der entzündungshemmenden Aktivität, die durch α-2,6-sialyliertes IgG1-Fc in IVIG vermittelt wird, erfolgreich rekapituliert.

Hier haben wir genomeditierte Hühner entwickelt, die rhIgG1 Fc in Serum und Eigelb produzieren. Wir zeigen, dass ALB::hIgG1 Fc-Hühner rhIgG1 Fc in Serum und Eigelb absondern und dass rhIgG1 Fc, das von ALB::hIgG1 Fc-Hühnern stammt, ein funktionelles entzündungshemmendes Mittel ist. Außerdem schlugen wir vor, dass genomeditierte Hühner als effiziente Plattform für die Produktion einer IVIG-Alternative mit verbesserter entzündungshemmender Aktivität genutzt werden können. Darüber hinaus schlugen wir vor, dass die gezielte gezielte Ausrichtung auf die wichtigsten Serumprotein-kodierenden Gene, die überwiegend in Hühnerleber exprimiert werden, ein effizienter Ansatz zur Anreicherung hoch galaktosylierter, α-2,6-sialylierter und afucosylierter Biopharmazeutika in Serum und Eigelb ist.

Wir fanden heraus, dass ALB::hIgG1-Fc-Hühner eine dominante Expression von hIgG1-Fc-Transkripten in der Leber zeigten und dass das N-Glykosylierungsmuster, das von hIgG1-Fc aus ALB::hIgG1-Fc-Hühnern getragen wird, ein hohes Maß an α-2,6-Sialylierung aufwies geringe Fucosylierung. Insbesondere machten sialylierte N-Glykane etwa 30 % der gesamten N-Glykane aus. Dies ist ein recht effizientes Sialylierungsverhältnis, wenn man bedenkt, dass hIgG1 Fc aufgrund seiner Struktur kaum sialyliertes Protein ist49. Im Allgemeinen hat menschliches IgG1, das aus dem Expressionssystem von Säugetieren produziert wird, Fc kaum sialyliert, und natürliches menschliches IgG1 aus menschlichem Plasma weist eine niedrige Sialylierungsrate auf (etwa 10 % der gesamten N-Glykane)26,27. Auch menschliches IgG, das aus Expressionssystemen von Säugetieren hergestellt wird, sowie natürliches menschliches IgG1 aus Plasma enthalten hohe Mengen an kernfucosyliertem Fc26,27. Daher sind ALB::hIgG1-Fc-Hühner ein einzigartiges System zur Produktion von hIgG1-Fc mit zahlreichen terminalen Sialylierungen und geringen Fucosylierungsniveaus. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass die terminalen Sialinsäurereste von rhIgG1 Fc, die von ALB::hIgG1 Fc-Hühnern stammen, hauptsächlich α-2,6-verknüpft sind, was für die Induktion der entzündungshemmenden Aktivität entscheidend ist11. Daher ist ein Hühnerbioreaktor eine effiziente Plattform für die Produktion von hIgG1-Fc, das nützliche N-Glykane zur Auslösung einer entzündungshemmenden Aktivität enthält.

Unsere Analyse des N-Glykosylierungsmusters detektierte kleinere N-Glykane, die ursprünglich im Serum nicht identifiziert wurden, in rhIgG1-Fc, das aus Eigelb stammt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einem früheren Bericht, der zeigte, dass mehrere N-Glykane, die im Serum-IgY nicht identifiziert wurden, im Eigelb-IgY nachgewiesen wurden; daher scheint es, dass geringfügige Veränderungen an N-Glykanen vorgenommen werden, wenn Proteine vom Serum zum Eigelb transportiert werden50. Außerdem konnten wir kein ALB-Fc-Fusionsprotein im Eigelb nachweisen (obwohl es ursprünglich im Serum nachgewiesen wurde), was darauf hindeutet, dass unverarbeitetes ALB-Fc-Fusionsprotein nicht auf das Eigelb übertragen wurde oder dass es dabei zu einer Abspaltung von Fc vom Fusionspartner kam den Transportprozess, wie bereits berichtet33.

Als wir die Affinität von rhIgG1 Fc für menschliche FcγRs analysierten, stellten wir fest, dass rhIgG1 Fc aufgrund der geringen Fucosylierung eine deutlich höhere Affinität für FcγRIIIA aufweist. Daher inhibierte rhIgG1 Fc die durch Immunkomplexe vermittelte FcγRIIIA-Vernetzung stärker als kommerzielles IVIG. Diese Ergebnisse zeigen, dass rhIgG1 Fc FcγRIIIA effizient und monovalent blockiert. Dies ist wichtig, da die multivalente Blockierung von FcγRIIIA durch monoklonale Antikörper durch die FcγRIIIA-Vernetzung vermittelte unerwünschte Nebenwirkungen hervorruft, allerdings gleichzeitig die entzündungshemmende Aktivität von IVIG stark rekapituliert und Wirksamkeit bei refraktärem ITP zeigte22,51. Eine aktuelle Studie berichtete, dass die monovalente Blockierung von FcγRIIIA durch ein Fab-Fragment die durch FcγRIIIA-Vernetzung vermittelte Toxizität umgeht47. Dementsprechend blockierte das von ALB::hIgG1 Fc-Hühnern stammende niedrig fucosylierte hIgG1-Fc monovalent FcγRIIIA mit höherer Affinität als menschliches IVIG und induzierte eine entzündungshemmende Reaktion ohne damit verbundene Toxizität. Daher könnte das Hühnerbioreaktorsystem eine optimale Produktionsplattform für hIgG1-Fc mit verstärkter FcγRIIIA-Blockierung und anschließender entzündungshemmender Aktivität aufgrund der geringen Fukosylierung sein.

Wir erwarten auch, dass rhIgG1-Fc eine höhere Affinität für DC-SIGN haben wird, da letzteres als Rezeptor zur Erkennung von α-2,6-sialyliertem Fc52 vorgeschlagen wurde. Leider konnte in unserer SPR-Analyseumgebung die Affinität von IVIG und rhIgG1 Fc zu menschlichem DC-SIGN nicht gemessen werden. Diese Ergebnisse stimmen mit einem aktuellen Bericht überein, der zeigt, dass menschliches DC-SIGN in der Durchflusszytometrie und SPR-Analyse eine vernachlässigbare Bindungsaffinität zu α-2,6-sialyliertem Fc aufwies53. Andere Methoden wie zellbasierte ELISAs können erforderlich sein, um die Affinität zwischen sialyliertem Fc und DC-SIGN zu messen.

Um zu bestätigen, dass rhIgG1 Fc, das von genomeditierten Hühnern stammt, auch in vivo eine entzündungshemmende Aktivität aufweist, verabreichten wir rhIgG1 Fc einem passiven ITP-Mausmodell. Wir fanden heraus, dass rhIgG1-Fc, das von genomeditierten Hühnern stammt, bei diesen Mäusen selbst bei niedrigeren Dosen eine entzündungshemmende Wirkung ausübt. Da frühere Berichte zeigten, dass eine Verstärkung der α-2,6-Sialylierung in der Fc-Region die entzündungshemmende Aktivität von IVIG deutlich steigert, könnte eine verstärkte entzündungshemmende Aktivität von rhIgG1-Fc aus genomeditierten Hühnern auf eine erhöhte α-2,6-Sialylierung zurückzuführen sein von Fc als aus Plasma gewonnenes IVIG10,11,12,54. Darüber hinaus kann sich niedrig fucosyliertes rhIgG1-Fc auch auf eine verbesserte entzündungshemmende Aktivität von rhIgG1-Fc auswirken. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einer aktuellen Studie, die zeigt, dass nicht fucosyliertes und galaktosyliertes IgG in vivo eine verbesserte entzündungshemmende Aktivität aufweist55.

In unserer Studie neigen sowohl IVIG als auch rhIgG1 Fc dazu, die Treg-Population zu vergrößern und die Expression von IL-33, IL-4 und FcγRIIB zu fördern, was darauf hindeutet, dass hIgG1 Fc, das von ALB::hIgG1 Fc-Hühnern stammt, die entzündungshemmende Wirkung erfolgreich rekapituliert Aktivität von α-2,6-sialyliertem IgG1-Fc in IVIG. Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir hier vorgeschlagen, dass die ALB::hIgG1 Fc-Hühner das Potenzial haben, eine der Versorgungsquellen für IVIG-Alternativen zu sein und Einschränkungen der IVIG-Therapie im Zusammenhang mit Versorgungsengpässen lösen werden. Darüber hinaus schlugen wir vor, dass die N-Glykosylierungseigenschaften rekombinanter Proteine, die von ALB::hIgG1-Fc-Hühnern stammen, optimal für die Produktion von aus der menschlichen Leber stammenden Blutprodukten wie Blutgerinnungsfaktoren sind, da menschliche Blutfaktoren ebenfalls ein N-Glykosylierungsprofil aufweisen, das einen hohen Anteil aufweist α-2,6-sialylierte und niedrig-fucosylierte Formen, die mit denen von Proteinen aus Hühnerleber identisch sind56. Schließlich produzieren Hühner keine nichtmenschlichen Glykane; Daher können genomeditierte Hühner eine optimale Plattform für die Produktion humanisierter rekombinanter menschlicher Blutprodukte sein. Andernfalls können im Eigelb produzierte stark galaktosylierte, sialylierte und niedrig fucosylierte Glykoformen zu monoklonalen Antikörpern führen, die nicht nur erhöhte Fc-Effektorfunktionen (wie CDC- und ADCC-Aktivität), sondern auch eine längere Serumhalbwertszeit aufweisen57.

Abschließend haben wir hier gezeigt, dass ein Hühnerbioreaktorsystem, das auf das Hauptserumproteingen abzielt, hIgG1-Fc effizient in Serum und Eigelb akkumuliert. Dieser Ansatz hat das Potenzial, in großem Umfang angewendet zu werden, um verschiedene Biopharmazeutika mit verbesserter Wirksamkeit durch ein optimales N-Glykosylierungsmuster herzustellen.

Das Management und die experimentelle Verwendung von Hühnern und Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Seoul National University genehmigt (SNU-190401-1-2 und SNU-210726-1-1). Die Versuchstiere wurden gemäß einem Standardmanagementprogramm an der University Animal Farm und dem Institute of Laboratory Animal Resources der Seoul National University gepflegt.

Der CRISPR/Cas9-Vektor, der auf Intron 13 des Hühner-ALB-Gens abzielt, wurde unter Verwendung des PX459-Vektors (Addgene-Plasmid #62988) konstruiert. Um Leit-RNA-Sequenzen (gRNA) in das CRISPR/Cas9-Plasmid einzufügen, wurden Sense- und Antisense-Oligonukleotide entworfen und synthetisiert (Bioneer, Daejeon, Korea). Diese Oligonukleotide wurden unter den folgenden Thermocycling-Bedingungen getempert: 30 Sekunden bei 95 °C, 2 Minuten bei 72 °C, 2 Minuten bei 37 °C und 2 Minuten bei 25 °C. Für die gezielte Markierung des hIgG1-Fc am 3'-Ende des ALB-Gens wurde das Donorplasmid mit Intron 13 und Exon 14 des ALB-Gens und T2A, gefolgt von der hIgG1-Fc-Kodierungssequenz und der Polyadenylierungsstelle für Rinderwachstumshormon, im pBHA synthetisiert Vektor-Rückgrat (Bioneer, Daejeon, Korea). Die zur Konstruktion des CRISPR/Cas9-Vektors verwendeten Oligonukleotide sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Zur Etablierung der PGC-Linie wurden die männlichen White Leghorn (WL)-PGCs beibehalten und auf Knockout-DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), ergänzt mit 20 % FBS (Invitrogen), 2 % Hühnerserum (Sigma-Aldrich, St.Louis), weitergegeben , MO), 1× Nukleoside (Millipore, Temecula, CA), 2 mM L-Glutamin, 1× nichtessentielle Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, 10 mM Natriumpyruvat, 1× Antibiotikum-Antimykotikum (Invitrogen) und menschliches Basisfibroblastenwachstum Faktor (10 ng/ml; Sigma-Aldrich). Hühner-PGCs wurden in einem Inkubator bei 37 °C unter einer Atmosphäre von 5 % CO2 und 60–70 % relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die PGCs wurden durch vorsichtiges Pipettieren in Abständen von 5 bis 6 Tagen auf mitomycininaktivierten embryonalen Fibroblasten der Maus subkultiviert. Zur Genombearbeitung in Hühner-PGCs wurden CRISPR/Cas9-Plasmide (3 µg) und Donorplasmide (3 µg) gemeinsam in 1 × 105 kultivierte PGCs mit 6 µl Lipofectamine 2000-Reagenz, suspendiert in 1 ml OptiMEM, eingebracht. Dann, 4 Stunden nach der Transfektion, wurde die Transfektionsmischung durch PGC-Kulturmedium ersetzt. Puromycin (1 µg/ml) wurde 1 Tag nach der Transfektion dem Kulturmedium zugesetzt. Nach 2 Tagen Puromycin-Behandlung wurden ausgewählte PGCs gewaschen und durch frisches PGC-Kulturmedium ersetzt und 4 bis 6 Wochen lang expandiert. Die gezielte Insertion von Spenderplasmid wurde durch genomische DNA-PCR-Analyse bestätigt. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Um genommodifizierte Hühner zu produzieren, wurde ein Fenster in das scharfe Ende des koreanischen Ogye (KO)-Empfängereis geschnitten und mehr als 3000 genommodifizierte WL-PGCs in die dorsale Aorta von Hamburger- und Hamilton-Empfängerembryonen im Stadium 14–17 transplantiert . Das Eifenster wurde mit Paraffinfolie verschlossen und die Eier wurden mit der spitzen Seite nach unten bis zum Schlüpfen inkubiert. Die geschlüpften Küken wurden in der institutionellen Tierfarm aufgezogen. Nach der Geschlechtsreife wurden die Empfängerhähne mit weiblichen WT-Hühnern verpaart. Genommodifizierte Nachkommen wurden anhand der Federfarbe der Nachkommen und der anschließenden Analyse und Sequenzierung der genomischen DNA identifiziert.

Um rhIgG1 Fc im Serum zu quantifizieren, wurde Vollblut von ALB+/hIgG1 Fc und ALBhIgG1 Fc/hIgG1 Fc Hühnern gesammelt und dem gesammelten Blut wurde 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung zugesetzt, um eine Blutgerinnung zu verhindern. Die gesammelten Blutproben wurden bei 2000 U/min, 10 Minuten und 4 °C zentrifugiert, und die Überstände wurden gesammelt und für die ELISA-Analyse verwendet. Um rhIgG1 Fc im Eigelb zu quantifizieren, wurden Eier von vier G2 ALB+/hIgG1 Fc-Hühnern gesammelt und das Eigelb vom Eiweiß getrennt. Die gesammelten Serum- und Eigelbproben wurden in DW verdünnt und durch ELISA unter Verwendung eines Human-IgG-ELISA-Kits (ab100547, Abcam, Cambridge, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die gemessenen Konzentrationen wurden in drei Teile geteilt, um das Standard-IgG-Molekulargewicht an rhIgG1-Fc anzupassen.

Zur Reinigung von humanem IgG1-Fc aus transgenem Hühnerserum wurden dem Hühnerserum langsam 4 M Ammoniumsulfat zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt und dann 30 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in dem gleichen Volumen an 1×PBS wie das ursprüngliche Serumvolumen resuspendiert. Anschließend wurde die Mischung gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert. Die Probe wurde auf eine Protein-A-Säule (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Schweden) geladen und das Protein mit einem 100-ml-Gradienten von 100 mM Zitronensäure (pH 2,8) eluiert. Das Protein wurde durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer HiLoad Superdex 75-Säule (GE Healthcare Bio-Sciences), voräquilibriert mit 20 mM Tris-HCl, 175 mM NaCl (pH 7,4), weiter gereinigt und fraktioniert. Für die Reinigung von menschlichem IgG1-Fc aus Eigelb wurde das Eigelb abgetrennt und mit 9 Volumina destilliertem Wasser verdünnt. Die Probe wurde über Nacht bei -20 °C eingefroren und bei Raumtemperatur aufgetaut. Nach dem Auftauen wurde die überstehende Flüssigkeit gesammelt und filtriert. Anschließend wurde die Probe auf eine Protein-A-Säule (GE Healthcare Bio-Sciences) geladen und das Protein mit einem 100-ml-Gradienten von 100 mM Zitronensäure (pH 2,8) eluiert.

Für den Western-Blot von rhIgG1 Fc in Serum und Eigelb wurde das ALB+/hIgG1 Fc-Hühnerserum in destilliertem Wasser (DW) verdünnt und das ALB+/hIgG1 Fc-Hühnereigelb durch Einfrier- und Auftaumethode vorbehandelt, wie in „Reinigung von Human“ beschrieben IgG1 Fc aus Serum- und Eigelbschnitt. Als Kontrolle wurde das Wildtyp-Hühnerserum verwendet. Die vorbereitete Probe wurde auf 10 % Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (Millipore, Billerica, MA) übertragen. Nach dem Transfer wurde die Polyvinylidenfluoridmembran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 3 % Magermilch blockiert (BD Biosciences, San Jose, CA). Die blockierte Membran wurde mit Ziege-Anti-Human-IgG-Primärantikörper (10319, Alpha Diagnostic, San Antonio, TX) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Primärantikörper wurde dreimal mit 0,1 % PBST-Puffer gewaschen und die Membran wurde 1 Stunde lang mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Esel-Anti-Ziegen-IgG-Sekundärantikörper (sc-2020, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) inkubiert bei Zimmertemperatur. Nach dem Waschen des sekundären Antikörpers wurde die HRP-Enzymaktivität durch Zugabe von ECL-Western-Blot-Substrat (GE Healthcare Bio-Sciences) nachgewiesen.

Die N-Glykan-Analyse von rhIgG1-Fc aus ALB::hIgG1-Fc-Hühnern wurde mittels UPLC/MS-MS durchgeführt. Kurz gesagt, gereinigtes rhIgG1-Fc wurde mit PNGase F 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Deglykosiertes rhIgG1-Fc wurde unter Verwendung von Ethanol präzipitiert und 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand, der das freigesetzte N-Glykan enthielt, wurde in ein neues Röhrchen überführt und mit dem Speed-Vac-Konzentrator vollständig getrocknet. Die getrocknete Probe wurde zur Fluoreszenzanalyse mit Procainamid markiert. Die markierte N-Glykan-Probe wurde mittels UPLC/MS-MS analysiert und quantifiziert. Für die Trennung und den Nachweis von N-Glykanen wurde eine ACQUITY UPLC BEH Glycan-Säule (1,2 × 150 mm, 1,7 μm; Waters, New Castle, DE) mit einem Fluoreszenzdetektor (Waters iClass UPLC) verwendet. Die LC-Bedingungen waren wie folgt: Flussrate (0,5 ml/min), Säulentemperatur (60 °C), Puffer A der mobilen Phase (100 mM Ammoniumformiat, pH 4,5), Puffer B (100 % Acetonitril), Injektionsvolumen (8 ml), linearer Gradient (75–60 % B für 46,5 Min., 60–0 % B für 1,5 Min., 0 % B für 1 Min., 0–75 % B für 1 Min. und 75 % B für 13 Min.). Zur N-Glykan-Identifizierung wurde eine hochauflösende Massenspektrometrie, Triple-TOF-MS (AB SCIEX, Concord, Ontario, Kanada) verwendet. Die N-Glykan-Verteilung wurde mit Empower (Waters) analysiert.

Das gereinigte rhIgG1-Fc und aus CHO-Zellen stammende rekombinante EPO (Kat.-Nr. 100-64, Peprotech) wurden 10 Minuten lang in Glykoprotein-Denaturierungspuffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) bei 100 °C inkubiert. Anschließend wurde die Probe durch Zugabe von PNGase F (New England Biolabs) gemäß den Protokollen des Herstellers gespalten. Das gereinigte und deglykosylierte rhIgG1-Fc wurde auf 10 % Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und zum Lektin-Blotting auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (Millipore) übertragen. Die Membran wurde mit 3 % Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 7,5; TBS) bei 4 °C über Nacht blockiert. Anschließend wurde die Membran mit 1,0 μg/ml biotinierter Lektine SNA/EBL (ɑ2,6-SA-spezifisch; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) und MAL II (ɑ2,3-SA-spezifisch; Vector Laboratories) in TBST inkubiert ( TBS mit 0,05 % Tween 20) für 1 Stunde. Nach zweimaligem Waschen mit TBST-Puffer wurden die Membranen 1 Stunde lang mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Avidin (VECTASTAIN ABC-Kit; Vector Laboratories) inkubiert. Die Membran wurde mit TBST-Puffer gewaschen und die Färbung wurde mit ECL-Western-Blot-Nachweisreagenzien (GE Healthcare Bio-Sciences) durchgeführt.

Für die SPR-Analyse wurde IVIG von GC Pharma, Yong-in, Korea, gekauft. Menschliche FcγRs wurden von Sino Biological Inc, Peking, China gekauft (FcγRIA-10256-H08H; FcγRIIA 167 Arg-10374-H08H; FcγRIIIA F176V-10389-H08H1; FcRn-CT009-H08H; DC-SIGN-10200-H01H). rhIgG1 Fc wurde aus juvenilem ALB::hIgG1 Fc Hühnerserum gereinigt. Die SPR-Analyse wurde mit Biacore T200 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) durchgeführt. FcγRs wurden auf dem CM5-Sensorchip (BR-1005-30, GE Healthcare) immobilisiert. IVIG und rhIgG1 Fc wurden in den FcγRs-beschichteten Sensorchip injiziert. Die kinetischen Tests wurden durch dreifache Reihenverdünnung für FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA, DC-SIGN und zweifache Reihenverdünnung für FcRn durchgeführt. Für FcγRIA und DC-SIGN begann die Verdünnung bei 300 nM. Für FcγRIIA begann die Verdünnung bei 20 μM. Für FcγRIIIA begann die Verdünnung mit 3 μM IVIG und 300 nM hIgG1 Fc. Für FcRn begann die Verdünnung mit 500 nM IVIG und 250 nM rhIgG1 Fc. Die Regeneration erfolgte durch Injektion von 10 mM Glycin für FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA, DC-SIGN und 100 mM Tris-HCl für FcRn. Die Dissoziationskonstante (KD) für die Monomerbindung von IVIG und rhIgG1 Fc an FcγRs wurde mit einem Einzelzyklus-Kinetikmodell für FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA und einem Mehrzyklus-Kinetikmodell für FcRn, DC-SIGN berechnet.

ADCC-Assays wurden mit einem ADCC Reporter Bioassay Complete Kit (G7014, Promega, Madison, WI, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, CD20-positive WIL2-S-Zellen wurden in RPMI 1640 und menschlichem Serum mit niedrigem IgG-Gehalt resuspendiert und mit 10.000 Zellen pro Vertiefung in eine undurchsichtige Kulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät, die gentechnisch veränderte FcγRIIIA-exprimierende Effektor-Jurkat-T-Zellen enthielt. Diese gentechnisch veränderten Jurkat-T-Zellen verfügen außerdem über ein Luciferase-Reportergen, dessen Expression durch das NFAT-Antwortelement gesteuert wird. Dann wurden IVIG (GC Pharma) oder rhIgG Fc und seriell verdünnter Anti-CD20-Antikörper hinzugefügt und 6 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Vernetzung von FcγRIIIA und die Aktivierung des NFAT-Signals wurden mithilfe des Bio-Glo-Luciferase-Assays bestimmt und die Messungen wurden auf einem Mikroplatten-Lesegerät durchgeführt.

ADCP-Assays wurden mit dem ADCP Reporter Bioassay Complete Kit (G9901, Promega) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, CD20-positive Raji-Zellen wurden in RPMI 1640 und menschlichem Serum mit niedrigem IgG-Gehalt resuspendiert und mit 10.000 Zellen pro Vertiefung in eine undurchsichtige Kulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät, die gentechnisch veränderte FcγRIIA-exprimierende Effektor-Jurkat-T-Zellen enthielt. Diese gentechnisch veränderten Jurkat-T-Zellen verfügen außerdem über ein Luciferase-Reportergen, dessen Expression durch das NFAT-Antwortelement gesteuert wird. Dann wurden IVIG oder rhIgG Fc und seriell verdünnter Anti-CD20-Antikörper hinzugefügt und 6 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Vernetzung von FcγRIIA und die Aktivierung des NFAT-Signals wurden mithilfe des Bio-Glo-Luciferase-Assays bestimmt und die Messungen wurden auf einem Mikroplatten-Lesegerät durchgeführt.

8 Wochen lang wurden weibliche C57BL/6-Mäuse im In-vivo-Experiment verwendet. Vor Beginn des Experiments wurden von jeder Maus Blutproben aus der Schwanzvene entnommen. Die Blutplättchen wurden mit 1 %iger Brillantkresylblau-Lösung angefärbt und die Blutplättchenzahl wurde unter dem Lichtmikroskop berechnet (0 h PLT-Zählung). Danach wurden 1 g/kg, 0,33 g/kg und 0,12 g/kg Dosis IVIG (GC Pharma) und 0,33 g/kg, 0,12 g/kg und 0,033 g/kg Dosis rhIgG1 Fc intraperitoneal (ip) injiziert. Hohlraum. Nach 2 Stunden IVIG- und rhIgG1-Fc-Injektion wurde der Anti-Thrombozyten-Antikörper MWReg30 (0,1 μg/g) in die IP-Höhle injiziert. Nach 4 Stunden MWReg30 wurde Blut aus der Schwanzvene entnommen und die Blutplättchenfärbung mit 1 % Brillantkresylblau-Lösung durchgeführt und die Blutplättchenzahl unter dem Lichtmikroskop berechnet (4 Stunden PLT-Zählung). Der Prozentsatz der verbleibenden Thrombozytenzahlen wurde berechnet, indem die 4-Stunden-PLT-Zahlen durch die 0-Stunden-PLT-Zahlen dividiert wurden.

Die Milz jeder Maus wurde 6 Stunden nach der Injektion von PBS, IVIG (1 g/kg) und rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) geerntet. Die Milzzellen wurden mit einem Maus-Treg-Detektionskit (130-120-674, Miltenyi Biotic, Bergisch Gladbach, Deutschland) gefärbt. Die Zellen wurden 30 Minuten lang unter Kühlung mit APC-markiertem Anti-Maus-CD25-Antikörper und Vio-Blue-markiertem CD4-Antikörper gefärbt. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, permeabilisiert und unter Verwendung einer Fixierungs-/Permeabilisierungslösung 30 Minuten lang im Dunkeln und unter Kühlung fixiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln und unter Kühlung mit PE-markiertem Anti-Maus-Foxp3-Antikörper behandelt. Die gefärbten Zellen wurden auf einem Durchflusszytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) untersucht und die Daten wurden mit einer FlowJo-Software (Tree Star, Ashland, OR) analysiert.

Die Milz jeder Maus wurde 6 Stunden nach der Injektion von PBS, IVIG (1 g/kg) und rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) geerntet. Die Gesamt-RNA wurde aus Milzproben mit TRIzol-Reagenz (Molecular Research Center, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert und die cDNA wurde mit dem Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen) synthetisiert. Die PCR-Mischung enthielt 2 μl PCR-Puffer, 1 μl 20 × EvaGreen qPCR-Farbstoff (Biotium, Hayward, CA, USA), 0,4 μl 10 mmol/l dNTP-Gemisch und jeweils 10 pmol genspezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Ergänzungstabelle 3). RT-qPCR wurde dreifach durchgeführt. Die relative Zielgenexpression wurde nach Normalisierung gegen die Expression von Maus-Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als endogene Kontrolle quantifiziert.

Zur Halbwertszeitanalyse wurden aus Eigelb gereinigtes rhIgG1-Fc und aus HEK293-Zellen stammendes rekombinantes Fc (10702-HNAH, Sino Biological Inc) 8 Wochen lang weiblichen C57BL/6-Mäusen in einer Dosis von 100 μg/Maus ip injiziert. Nach 24-stündiger Injektion wurde 5 Tage lang Blut über die Schwanzvene gesammelt und Serum durch Zentrifugation gewonnen. Die Serumkonzentration von aus Eigelb gereinigtem rhIgG1-Fc und aus HEK293-Zellen stammendem rekombinantem Fc wurde durch ELISA unter Verwendung eines Human-IgG-ELISA-Kits (Abcam) bestimmt. Die Halbwertszeit wurde durch nichtlineare Regressionsanalyse berechnet.

Jedes Experiment wurde zur Reproduzierbarkeit mit mindestens drei biologisch unabhängigen Proben und Tieren durchgeführt und die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Signifikante Unterschiede zwischen mehr als zwei Gruppen wurden durch eine einfaktorielle ANOVA-Varianzanalyse mit dem Mehrfachvergleichstest von Bonferroni ermittelt. Die statistische Analyse zwischen zwei Gruppen wurde durch einen gepaarten T-Test analysiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichungswerte dargestellt. Ein Wert von P < 0,05 zeigte statistische Signifikanz an.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze finden Sie in den Abbildungen, Tabellen und ergänzenden Informationen. Die zur Erstellung der Grafiken im Haupttext verwendeten Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 1. Das unverarbeitete Gelbild finden Sie in der Zusatzabbildung 5. Alle anderen Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Bach, JF Die Auswirkung von Infektionen auf die Anfälligkeit für Autoimmun- und allergische Erkrankungen. N. engl. J. Med. 347, 911–920 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Ludwig, RJ et al. Mechanismen der Autoantikörper-induzierten Pathologie. Vorderseite. Immunol. 8, 603 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulhearn, B. & Bruce, IN Indikationen für IVIG bei rheumatischen Erkrankungen. Rheumatology 54, 383–391 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Imbach, P. et al. Hochdosiertes intravenöses Gammaglobulin bei idiopathischer thrombozytopenischer Purpura im Kindesalter. Lancet 1, 1228–1231 (1981).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kazatchkine, MD & Kaveri, SV Immunmodulation von Autoimmun- und Entzündungserkrankungen mit intravenösem Immunglobulin. N. engl. J. Med. 345, 747–755 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Norris, PAA, Kaur, G. & Lazarus, AH Neue Erkenntnisse über IVIg-Mechanismen und Alternativen bei Autoimmun- und Entzündungserkrankungen. Curr. Meinung. Hämatol. 27, 392–398 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Debre, M. et al. Infusion von Fc-Gamma-Fragmenten zur Behandlung von Kindern mit akuter immunthrombozytopenischer Purpura. Lancet 342, 945–949 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schwab, I. & Nimmerjahn, F. Intravenöse Immunglobulintherapie: Wie moduliert IgG das Immunsystem? Nat. Rev. Immunol. 13, 176–189 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galeotti, C., Kaveri, SV & Bayry, J. IVIG-vermittelte Effektorfunktionen bei Autoimmun- und Entzündungserkrankungen. Int. Immunol. 29, 491–498 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kaneko, Y., Nimmerjahn, F. & Ravetch, JV Entzündungshemmende Aktivität von Immunglobulin G infolge der Fc-Sialylierung. Wissenschaft 313, 670–673 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Anthony, RM et al. Zusammenfassung der entzündungshemmenden Aktivität von IVIG mit einem rekombinanten IgG-Fc. Wissenschaft 320, 373–376 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anthony, RM, Kobayashi, T., Wermeling, F. & Ravetch, JV Intravenöses Gammaglobulin unterdrückt Entzündungen über einen neuartigen T(H)2-Weg. Natur 475, 110–113 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fiebiger, BM, Maamary, J., Pincetic, A. & Ravetch, JV Der Schutz bei Antikörper- und T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen durch entzündungshemmende IgG-Fcs erfordert Typ-II-FcRs. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 112, E2385–E2394 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Washburn, N. et al. Die kontrollierte Tetra-Fc-Sialylierung von IVIg führt zu einem Medikamentenkandidaten mit konsistent erhöhter entzündungshemmender Aktivität. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 112, E1297–E1306 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pagan, JD, Kitaoka, M. & Anthony, RM Die künstliche Sialylierung pathogener Antikörper in vivo schwächt Autoimmunerkrankungen ab. Zelle 172, 564–577.e513 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagelkerke, SQ et al. Die Hemmung der FcgammaR-vermittelten Phagozytose durch IVIg ist unabhängig von der IgG-Fc-Sialylierung und FcgammaRIIb in menschlichen Makrophagen. Blut 124, 3709–3718 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bussel, JB Fc-Rezeptorblockade und immunthrombozytopenische Purpura. Semin. Hämatol. 37, 261–266 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagelkerke, SQ & Kuijpers, TW Immunmodulation durch IVIg und die Rolle von Fc-Gamma-Rezeptoren: Klassische Wirkmechanismen doch? Vorderseite. Immunol. 5, 674 (2014).

PubMed Google Scholar

Park-Min, KH et al. Die FcgammaRIII-abhängige Hemmung der Interferon-Gamma-Reaktionen vermittelt die unterdrückende Wirkung von intravenösem Immunglobulin. Immunität 26, 67–78 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Siragam, V. et al. Intravenöses Immunglobulin verbessert die ITP durch die Aktivierung von Fc-Gamma-Rezeptoren auf dendritischen Zellen. Nat. Med. 12, 688–692 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Araujo, LM et al. Neuester Stand: Intravenöses Ig hemmt durch FcgammaRIIIA-abhängige Mechanismen die durch NKT-Zellen vermittelte allergische Atemwegsentzündung. J. Immunol. 186, 3289–3293 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Clarkson, SB et al. Behandlung der refraktären immunthrombozytopenischen Purpura mit einem Anti-Fc-Gamma-Rezeptor-Antikörper. N. engl. J. Med. 314, 1236–1239 (1986).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Okazaki, A. et al. Der Abbau von Fucose aus menschlichem IgG1-Oligosaccharid erhöht die Bindungsenthalpie und die Assoziationsrate zwischen IgG1 und FcgammaRIIIa. J. Mol. Biol. 336, 1239–1249 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Patel, KR, Nott, JD & Barb, AW Primäre menschliche natürliche Killerzellen halten proinflammatorisches IgG1 an der Zelloberfläche und exprimieren CD16a-Glykoformen mit spenderabhängiger Variabilität. Mol. Zelle. Proteom.: MCP 18, 2178–2190 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Temming, AR et al. Funktionelle Eigenschaften von Antikörpern, Effektorzellen und Zielzellen, die die durch NK-Zellen vermittelte antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität beeinflussen. J. Immunol. 203, 3126–3135 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Flynn, GC, Chen, X., Liu, YD, Shah, B. & Zhang, Z. Natürlich vorkommende Glykanformen der menschlichen Immunglobuline G1 und G2. Mol. Immunol. 47, 2074–2082 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Raymond, C. et al. Produktion von alpha2,6-sialyliertem IgG1 in CHO-Zellen. mAbs 7, 571–583 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lillico, SG, McGrew, MJ, Sherman, A. & Sang, HM Transgene Hühner als Bioreaktoren für proteinbasierte Medikamente. Arzneimittelentdeckung. heute 10, 191–196 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Raju, TS, Briggs, JB, Borge, SM & Jones, AJ Speziesspezifische Variation in der Glykosylierung von IgG: Belege für die speziesspezifische Sialylierung und branchenspezifische Galaktosylierung und Bedeutung für die Entwicklung rekombinanter Glykoproteintherapeutika. Glycobiology 10, 477–486 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhu, L. et al. Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper in Eiern chimärer Hühner. Nat. Biotechnologie. 23, 1159–1169 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lillico, SG et al. Eileiterspezifische Expression zweier therapeutischer Proteine in transgenen Hühnern. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 104, 1771–1776 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamihira, M. et al. Produktion chimärer monoklonaler Antikörper durch genmanipulierte Hühner. J. Biotechnologie. 141, 18–25 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Penno, CA, Kawabe, Y., Ito, A. & Kamihira, M. Produktion von rekombinantem menschlichem Erythropoietin/Fc-Fusionsprotein durch genetisch manipulierte Hühner. Transgene Res. 19, 187–195 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oishi, I., Yoshii, K., Miyahara, D. & Tagami, T. Effiziente Produktion von menschlichem Interferon Beta im Eiweiß von Eiern von Hühnern, die auf das Ovalbumin-Gen ausgerichtet sind. Wissenschaft. Rep. 8, 10203 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, YM et al. Die transgenen, aus Hühnern stammenden monoklonalen Anti-CD20-Antikörper weisen ein größeres therapeutisches Potenzial zur Krebsbekämpfung mit verbesserten Fc-Effektorfunktionen auf. Biomaterialien 167, 58–68 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Herron, LR et al. Ein Hühnerbioreaktor zur effizienten Produktion funktioneller Zytokine. BMC Biotechnol. 18, 82 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mukae, T. et al. Produktion rekombinanter monoklonaler Antikörper im Eiweiß von gengesteuerten transgenen Hühnern. Gene 12, https://doi.org/10.3390/genes12010038 (2020).

Sumiyoshi, W., Nakakita, S., Miyanishi, N. & Hirabayashi, J. Strategische Glykan-Elutionskarte für die Produktion von N-verknüpften Oligosacchariden vom menschlichen Typ: der Fall von Hühnereigelb und Eiweiß. Biowissenschaften, Biotechnologie, Biochemie. 73, 543–551 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kojima, Y. et al. Analysen von Hühnersialyltransferasen im Zusammenhang mit der N-Glykosylierung. J. Biosci. Bioeng. 119, 623–628 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawabe, Y. et al. Transport von menschlichen Immunglobulin G- und Fc-Fusionsproteinen zu Hühnereigelb. J. Biosci. Bioeng. 102, 518–523 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Auer, TO, Duroure, K., De Cian, A., Concordet, JP & Del Bene, F. Hocheffizienter CRISPR/Cas9-vermittelter Knock-in im Zebrafisch durch homologieunabhängige DNA-Reparatur. Genomres. 24, 142–153 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, HJ et al. Gezielte Geninsertion in das Z-Chromosom von Hühner-Urkeimzellen für die Entwicklung eines Vogel-Geschlechtsmodells. FASEB J.: Aus. Publ. Föderation Am. Gesellschaften Exp. Biol. 33, 8519–8529 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Donnelly, MLL et al. Die Analyse des Spaltungsmechanismus des Aphthovirus 2A/2B-Polyproteins deutet nicht auf eine proteolytische Reaktion, sondern auf einen neuartigen Translationseffekt hin: einen mutmaßlichen ribosomalen „Sprung“. J. General Virol. 82, 1013–1025 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kim, JH et al. Hohe Spaltungseffizienz eines vom Schweine-Teschovirus-1 abgeleiteten 2A-Peptids in menschlichen Zelllinien, Zebrafischen und Mäusen. PloS eins 6, e18556 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aloulou, M. et al. IgG1 und IVIg induzieren über FcgammaRIII die inhibitorische ITAM-Signalübertragung und steuern Entzündungsreaktionen. Blut 119, 3084–3096 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ben Mkaddem, S., Aloulou, M., Benhamou, M. & Monteiro, RC Rolle von FcgammaRIIIA (CD16) bei der IVIg-vermittelten entzündungshemmenden Funktion. J. Clin. Immunol. 34, S46–S50 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Yu, X. et al. Die monovalente Blockade des Fc-Rezeptors durch ein Anti-Fcgamma-Rezeptor/Albumin-Fusionsprotein verbessert die murine ITP bei aufgehobener Toxizität. Blut 127, 132–138 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Teeling, JL et al. Die therapeutische Wirksamkeit intravenöser Immunglobulinpräparate hängt von den Immunglobulin-G-Dimeren ab: Studien zur experimentellen Immunthrombozytopenie. Blut 98, 1095–1099 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wormald, MR et al. Variationen in den Oligosaccharid-Protein-Wechselwirkungen im Immunglobulin G bestimmen die ortsspezifischen Glykosylierungsprofile und modulieren die dynamische Bewegung der Fc-Oligosaccharide. Biochemistry 36, 1370–1380 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sheng, L., He, Z., Liu, Y., Ma, M. & Cai, Z. Massenspektrometrische Charakterisierung für die N-Glykosylierung von Immunglobulin Y aus Hühnereigelb. Int. J. Biol. Makromol. 108, 277–283 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Soubrane, C. et al. Biologische Reaktion auf eine Therapie mit monoklonalen Anti-CD16-Antikörpern bei einem Patienten mit immunthrombozytopenischer Purpura, der mit dem humanen Immundefizienzvirus in Zusammenhang steht. Blut 81, 15–19 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Anthony, RM, Wermeling, F., Karlsson, MC & Ravetch, JV Identifizierung eines Rezeptors, der für die entzündungshemmende Aktivität von IVIG erforderlich ist. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 19571–19578 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Temming, AR et al. Humanes DC-SIGN und CD23 interagieren nicht mit menschlichem IgG. Wissenschaft. Rep. 9, 9995 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwab, I. et al. Breiter Bedarf an terminalen Sialinsäureresten und FcgammaRIIB für die präventive und therapeutische Aktivität intravenöser Immunglobuline in vivo. EUR. J. Immunol. 44, 1444–1453 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mimura, Y., Mimura-Kimura, Y., Saldova, R., Rudd, PM & Jefferis, R. Verstärkte immunmodulatorische Wirkung von intravenösem Immunglobulin durch Fc-Galaktosylierung und Nichtfukosylierung. Vorderseite. Immunol. 13, 818382 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clerc, F. et al. N-Glykosylierung von menschlichem Plasmaprotein. Glykokonj. J. 33, 309–343 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Raju, TS Terminale Zucker von Fc-Glykanen beeinflussen die Antikörpereffektorfunktionen von IgGs. Curr. Meinung. Immunol. 20, 471–478 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde durch den von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt [NRF-2015R1A3A2033826].

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jin Se Park, Hee Jung Choi.

Abteilung für landwirtschaftliche Biotechnologie und Forschungsinstitut für Landwirtschaft und Biowissenschaften, Seoul National University, Seoul, Republik Korea

Jin Se Park, Hee Jung Choi, Kyung Min Jung, Kyung Youn Lee, Ji Hyeon Shim, Kyung Je Park, Young Min Kim und Jae Yong Han

Avinnogen Co., Ltd, 1 Gwanak-ro, Gwanak-gu, Seoul, Republik Korea

Jin Se Park & Young Min Kim

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

JYH beteiligte sich am Studiendesign und an der Gesamtkoordination; JSP beteiligte sich am Studiendesign und führte die Experimente sowie die Dateninterpretation durch und verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts. HJC führte die Experimente und Dateninterpretation durch und verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts. KMJ, KYL und JHS führten Experimente durch. KJP führte experimentelles Tiermanagement durch. YMK und JYH führten die Dateninterpretation durch und waren an der Erstellung der endgültigen Manuskriptversion beteiligt.

Korrespondenz mit Jae Yong Han.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Eve Rogers und Anam Akhtar. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Park, JS, Choi, HJ, Jung, KM et al. Produktion von rekombinantem humanem IgG1-Fc mit vorteilhaftem N-Glykosylierungsmuster für entzündungshemmende Aktivität unter Verwendung genomeditierter Hühner. Commun Biol 6, 589 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

Zitat herunterladen

Eingegangen: 28. April 2022

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.

Blog

Produktion von rekombinantem humanem IgG1-Fc mit nützlichem N