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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 592 (2023) Diesen Artikel zitieren
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Neutralisierende Antikörper üben eine starke Hemmwirkung auf den Viruseintritt aus; Allerdings sind sie in therapeutischen Modellen weniger wirksam als in prophylaktischen Modellen, vermutlich aufgrund ihrer begrenzten Wirksamkeit bei der Eliminierung virusproduzierender Zellen über Fc-vermittelte Zytotoxizität. Hier stellen wir eine SARS-CoV-2-Spike-Targeting-Strategie für bispezifische T-Zell-Engager (S-BiTE) zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion vor. Dieser Ansatz blockiert den Eintritt freier Viren in permissive Zellen durch Konkurrenz mit Membranrezeptoren und eliminiert virusinfizierte Zellen durch starke T-Zell-vermittelte Zytotoxizität. S-BiTE ist sowohl gegen die Original- als auch die Delta-Variante von SARS-CoV2 mit ähnlicher Wirksamkeit wirksam, was auf eine mögliche Anwendung gegen Varianten hindeutet, denen das Immunsystem entkommt. Darüber hinaus zeigten die mit S-BiTE behandelten Mäuse im humanisierten Mausmodell mit lebender SARS-COV-2-Infektion eine deutlich geringere Viruslast als die Gruppe, die nur mit Neutralisation behandelt wurde. Die S-BiTE-Strategie könnte breite Anwendung bei der Bekämpfung anderer Coronavirus-Infektionen finden.
Das Auftreten des neuartigen menschlichen Coronavirus SARS-CoV-2 hat eine weltweite Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht und die Gesundheits- und Wirtschaftssysteme weltweit beeinträchtigt1,2,3. Verschiedene Impfformate bieten nachweislich Schutz gegen die ursprünglichen oder mutierten SARS-CoV-2-Stämme mit unterschiedlicher Wirksamkeit. Berichten zufolge sind die mRNA-basierten, adenoviralen Vektor-basierten und inaktivierten Virus-basierten Impfstoffe zu 95 %, 66,9 % bzw. 65,9 % wirksam bei der Vorbeugung von COVID-194,5,6. Trotz der Verfügbarkeit dieser wirksamen Impfstoffe verlangsamte das Aufkommen von Immun-Escape-Varianten die Bekämpfung der Pandemie erheblich7,8.
Verschiedene kleine Moleküle, die auf den Eintritt oder die Replikation von SARS-CoV-2 in Zellen abzielen, werden derzeit evaluiert9 und einige von ihnen wurden für den klinischen Einsatz zugelassen10. Unter anderem hat Paxlovid den klinischen Nutzen gezeigt, indem es das Risiko eines Fortschreitens zu einer schweren COVID-19-Erkrankung oder eines Todesfalls verringert11,12,13. Neutralisierende Antikörper wurden klinisch gegen das Respiratory-Syncytial-Virus und die Ebolavirus-Erkrankung eingesetzt14,15 und wurden auch schnell gegen SARS-CoV-2-Infektionen entwickelt, um in präklinischen Modellen und in der Klinik eine starke neutralisierende Wirkung auszuüben15,16,17,18,19. Das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) ist ein wichtiger Eintrittsrezeptor für SARS-CoV-21. Mehrere Studien haben über die antivirale Wirkung von löslichen ACE2-basierten Therapeutika berichtet, die als kompetitive Inhibitoren von membranösem ACE wirken220,21,22,23. Um die Wirksamkeit weiter zu steigern, wurden bispezifische Antikörper gegen zwei Epitope24,25,26,27 und bispezifische Fusionsproteine mit Antikörperarm und löslichem ACE2-Arm28,29 entwickelt, um die Neutralisierung zu verbessern und eine entkommende Mutation von SARS-CoV-2 zu verhindern. Aufgrund der hohen Mutationsrate von SARS-CoV-2 stehen diese Therapeutika jedoch letztendlich vor der Herausforderung, der Behandlung zu entgehen oder Resistenzen zu entwickeln. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Spike-Mutationen mit der verminderten Neutralisierungsfähigkeit von monoklonalen Antikörpern und Serumantikörpern bei geimpften und genesenen Personen verbunden sind30,31,32,33,34,35,36,37,38. Um das optimale therapeutische Potenzial zu erreichen, muss daher zusätzlich zur Nutzung neutralisierender Antikörper und niedermolekularer Inhibitoren ein neuer Ansatz entwickelt werden. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, stellen wir in diesem Artikel eine SARS-CoV-2-Spike-Targeting-Strategie für bispezifische T-Zell-Engager (S-BiTE) zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion vor.
T-Zellen gelten als die wirksamsten Immunzellen bei der Eliminierung virusinfizierter Zellen oder Krebszellen39,40. BiTE, eine wirksame T-Zell-Aktivierungsstrategie, wird häufig zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt41, über seine Wirkung auf die SARS-CoV-2-Infektion ist jedoch wenig bekannt. Daher haben wir ein Fusionsprotein, S-BiTE, entwickelt, das aus der extrazellulären ACE2-Domäne (Aminosäure 1–740) besteht, um den Viruseintritt zu blockieren, und dem einkettigen variablen Anti-CD3ε-Fragment (scFv), um T-Zellen zu aktivieren und Virus- zu eliminieren. produzierende Zellen (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1a).
a Ein schematisches Diagramm des potenziellen Anti-SARS-CoV-2-Mechanismus des in dieser Studie verwendeten Spike-Targeting-Bispezifischen-T-Zell-Engagers (S-BiTE). b ELISA-Bindungskurven von S-BiTE an immobilisierte RBD des SARS-CoV-2-Spikes. c MFI der Bindung von S-BiTE an 293-Spike-Zellen, bestimmt durch Durchflusszytometrie. d Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Bindung von S-BiTE oder parentalem Anti-CD3 an primäre menschliche T-Zellen. e, f Mit dem SARS-CoV-2-Spike pseudotypisierte Lentiviren wurden mit 293-ACE2-Zellen (e) oder A549-ACE2-Zellen (f) in Gegenwart der angegebenen Konzentration von S-BiTE inkubiert. Fluoreszierende IRFP-positive Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die relative Infektion wurde als Verhältnis des IRFP-Werts in Gegenwart von S-BiTE zum IRFP-Wert in Abwesenheit von S-BiTE berechnet. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleich und Korrektur durchgeführt und die Signifikanz gezeigt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Repräsentative Ergebnisse aus einem von drei wiederholten Experimenten werden angezeigt (n = 3/Gruppe) (b–f).
SARS-CoV-2 dringt über ACE2 in SARS-CoV-2-Spike-abhängiger Weise in permissive Zellen ein1,42. Aufgrund der spezifischen und starken Wechselwirkung zwischen ACE2 und SARS-CoV-2-Spike43 verwendeten wir die extrazelluläre Domäne von ACE2 als spezifischen Liganden, um Spike-exprimierende Zellen zu identifizieren, die SARS-CoV-2-infizierte Zellen in vivo nachahmen. Diese monovalente extrazelluläre ACE2-Domäne weist eine relativ hohe Affinität zur Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des Spike-Fc-Fusionsproteins und der Spike-exprimierenden 293-Spike-Zellen auf (Abb. 1b, c). Der andere Teil des Fusionsproteins ist der monovalente Anti-CD3ε-scFv-Anteil, der im Vergleich zum parentalen bivalenten Anti-CD3-Antikörper eine deutlich verringerte Affinität für CD3ε zeigte (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1b), was die Bindung und Aktivierung von beeinträchtigt T-Zellen in Abwesenheit des SARS-CoV-2-Spikes44,45.
Der ACE2-Anteil von S-BiTE könnte als kompetitiver Rezeptor und Eintrittsblocker von SARS-CoV-2 fungieren. Um diese Hypothese zu testen, führten wir in vitro einen pseudotypisierten SARS-CoV-2-Blockadetest durch und stellten fest, dass S-BiTE die pseudotypisierte SARS-CoV-2-Infektion in permissiven 293-ACE2- und A549-ACE2-Zellen signifikant blockierte (Abb. 1e–f). .
Die Fähigkeit von S-BiTE, T-Zellen zu aktivieren, wurde in einem In-vitro-T-Zell-Aktivierungstest mit kokultivierten Zellen untersucht, die so konstruiert wurden, dass sie den SARS-CoV-2-Spike exprimieren. S-BiTE aktivierte spezifisch T-Zellen, um in Gegenwart von 293-Spike-Zellen dosisabhängig IFN-γ und TNF freizusetzen (Abb. 2a, b und ergänzende Abb. 2a, b). Im gleichen Versuchsansatz kam es selbst bei der höchsten getesteten Konzentration von S-BiTE zu keiner T-Zell-Aktivierung als Reaktion auf die Spike-negativen 293-Zellen, was auf die hohe Spezifität der ACE2-Spike-Interaktion schließen lässt. Die gleiche spezifische und empfindliche T-Zell-Aktivierung wurde als Reaktion auf Spike-exprimierende Lungenepithel-A549-Zellen beobachtet (Abb. 2c, d und ergänzende Abb. 2c, d). Um weiter zu untersuchen, ob die erhöhte T-Zell-Aktivierung zum Tod der Zielzellen führen könnte, führten wir einen auf Durchflusszytometrie basierenden Zelltötungstest durch. S-BiTE induzierte eine starke Zytotoxizität gegenüber den Spike-exprimierenden 293- und A549-Zellen und nicht gegenüber den entsprechenden Spike-negativen Kontrollzellen (Abb. 2e, f, ergänzende Abb. 2e, f und ergänzende Abb. 3). Um seine Spezifität weiter zu bestätigen, haben wir ein CD20-Ziel-BiTE etabliert und einen ähnlichen In-vitro-T-Zell-Aktivierungstest durchgeführt. S-BiTE induziert abhängig von der Spike-Expression mehr T-Zell-Aktivierung als Kontroll-CD20-BiTE (ergänzende Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass S-BiTE eine CD3-vermittelte Aktivierung menschlicher T-Zellen und die Abtötung von SARS-CoV-2-Spike-exprimierenden Zellen induzieren kann.
293-, 293-Spike-, A549-, A549-Spike-, Raji- oder Raji-Spike-Zellen wurden mit menschlichen primären T-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration von S-BiTE co-kultiviert. a–d Nach 24 Stunden wurden die IFN-γ- und TNF-Spiegel im Zellüberstand mit dem CBA-Assay analysiert. e, f Nach 48 Stunden wurde die Zytotoxizität durch Messung von CD45-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. h, i Raji- oder Raji-Spike-Zellen wurden zusammen mit menschlichen primären NK-Zellen kultiviert und mit menschlichem AB-Serum oder menschlichen T-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration von ACE2-Fc oder S-BiTE ergänzt. ADCC-, CDC- oder T-Zell-vermittelte Zytotoxizität wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit Dunnetts mehrfachem Vergleich und Korrektur durchgeführt und die Signifikanz gezeigt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Repräsentative Ergebnisse aus einem von drei wiederholten Experimenten werden angezeigt (n = 3/Gruppe) (a–i).
Zahlreiche Studien haben eine starke hemmende Wirkung neutralisierender Antikörper auf den Viruseintritt in permissive Zellen gezeigt14,15,46,47. Allerdings sind nur wenige therapeutische neutralisierende Antikörper für den klinischen Einsatz zugelassen48. Die klinische Wirksamkeit neutralisierender Antikörper kann durch das Auftreten viraler Mutationen, die ein Entkommen aus der Neutralisierung ermöglichen, oder durch die relativ schwache Fähigkeit neutralisierender Antikörper, virusinfizierte Zellen zu eliminieren, eingeschränkt sein. Eine aktuelle Veröffentlichung zeigte, dass neutralisierende Antikörper weniger wirksam sind, wenn sie 2 Stunden nach der Infektion verabreicht werden, als wenn sie 24 Stunden vor der Infektion verabreicht werden49. Daher verglichen wir die Zytotoxizität von S-BiTE- und ACE2-humanen IgG1-Fc-Fusionsproteinen in vitro. Obwohl IgG1-Fc der stärkste Isotyp bei der Vermittlung der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) und der komplementabhängigen Zytotoxizität (CDC) ist, zeigte ACE2-Fc in vitro schwache zytotoxische Wirkungen durch ADCC und CDC (Abb. 2g, h). . In der gleichen Umgebung zeigte S-BiTE eine mehr als 2000-mal höhere Abtötungswirkung auf Spike-exprimierende Raji-Zellen (Abb. 2i).
Die Eliminierung virusinfizierter Zellen, um die Produktion weiterer Viren zu verhindern, ist für die Viruskontrolle von entscheidender Bedeutung, insbesondere in den frühen Stadien der Infektion. Daher haben wir die Fähigkeit von S-BiTE bewertet, die Virusfreisetzung in unserem pseudotypisierten SARS-CoV-2-Produktionssystem zu verhindern. Um virusproduzierende Zellen nachzuahmen, wurden 293-Zellen mit vier für Viruskomponenten kodierenden Plasmiden transfiziert (Abb. 3a). Bei der Co-Kultivierung mit den manipulierten 293-Zellen löste S-BiTE signifikant die Aktivierung von T-Zellen, die Abtötung virusproduzierender Zellen und die Verringerung der Virusfreisetzung aus (Abb. 3b–d). Wichtig ist, dass unter diesen Bedingungen das Vorhandensein freier Viren im Kulturmedium keinen Einfluss auf die S-BiTE-vermittelte T-Zell-Aktivierung und Zytotoxizität gegenüber den Spike-exprimierenden Zellen hatte. Konsequenterweise war das pseudotypisierte Virus im Überstand nach der S-BiTE-Behandlung signifikant reduziert (Abb. 3e, f). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass S-BiTE der Fc-gesteuerten Ab-Therapiestrategie bei der Kontrolle von Virusinfektionen auf zellulärer Ebene überlegen ist.
Eine schematische Darstellung der Co-Kultur-Experimente zur Überwachung der Wirkung von S-BiTE auf virusproduzierende Zellen. b–d Lenti-X 293 T-Zellen wurden mit pseudotypisierten SARS-CoV-2-Plasmiden transfiziert. Nach 24 Stunden wurden der Kultur humane primäre T-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration von S-BiTE zugesetzt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die TNF- und IFN-γ-Spiegel im Überstand mit dem CBA-Assay analysiert (n = 3/Gruppe) (b). Die verbleibenden Virus freisetzenden Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet (c) und mittels Durchflusszytometrie analysiert (d) (n = 6/Gruppe). e, f Das freigesetzte Virus im Überstand wurde zur Infektion von 293-ACE2-Zellen verwendet, und virusinfizierte GFP-exprimierende Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie (e) und Durchflusszytometrie (f) analysiert (n = 5/Gruppe). Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleich und Korrektur durchgeführt und die Signifikanz gezeigt. Maßstabsbalken: 120 μm. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Repräsentative Ergebnisse aus einem von drei wiederholten Experimenten werden gezeigt (b–f).
Angesichts der starken In-vitro-Zytotoxizität von S-BiTE gegenüber Spike-exprimierenden Zellen wurde seine Zytotoxizität auch in vivo bewertet. Ähnlich wie bei anderen gemeldeten BiTE-ähnlichen Molekülen beträgt die Halbwertszeit von S-BiTE bei Mäusen etwa 1,5 Stunden (ergänzende Abbildung 4). Trotz seiner kurzen Halbwertszeit wurde im In-vivo-Zelltötungstest gezeigt, dass eine einzige Behandlung mit S-BiTE Spike-positive Zielzellen in erheblichem Maße abtötet, was auf das hohe Potenzial von S-BiTE zur Abtötung virusinfizierter Zellen schließen lässt in vivo (Abb. 4a und ergänzende Abb. 6). Um zu testen, ob S-BiTE eine unerwünschte T-Zell-Aktivierung oder T-Zell-Depletion induzieren könnte, was für sein Sicherheitsprofil von entscheidender Bedeutung ist. Humanisierten hACE2- und hCD3e-Mäusen wurde S-BiTE verabreicht. Unsere Daten zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied bei den Subtypen der Immunzellen, dem T-Zell-Aktivierungsmarker und der Infiltration von Immunzellen im Hauptgewebe gibt (ergänzende Abbildung 7).
a Ungefähr 2 × 106 CFSE-markierte Raji- und Raji-Spike-Zellen wurden mit 5 × 106 T-Zellen gemischt und intraperitoneal in NSG-Mäuse injiziert (n = 5/Gruppe). Die Mäuse wurden mit PBS oder S-BiTE behandelt und Zellen in der Bauchhöhle wurden gesammelt und 6 Stunden nach der Behandlung mittels Durchflusszytometrie analysiert. b Die kontinuierliche S-BiTE-Produktion durch stabil konstruierte S-BiTE-MSCs wurde durch ELISA nach einmonatiger Kultur gemessen (n = 2/Gruppe). c S-BiTE-MSCs wurden NSG-Mäusen injiziert (n = 6/Gruppe) und die Serumspiegel von S-BiTE wurden durch ELISA zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. d, e S-BiTE-MSCs (n = 6/Gruppe) (d) oder MSCs (n = 9/Gruppe) (e) wurden in NSG-Mäuse injiziert und die Bioverteilung im angegebenen Gewebe wurde durch q-PCR analysiert . Es wurden ungepaarte Student-T-Tests (a) und eine einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleich und Korrektur (b–e) durchgeführt und die Signifikanz gezeigt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Dargestellt sind repräsentative a–c-Ergebnisse aus einem von vier wiederholten Experimenten. d, e werden gepoolte Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten gezeigt.
Da mesenchymale Stammzellen (MSCs) außerdem in großem Umfang zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt werden und nachweislich ein gutes Sicherheitsprofil im klinischen Umfeld aufweisen51, haben wir MSCs so entwickelt, dass sie S-BiTE stabil sezernieren, um den dringenden klinischen Bedarf zu decken (Abb. 4b). Die Serumexpression von S-BiTE bei Mäusen hielt nach einer einzelnen Infusion länger als 14 Tage an (Abb. 4c). Wichtig ist, dass sich bei der Überprüfung der Bioverteilung von MSCs sowohl manipulierte als auch nicht modifizierte MSCs bevorzugt in der Lunge befanden (Abb. 4d, e), was auf ihre mögliche Anwendung bei der Behandlung von SARS-CoV-2-induzierter Lungenentzündung schließen lässt. Dieser MSC-basierte S-BiTE-Verabreichungsansatz bietet eine potenziell klinisch einsetzbare Option für die Behandlung schwerer COVID-19-Patienten.
Angesichts der potenziellen Zytotoxizität von S-BiTE bei der Eliminierung von Spike-exprimierenden Zelllinien haben wir die Wirksamkeit von S-BiTE an lebenden, virusinfizierten Zellen weiter getestet. Um eine Infektion festzustellen, haben wir A549-ACE2-Zellen 2 Stunden lang mit lebendem SARS-CoV-2 infiziert. Anschließend wurde den infizierten Zellen in Gegenwart von T-Zellen S-BiTE zugesetzt. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Pseudovirus-Assays hemmte S-BiTE die Virusreplikation in permissiven A549-ACE2-Zellen signifikant (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 5).
a, b A549-ACE2-Zellen wurden mit lebendem SARS-CoV-2 bei einer MOI von 0,05 infiziert. Nach 2 Stunden wurden freie Viren durch Waschen mit PBS entfernt und der Kultur wurden humane primäre T-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration an S-BiTE zugesetzt. 24 Stunden (a) und 48 Stunden (b) nach der Infektion wurde die SARS-CoV-2-Replikation in Zellen durch quantitative Echtzeit-PCR analysiert (n = 9/Gruppe). Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleich und Korrektur durchgeführt und die Signifikanz gezeigt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Repräsentative Ergebnisse aus einem von drei Experimenten werden gezeigt (a, b).
Aufgrund seiner hohen Mutationsrate hat sich SARS-CoV-2 schnell entwickelt, was weltweit zur Entstehung zahlreicher Varianten mit der Fähigkeit zur Immunflucht oder verbesserten Proliferations- und Übertragungsfähigkeiten geführt hat. Von diesen Varianten wurde berichtet, dass die Delta-Variante die Viruslast bei Patienten erhöht, was zur raschen weltweiten Verbreitung dieser Variante beiträgt52. Es wurde berichtet, dass die Wirksamkeit von Neutralisierungsantikörpern gegen die Delta-Variante drei- bis fünfmal geringer ist als die gegen den ursprünglichen SARS-CoV-2-Stamm30,38. Daher haben wir untersucht, ob S-BiTE gegen den Delta-Varianten-Spike wirksam ist.
Wir haben zunächst die Bindung von S-BiTE an Delta-Spike-exprimierende Zellen getestet. S-BiTE band mit einem EC50-Wert von 3,45 nM an den 293-Delta-Spike, was dem für den WT-Spike beobachteten Wert ähnelt (Abb. 6a). Anschließend untersuchten wir, ob S-BiTE in Gegenwart von T-Zellen die Lyse von Delta-Spike-exprimierenden Zellen verursachen könnte. S-BiTE könnte T-Zellen spezifisch aktivieren, um in Gegenwart von 293-Delta-Spike-Zellen oder A549-Delta-Spike-Zellen dosisabhängig IFN-γ und TNF freizusetzen (Abb. 6b, c). Im Einklang mit der erhöhten T-Zell-Aktivierung induzierte S-BiTE auch eine starke Zytotoxizität gegenüber Delta-Spike-exprimierenden 293- und A549-Zellen und nicht gegenüber den entsprechenden Spike-negativen Kontrollzellen (Abb. 6d, e). Diese Ergebnisse zeigen, dass S-BiTE eine CD3-vermittelte Aktivierung menschlicher T-Zellen induzieren und Zellen abtöten kann, die einen mutierten SARS-CoV-2-Spike exprimieren, was für die Behandlung von Varianten von SARS-CoV-2, denen das Immunsystem entkommt, nützlich sein könnte.
Ein MFI der Bindung von S-BiTE an 293-Delta-Spike-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. b–e 293-, 293-Delta-Spike-, A549- und A549-Delta-Spike-Zellen wurden mit menschlichen primären T-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration von S-BiTE co-kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die IFN-γ- und TNF-Spiegel im Überstand mit dem CBA-Assay analysiert (b, c). Nach 48 Stunden wurde die Zytotoxizität durch Messung von CD45-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt (d, e). Repräsentative Ergebnisse aus einem von drei Experimenten werden angezeigt (n = 3/Gruppe) (a–e). Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit Dunnetts mehrfachem Vergleich und Korrektur durchgeführt und die Signifikanz gezeigt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt.
Um die Schutzwirkung von S-BiTE gegen die Herausforderung mit dem SARS-CoV2-Delta-Varianten-Virus in vivo zu untersuchen, wurden transgene hACE2-hCD3ε-Mäuse als In-vivo-Modell ausgewählt. In hACE2-hCD3ε-transgenen Mäusen stellt hACE2 den Eintrittsrezeptor für die SARS-CoV2-Infektion bereit, und hCD3ε stellt das T-Zell-aktivierende Ziel durch S-BiTE dar. Um die Schutzwirkung von S-BiTE mit neutralisierendem Mittel zu vergleichen, wurde auch eine mit löslichem ACE2 behandelte Gruppe einbezogen. Das Körpergewicht der ACE2- und S-BiTE-Gruppe nahm im Vergleich zur PBS-Gruppe deutlich weniger ab (Abb. 7a). Da bei dieser transgenen Maus die Lunge und der Darm zwei Hauptgewebe sind, die mit SARS-CoV2 infiziert sind, wurde die Anzahl der viralen RNA-Kopien gemessen und bei 3 dpi verglichen. Die RNA-Kopien in der Lunge sowohl der ACE2-Gruppe als auch der S-BiTE-Gruppe waren signifikant niedriger als die der PBS-Gruppe und reduzierten sich auf etwa 10–2 bzw. 10–3 der PBS-Gruppe (Abb. 7b, c). Wichtig ist, dass die RNA-Kopien der S-BiTE-Gruppe auf etwa 10–2 der ACE2-Gruppe reduziert wurden, was auf einen starken Schutz durch S-BiTE-vermittelte T-Zell-Aktivierung hindeutet, was mit unserer In-vitro-Beobachtung übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass S-BiTE in vivo sowohl eine Neutralisierung als auch eine CD3-vermittelte T-Zell-Aktivierung induzieren kann, was einen zweischichtigen Schutz gegen immun-entkommende Varianten von SARS-CoV-2 bietet und eine potenzielle Behandlung für COVID-19 sein könnte.
a–c Alle transgenen hACE2-hCD3ε-Mäuse (n = 4/Gruppe) wurden intranasal mit der Delta-Variante von SARS-CoV2 infiziert, und 25 μg S-BiTE wurden 1, 24 und 48 Stunden nach der Infektion intranasal verabreicht. Als Kontrollen wurden gleiche Mol lösliches ACE2 oder gleiches Volumen PBS verwendet. a Das Körpergewicht der Mäuse wurde zu den angegebenen Zeitpunkten aufgezeichnet und normalisiert. b, c Der Virustiter in Lunge und Darm von drei Gruppen wurde bei 3 dpi mittels qRT-PCR bestimmt. Es wurden ungepaarte Student-T-Tests (a–c) durchgeführt und die Signifikanz gezeigt (n = 4/Gruppe). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt.
Diese Studie stellt S-BiTE als attraktive Therapiestrategie zur Behandlung von COVID-19 und anderen Krankheiten vor, die durch Coronaviren verursacht werden, die ACE2 als Rezeptor verwenden. S-BiTE könnte den Viruseintritt blockieren, indem es mit dem SARS-CoV-2-Spike bei der Bindung an Membran-ACE2 konkurriert. Darüber hinaus stimulierte S-BiTE die starken zytotoxischen Fähigkeiten von T-Zellen und erhöhte die Empfindlichkeit bei der Eliminierung virusinfizierter Spike-exprimierender Zellen. Dieses duale Funktionsdesign kann gleichzeitig die Virusausbreitung verhindern und die Virusproduktion reduzieren.
Im Vergleich zur weit verbreiteten Neutralisations-Antikörper-Strategie bietet das S-BiTE-Konzept zwei deutliche Vorteile. Der erste Vorteil ist die Verwendung von ACE2, dem Eintrittsrezeptor für SARS-CoV-2, als Targeting-Einheit, da theoretisch kein SARS-CoV-2-Mutant der ACE2-Targeting-S-BiTE-Behandlung entkommen sollte. Aufgrund der unterschiedlichen Bindungsepitope von Neutralisationsantikörpern ist es jedoch möglich, dass die neuen Mutanten von SARS-CoV-2 der vorgefertigten Behandlung mit Neutralisationsantikörpern entgehen können; Es wurde berichtet, dass Antikörper von geimpften und genesenen Personen eine verringerte Reneutralisierungsfähigkeit gegen mutierte SARS-CoV-2-Varianten zeigen30,31,32,33,34,35,36,37,38. Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um die Fähigkeit von Neutralisierungsantikörpern gegen entkommene Varianten von SARS-CoV-2 zu verbessern, beispielsweise Antikörpercocktails53,54 und bispezifische Antikörper25,55. Das Targeting mehrerer nicht überlappender Epitope, einschließlich RBD, kann die Affinität gegenüber Spike-Protein ausreichend verbessern und das Entkommen von Varianten verhindern. Ein einzigartiges bispezifisches Design, ACE-MAB (STI-4920)28, besteht aus einem verkürzten extrazellulären ACE2 und einem Antikörper gegen verschiedene Epitope des SARS-CoV-2-Spikes. Dieses Design kann gleichzeitig SARS-CoV-2 durch konkurrierendes Membran-ACE2 neutralisieren und die Bindung von CD147 blockieren, um Lungenentzündungen und Zytokinstürme zu reduzieren. Der zweite Vorteil ist die Verwendung der Anti-CD3-Einheit zur Aktivierung von T-Zellen, was den Unterschied zwischen unserer Strategie und monoklonalen, bispezifischen oder vorgemischten Neutralisierungsantikörpern ausmacht. T-Zellen sind entscheidend für die Beseitigung virusinfizierter Zellen und Tumorzellen mit hoher Empfindlichkeit. Durch die Aktivierung von T-Zellen ist S-BiTE bei der Eliminierung virusinfizierter Zellen viel wirksamer als die durch Antikörper vermittelte Zytotoxizität. Im aktuellen Design haben wir keinen Fc-Anteil in S-BiTE einbezogen, was zu einer kurzen Halbwertszeit in vivo führte. Die Funktion von S-BiTE in vivo kann durch weiteres Engineering mit Fc zur Verbesserung seiner Halbwertszeit verbessert werden. Da sie unterschiedliche Designkonzepte beinhalten, ist es außerdem möglich, eine Kombinationstherapie zu entwickeln, die sowohl Neutralisierungsantikörper als auch S-BiTE umfasst: Neutralisierungsantikörper würden sich auf die Verhinderung der Virusausbreitung konzentrieren und S-BiTE würde sich auf die Eliminierung virusproduktiver Ausgangszellen konzentrieren. Eine ähnliche Strategie kann mit einer Kombination aus Virusreplikationsinhibitoren und S-BiTE angewendet werden. Darüber hinaus glauben wir, dass, obwohl wir ACE2 als Targeting-Einheit verwendet haben, auch Antikörper gegen Spikes als Targeting-Einheiten verwendet werden können. Die Bindung an konservierte Epitope und die bindungsinduzierte T-Zell-Aktivierung sind der Schlüssel zur Entwicklung von Antikörper-basiertem BiTE gegen SARS-CoV-2-Infektionen. Ein ähnlicher Ansatz hat gezeigt, dass das ACE2-Anti-CD3-Fusionsprotein in vitro eine wirksame Aktivierung von CD8-T-Zellen gegen die Spike-exprimierende Zelllinie auslösen kann56. Unsere Arbeit hat gezeigt, dass es bei der Aktivierung von T-Zellen ausreichend ist und dass es bei der Kontrolle lebender SARS-CoV2-Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo wirksam ist.
Eine Einschränkung unserer Studie ist die Verwendung transgener ACE2-Mäuse und das Fehlen klinischer unterstützender Daten beim Menschen. Die ACE2-Expression steht unter der Kontrolle eines allgegenwärtigen Promotors, der möglicherweise nicht die physiologische Verteilung von ACE2 widerspiegelt. Ein alternativer Ansatz wären Studien an menschlichen ACE2-Knock-in-Mäusen. Da wir uns jedoch auf die Spike-vermittelte Virusneutralisierung und T-Zell-Aktivierung und nicht auf den viralen Lebenszyklus konzentrierten, gingen wir davon aus, dass die Wirksamkeit bei menschlichen ACE2-Knock-in-Mäusen ähnlich sein würde. Dennoch werden Kenntnisse über die Infektionsrate von Alveolarepithelzellen vom Typ II und anderen ACE2+-Zellen in ACE2-Knock-in-Mäusen in verschiedenen Infektionsstadien wertvolle Erkenntnisse im Hinblick auf die Bewertung von Wirksamkeit und Sicherheit liefern57.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass S-BiTE in einer T-Zell-basierten Strategie mit der Fähigkeit eingesetzt werden kann, Viren zu neutralisieren und virusproduzierende Zellen zu eliminieren. Eine weitere Optimierung der Stabilität des BiTE-Moleküls, der Auswahl der Zieleinheiten, der Neutralisierungsfähigkeit, der Sicherheit und der Kombinationsstrategien mit entzündungshemmenden Therapien ist erforderlich, um den klinischen Wert des S-BiTE-Ansatzes bei der Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion zu verbessern.
Lenti-X 293 T-Zellen wurden von Clontech (Mountain View, CA, USA) gekauft. Die A549-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten. Raji-Zellen wurden von der Stammzellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) bereitgestellt. Menschliche PBMCs aus Nabelschnurblut, NK-Zellen und MSCs wurden von Shanghai Longyao Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) bereitgestellt. Plasmide, die für SARS-CoV-2-Spike und ACE2 kodieren, wurden von Molecular Cloud (Nanjing, China) erhalten und mit dem Puromycin-Resistenzmarker in das lentivirale Vektorplasmid pCDH-EF (System Biosciences, Mountain View, CA, USA) subkloniert.
Um die SARS-CoV-2-Spike-, SARS-CoV-2-Delta-Spike- oder ACE2-exprimierenden Zelllinien zu etablieren, wurden Lenti-X 293 T-, A549- oder Raji-Zellen mit den SARS-CoV-2 Spike-, SARS-CoV-2 Delta-Spike- oder ACE2-exprimierendes Lentivirus. Nach der Selektion mit Puromycin wurden die gepoolten resistenten Zellen durch Durchflusszytometrie-Analyse identifiziert. Das Zellkulturmedium wurde mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mmol/L L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt. Lenti-X 293 T-Zellen, A549-Zellen und ihre Derivate wurden in vollständigem DMEM kultiviert. Raji-Zellen und ihre Derivate wurden in vollständigem RPMI-Medium kultiviert.
Für die Produktion von S-BiTE-, ACE2-Fc- und RBD-Fc-Fusionsproteinen wurden DNA-Sequenzen, die die angegebenen Proteine kodieren, in den pCDH-EF-Vektor (System Biosciences) kloniert. Plasmide, die das angegebene Fusionsprotein enthielten, wurden in Lenti-X 293 T-Zellen transfiziert, und die Überstände wurden gesammelt und unter Verwendung einer Diamond Protein A- oder Ni Bestarose FF-Säule gemäß dem Protokoll des Herstellers (Bestchrom, Shanghai, China) gereinigt.
Lenti-X 293 T-Zellen wurden mit den Lentivirus-Paketkomponentenplasmiden Gap/pol (#12251, Addgene), RSV-Rev (#12253, Addgene), pCDH-EF-IRFP-luc und pcDNA3.1(+)-transfiziert. 2019-nCoV-spike-P2A-eGFP (#MC_0101087, Molecular Cloud). Überstände, die Lentiviruspartikel enthielten, wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion zur direkten Verwendung oder Konzentration durch Ultrazentrifugation gesammelt. Der Virustiter in TU/ml wurde durch durchflusszytometrische Analyse der transduzierten 293-ACE2-Zellen bestimmt.
Im Virusneutralisationstest wurde S-BiTE seriell auf die angegebenen Konzentrationen in vollständigem Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DMEM) verdünnt. Pseudotypisierte lentivirale Partikel wurden auf 293-ACE2- oder A549-ACE2-Monoschichten in 96-Well-Platten in Gegenwart von 10 μg/ml Polybren und der angegebenen Konzentration von S-BiTE inokuliert und 48 Stunden lang bei 37 °C weiter inkubiert. Zur Infektion von A549-ACE2-Zellen wurde eine 60-minütige Rotation bei 2500 U/min und 32 °C verwendet, um die Infektionseffizienz zu verbessern. Die IRFP-Reporteraktivität wurde mit CytoFLEX S (Beckman Coulter) gemessen. Der Prozentsatz der Infektiosität wurde als Verhältnis der IRFP-Anzeige in Gegenwart des Fusionsproteins zur IRFP-Anzeige in Abwesenheit des Fusionsproteins berechnet. Die halbmaximalen Hemmkonzentrationen (IC50) wurden mithilfe einer 4-Parameter-Logistikregression (GraphPad Prism, Version 8) bestimmt.
Einzelzellsuspensionen wurden mit konjugierten Antikörpern angefärbt. Proben aus In-vivo-Experimenten wurden vor der Antikörperfärbung 10 Minuten lang mit Anti-CD16/32 (Anti-FcγIII/II-Rezeptor, Klon 2.4G2) vorinkubiert. Alle fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper wurden von Biolegend (San Diego, CA, USA) oder eBioscience (San Diego, CA, USA) gekauft. Alle fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper wurden von Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, USA) erworben. Die Proben wurden auf einem CytoFLEX S (Beckman Coulter) analysiert und die Daten wurden mit der FlowJo-Software (TreeStar, Inc.) analysiert.
ELISA-Platten (Jet Biofil, Guangzhou, China) wurden über Nacht bei 4 ° C mit 2 μg/ml RBD-Fc beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,05 % Tween-20 enthielt, gewaschen und mit 2 % FBS in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Verdünnte S-BiTE-haltige Proben wurden zugegeben und die Platten 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten dreimal gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit alkalischer Phosphatase (AP)-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Fab-Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories), verdünnt auf 1:2000 in Blockierungspuffer, inkubiert. Die AP-Aktivität wurde bei 405 nm unter Verwendung eines SpectraMax 190-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, San Jose, CA) mit p-Nitrophenylphosphat (Guangzhou Howei Pharmaceutical Technology Co. Ltd., Guangzhou, China) als Substrat gemessen. Die Bindungswerte der halbmaximalen effektiven Konzentration (EC50) wurden mit GraphPad Prism Version 8 berechnet.
293-CD3 und humane primäre T-Zellen wurden mit den angegebenen S-BiTE-haltigen Proben 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, dreimal mit 2 % FBS in PBS gewaschen und mit 2 μg/ml RBD-hFc bei 4 °C inkubiert 30 Minuten lang bei C inkubiert, dreimal gewaschen und mit 1:200 verdünnten Alexa Fluor 647-konjugierten Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc-Antikörpern (Jackson ImmunoResearch Laboratories) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen.
293-Spike- oder 293-Delta-Spike-Zellen wurden mit den angegebenen S-BiTE-haltigen Proben 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, dreimal mit 2 % FBS in PBS gewaschen und mit 1:200 verdünntem Alexa Fluor 647-Konjugat inkubiert Ziegen-Anti-Maus-Fab-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Anschließend wurden die Zellen einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen.
Lentivirus wurde durch vorübergehende Transfektion von Lenti-X 293 T-Zellen mit einem Vier-Plasmid-System hergestellt. Überstände, die die lentiviralen Partikel enthielten, wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion gesammelt und zur Etablierung stabiler Zelllinien verwendet.
Menschliche T-Zellen wurden mit Anti-CD3 (0,25 μg/ml; Bio X Cell, Lebanon, NH, USA) und Anti-CD28 (1 μg/ml; Bio für den In-vitro-Aktivierungs- und Abtötungstest in vollständigem RPMI 1640, ergänzt mit IL-2 (50 IE/ml) (Beijing Four Rings Bio-Pharmaceutical Co., Peking, China) und IL-21 (4 ng/ml; Biolegend). Ungefähr 1 × 105 T-Zellen wurden mit 2,5 × 104 Raji- oder Raji-Spike-Zellen kokultiviert; 3,75 × 104 293-, 293-Spike- oder 293-Delta-Spike-Zellen; oder 1,25 × 104 A549-, A549-Spike- oder A549-Delta-Spike-Zellen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von S-BiTE. Nach einem Tag wurden die TNF- und IFN-γ-Spiegel im Überstand durch einen Cytometric Bead Array (CBA)-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers (BD Biosciences, San Jose, CA) analysiert. Nach 2 Tagen wurde der Abtötungstest mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Anti-CD45-Antikörper wurden verwendet, um T-Zellen von 293- oder A549-Zellen zu unterscheiden. Anti-CD3- und Anti-CD19-Antikörper wurden verwendet, um T-Zellen von von Raji abgeleiteten Zellen zu unterscheiden.
A549- und A549-Spike-Zellen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit CFSE (MedChemExpress, Shanghai, China) bzw. CellTraceTM Violett (Life Technologies Corporation, Eugene, OR, USA) markiert. Dann wurden 1,5 × 104 mit Fluoreszenzfarbstoff markierte A549- und A549-Spike-Zellen auf einer 96-Well-Platte ausplattiert. Nach 6 Stunden wurden der Kultur 1 × 105 T-Zellen und verschiedene Konzentrationen von S-BiTE zugesetzt. Die Abtötungseffizienz wurde mit dem Operetta CLS (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) bestimmt.
Lenti-X 293 T-Zellen wurden mit Gag/Pol (#12251, Addgene), RSV-Rev (#12253, Addgene), pcDNA3.1(+)-2019-nCoV-spike-P2A-eGFP (#MC_0101087, MolecularCloud) transfiziert ) und pCDH-EF-GFP-luc in 24-Well-Platten. Nach 24 Stunden wurden der Kultur 1 × 105 T-Zellen mit oder ohne S-BiTE-Stimulation zugesetzt. Die Überstände wurden 48 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Der Virustiter wurde durch Infektion von 293-ACE2-Zellen gemessen. Die TNF- und IFN-γ-Spiegel im Überstand wurden mit dem CBA-Assay analysiert. Die verbleibenden virusfreisetzenden Zellen wurden mittels REVOLVE-Fluoreszenzmikroskopie (ECHO, San Diego, CA, USA) abgebildet und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Der Hemmungstest für lebendes SARS-CoV-2 wurde in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) an der Fudan-Universität durchgeführt. A549-ACE2-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und mit lebendem SARS-CoV-2 (GenBank: MT121215.1) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,05 infiziert. Nach 2 Stunden wurden die freien Viren durch Waschen mit PBS entfernt. Der Kultur wurden humane primäre T-Zellen in Gegenwart von 1 oder 10 μg/ml S-BiTE zugesetzt. 24 und 48 Stunden nach der Infektion wurden Zellen gesammelt und mRNA isoliert. Die quantitative Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) wurde verwendet, um den SARS-CoV-2-mRNA-Virustiter mit dem One-Step PrimeScript RT-PCR Kit (Takara, Shiga, Japan) mit den folgenden Primern zu testen:
SARS-CoV-2-NF: GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT;
SARS-CoV-2-NR: CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG;
SARS-CoV-2-N-Sonde: 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'.
hACE2-hCD3ε-transgenen Mäusen wurden intranasal 25 μg S-BiTE, gleiche Mol ACE2-His oder gleiches Volumen PBS verabreicht. Eine Stunde später wurden Mäuse intranasal mit 10.000 PFU der SARS-CoV2-Delta-Variante infiziert. 25 μg S-BiTE, gleiche Mol ACE2-His oder gleiches Volumen PBS wurden 24 und 48 Stunden nach der Infektion verabreicht. Drei Tage später wurden Lungen und Därme von drei Gruppen zur RNA-Isolierung und RT-PCR gesammelt.
Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6 J-Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, China) gekauft. Achtzehn Wochen alte transgene hACE2-hCD3ε-Mäuse und sechs bis acht Wochen alte weibliche NOD-PrkdcscidIL2rγtm1 (NSG)-Mäuse wurden vom Shanghai Model Organisms Center, Inc. (Shanghai, China) gekauft. Alle Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Die Pflege und Verwendung der Tiere entsprach den Protokollen und Richtlinien der Institution und des NIH, und alle Studien wurden vom Animal Care and Use Committee der Shanghai Jiao Tong University und dem Institutional Laboratory Animal Care der Fudan University (20220609-001) genehmigt.
Raji- und Raji-Spike-Zellen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers (MedChemExpress) mit 5 bzw. 50 μM CFSE markiert. Ungefähr 2 × 106 CFSE-markierte Raji- und Raji-Spike-Zellen wurden mit 5 × 106 T-Zellen gemischt und NSG-Mäusen intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden mit PBS oder S-BiTE behandelt und Zellen in der Bauchhöhle wurden gesammelt und 6 Stunden nach der Behandlung mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate (n) jedes Experiments wurde in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle Replikationsversuche waren erfolgreich. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 durchgeführt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) oder den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Student-t-Tests und einer ein- oder zweiseitigen Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Mehrfachvergleichskorrektur durchgeführt.
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.
Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Quelldaten für alle Abbildungen finden Sie in den Zusatzdaten 1. Die im Rahmen der Studie generierten Rohdaten und analysierten Datensätze sind zu umfangreich, um öffentlich geteilt zu werden. Sie sind jedoch auf begründete Anfrage für Forschungszwecke bei den entsprechenden Autoren erhältlich.
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Referenzen herunterladen
Wir danken den Mitgliedern der Core Facility of Microbiology and Parasitology des SHMC und des Biosafety Level 3 Laboratory am Shanghai Medical College der Fudan University, insbesondere Qian Wang, Di Qu und Gaowei Hu. XY wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss-Nr. 32261143731 und 81971467) und der Sheng Yushou Foundation unterstützt. LL wurde vom National Key R&D Program of China unter der Fördernummer (2021YFC2300703 und 2022YFC2604102), dem Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (ZD2021CY001 an LL und WX) und dem Program of Shanghai Academic/Technology Research Leader (Fördernummer 20XD1420300) unterstützt. .
Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Fanlin Li, Wei Xu, Xiaoqing Zhang, Wanting Wang.
Sheng Yushou Center of Cell Biology and Immunology, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China
Fanlin Li, Xiaoqing Zhang, Wanting Wang, Ping Han, Haiyong Wang, Yanqin Xu, Min Li, Lilv Fan, Huihui Zhang, Qiang Dai, Hao Lin, Xinyue Qi, Jie Liang und Xuanming Yang
Gemeinsames internationales Forschungslabor für Stoffwechsel- und Entwicklungswissenschaften, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China
Fanlin Li, Wanting Wang, Ping Han, Haiyong Wang, Yanqin Xu, Min Li, Lilv Fan, Huihui Zhang, Qiang Dai, Hao Lin, Xinyue Qi, Jie Liang und Xuanming Yang
Schlüssellabor für medizinische molekulare Virologie (MOE/NHC/CAMS), Shanghai Institute of Infectious Disease and Biosecurity, School of Basic Medical Sciences and Biosafety Level 3 Laboratory, Fudan University, Shanghai, 200032, China
Wei Xu, Shan Su, Shibo Jiang, Youhua Xie und Lu Lu
Abteilung für Physiologie, Naval Medical University, Shanghai, 200433, China
Xiaoqing Zhang
Shanghai Longyao Biotechnology Limited, Shanghai, 201203, China
Xin Wang
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XY, LL und YH.X. hat das Projekt entworfen. FL, WX, XZ, WW, SS, PH, HW, YQ.X., ML, LF, HZ, QD, HL, XQ, JL, XW, SJ und XY führten die Experimente durch. FL, XZ, WX, WW und XY analysierten die Ergebnisse und verfassten das Manuskript unter Einbeziehung aller Co-Autoren.
Korrespondenz mit Youhua Xie, Lu Lu oder Xuanming Yang.
Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Communications Biology dankt Luca Varani, Roberto Speck und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Zhijuan Qiu und David Favero. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar. Dieses Dokument enthält nur Gutachterkommentare und Gegenschreiben für Versionen, die bei Communications Biology berücksichtigt werden.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Li, F., Xu, W., Zhang, X. et al. Eine Spike-Targeting-Strategie für bispezifische T-Zell-Engager bietet einen zweischichtigen Schutz vor einer SARS-CoV-2-Infektion in vivo. Commun Biol 6, 592 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04955-3
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Eingegangen: 21. Februar 2023
Angenommen: 18. Mai 2023
Veröffentlicht: 01. Juni 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04955-3
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