Erforschung der antimikrobiellen, antioxidativen, krebshemmenden, biokompatiblen und larviziden Wirkung von Selen-Nanopartikeln, die vom endophytischen Pilzstamm Penicillium verhagenii hergestellt werden

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9054 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hierin wurden vier endophytische Pilzstämme, die in gesunden Knoblauchwurzeln leben, verwendet, um Selen-Nanopartikel (Se-NPs) durch grüne Synthese herzustellen. Penicillium verhagenii erwies sich als der effizienteste Se-NP-Produzent mit einer rubinroten Farbe, die eine maximale Oberflächenplasmonresonanz bei 270 nm zeigte. Die gebildeten Se-NPs waren kristallin, kugelförmig und gut angeordnet ohne Aggregation und hatten eine Größe von 25 bis 75 nm mit einem Zetapotentialwert von −32 mV, was auf eine hohe Stabilität hinweist. Es wurden konzentrationsabhängige biomedizinische Aktivitäten der auf P. verhagenii basierenden Se-NPs beobachtet, einschließlich einer vielversprechenden antimikrobiellen Aktivität gegen verschiedene Krankheitserreger (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, C. glabrata, C. Tropicalis usw.). C. parapsilosis) mit einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 12,5–100 µg mL–1. Die biosynthetisierten Se-NPs zeigten eine hohe antioxidative Aktivität mit DPPH-Fängerprozentsätzen von 86,8 ± 0,6 % bei einer Konzentration von 1000 µg mL–1 und sanken auf 19,3 ± 4,5 % bei 1,95 µg mL–1. Interessanterweise zeigten die Se-NPs auch Antikrebsaktivität gegen PC3- und MCF7-Zelllinien mit einem IC50-Wert von 225,7 ± 3,6 bzw. 283,8 ± 7,5 µg mL–1, während sie mit normalen WI38- und Vero-Zelllinien biokompatibel bleiben. Darüber hinaus waren die grün synthetisierten Se-NPs wirksam gegen Larven eines medizinischen Insekts, Aedes albopictus, mit einer maximalen Mortalität von 85,1 ± 3,1, 67,2 ± 1,2, 62,10 ± 1,4 und 51,0 ± 1,0 % bei einer Konzentration von 50 µg mL–1 für Larven im I-, II-, III- und IV-Stadium. Diese Daten unterstreichen die Wirksamkeit endophytischer Pilzstämme für eine kostengünstige und umweltfreundliche Se-NP-Synthese für verschiedene Anwendungen.

Selen ist ein wichtiges Spurenelement für das Gedeihen von Mikroorganismen und ein essentieller Mikronährstoff für die Gesundheit von Tier und Mensch. Trotz seiner vorteilhaften Eigenschaften unterliegt es einem engen therapeutischen Fenster. Eine übermäßige Aufnahme organischer und anorganischer Selenverbindungen kann zu Toxizität führen. Glücklicherweise sind Selen-Nanopartikel (Se-NPs) weniger toxisch als organische und anorganische Selenverbindungen1. Nanomaterialien (1–100 nm) zeichnen sich durch zahlreiche chemische und physikalische Eigenschaften aus, die sie von ihren Gegenstücken in Massenmaterialien unterscheiden. Diese Materialien wurden in den Bereichen Landwirtschaft, Umwelt und Medizin übernommen und angewendet2,3. Darüber hinaus unterscheiden sich die biosynthetisierten Se-NPs von denen, die durch chemische und physikalische Methoden hergestellt werden, dadurch, dass sie besser mit menschlichen Geweben und Organen kompatibel sind4. Die biologischen Synthesewege wurden mithilfe von Pflanzen und Pilzen erforscht, um Nanopartikel auf nachhaltige und umweltfreundliche Weise herzustellen5,6. Endophyten sind Mikroorganismen, darunter Pilze, Bakterien und Actinomyceten, die das innere Pflanzengewebe besiedeln, ohne pathologische oder schädliche Symptome zu verursachen7. In jüngster Zeit sind endophytische Mikroben im Bereich der Nanobiosynthese aufgetaucht, da sie wirksam aktive Metaboliten produzieren, die potenziell für die Herstellung von NPs unterschiedlicher Form und Größe mit großer Stabilität verwendet werden können. In diesem Zusammenhang sind endophytische Pilze anderen Pilzarten hinsichtlich der Menge und Aktivität der produzierten Metaboliten überlegen8. Frühere Studien zeigten, dass Endophyten in der Wirtspflanze viele biologisch aktive Sekundärmetaboliten wie Flavonoide, Alkaloide, Saponine, Sesquiterpene, Cyclopeptide, Polyketone, organische Säuren und Lactone produzieren können. Darüber hinaus haben die Wirtspflanze und ihre endophytischen Symbionten viele biologische Eigenschaften gemeinsam, wie z. B. krebsbekämpfende, antimikrobielle, anti-HIV- und entzündungshemmende Aktivitäten9.

Allium sativum L. (Knoblauch) ist eine mehrjährige Pflanze, die seit mehr als 4000 Jahren häufig als Heilmittel in der traditionellen Medizin verwendet wird. In den ägyptischen Papyri wurden Rezepte für die Verwendung von Knoblauch zur Behandlung von Schlangenbissen, Rhinitis und Herzerkrankungen aufgezeichnet. Im antiken Griechenland wurde Knoblauch zur Behandlung von Lungen- und Darmproblemen eingesetzt. Im Zweiten Weltkrieg wurde es auch zur Behandlung von Geschwüren und Wunden der Verwundeten eingesetzt. Im Allgemeinen hat Knoblauch viele antimykotische, antimikrobielle, krebshemmende, protozoenhemmende, blutdrucksenkende, gerinnungshemmende, krampflösende, gerinnungshemmende, fiebersenkende, fiebersenkende, schmerzstillende und antioxidative Eigenschaften10.

Als Katalysatoren für die Biosynthese von Se-NPs wurden verschiedene Pilzarten verwendet, darunter Trichoderma harzianum, Aureobasidium pullulans, Phoma glomerata und Mortierella humilis, zusätzlich zu den endophytischen Pilzen Aspergillus quadrilineatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus und Fusarium equiseti11,12 . Kürzlich wurde über vielversprechende medizinische Anwendungen mykosynthetisierter Se-NPs aus Penicillium citrinum und ihre Wirksamkeit als Antikrebsmittel und Antioxidantien berichtet13. Darüber hinaus zeigten die vom Endophyten Penicillium crushosum gewonnenen biogenen Se-NPs eine starke antikrebsbekämpfende Wirkung, ein breites antimikrobielles Wirkungsspektrum (gegen gramnegative, grampositive Bakterien und vier verschiedene Candida-Arten) und eine dauerhafte katalytische Aktivität für den Abbau von Methylenblau. Diese Aktivitäten waren bei heller Beleuchtung ausgeprägter als bei dunkler Beleuchtung14. Darüber hinaus gelten Mücken als Hauptüberträger für die Übertragung von Krankheitserregern bei Menschen und Tieren wie Viren, Protozoen, Pilzen und Bakterien. Tödliche Krankheiten wie Gelbfieber, Dengue-Fieber, Filariose, Malaria, Chikungunya, West-Nil-Virus und Zika-Virus sind durch Mücken übertragene Krankheiten15. Se-NPs, die insbesondere durch umweltfreundliche Ansätze synthetisiert werden, weisen aufgrund ihrer geringen negativen Auswirkungen auf Menschen und das Ökosystem eine hohe mückentötende Wirkung auf16.

Dementsprechend sollte die aktuelle Studie die Fähigkeit endophytischer Pilze untersuchen, Se-NPs auf einfache, effiziente und umweltfreundliche Weise herzustellen. Zunächst wurden verschiedene endophytische Pilzstämme aus Knoblauchgewebe isoliert und identifiziert. Ihr Potenzial bei der Biosynthese von Se-NPs wurde untersucht. Als nächstes wurden die so gebildeten NPs mithilfe von UV-Vis-Spektroskopie, Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR), Röntgenbeugung (XRD), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Zetapotential charakterisiert. Schließlich wurden ihre antibakteriellen, Anti-Candida-, Antioxidans-, Antikrebs-, Biokompatibilitäts- und larviziden Eigenschaften untersucht.

Endophytische Pilze gehören zu den bedeutenden Organismen mit einem breiten Spektrum an biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen, einschließlich der Produktion aktiver Metaboliten, der Verwendung als Biodünger aufgrund ihrer pflanzenwachstumsfördernden Aktivität, der phytopathogenen Kontrolle und der grünen Synthese von Nanomaterialien mit einzigartigen Eigenschaften17,18 . In der aktuellen Studie wurden Knoblauchwurzeln als Quelle für die Isolierung endophytischer Pilzstämme verwendet. Aus gesammelten gesunden Wurzeln wurden vier Pilzisolate mit der Bezeichnung AR.1–AR.4 gewonnen. Diese Stämme wurden mit traditionellen Methoden auf der Grundlage kultureller und mikroskopischer Charakterisierungen als Penicillium sp. identifiziert. (AR.1), Aspergillus niger (AR.2), Alternaria alternata (AR.3) und Penicillium sp. (AR.4) (Abb. 1). In einer ähnlichen Studie wurden zwölf endophytische Pilzstämme der Gattungen Aspergillus spp., Alternaria spp., Penicillium spp., Cladosporium sp., Chaetomium sp. und Fusarium sp. untersucht. wurden aus Allium sativum19 isoliert.

Isolierung und primäre Identifizierung von Pilzstämmen, die aus der Wurzel von Allium sativum isoliert wurden.

In letzter Zeit neigen Forscher dazu, neue Wirkstoffe mit einem umweltfreundlichen Ansatz herzustellen. Unter diesen Wirkstoffen besitzen Nanomaterialien eine hohe Aktivität in verschiedenen Bereichen der Landwirtschaft, Medizin und Industrie20. Die Synthese dieser Materialien durch umweltfreundliche Ansätze wird bevorzugt, um die negativen Auswirkungen chemischer und physikalischer Ansätze zu vermeiden21. Endophytische Mikroben, darunter Pilze, Bakterien und Actinomyceten, gelten aufgrund der Sekretion großer aktiver Metaboliten, die als Reduktions- und Verkappungsmittel verwendet werden, als vielversprechende Quellen für die grüne Synthese von Nanomaterialien8. In der aktuellen Studie wurde die Wirksamkeit endophytischer Pilzstämme bei der Synthese von Se-NPs untersucht. Nach Zugabe des Metallvorläufers (Na2SO3) zum Filtrat der Pilzbiomasse änderte sich die Farbe von farblos zu rot, was allmählich zunahm, was auf die Bildung von Se0 aufgrund der Reduktion von SeO32– hinweist. Die vorherige Mischung blieb 24 Stunden lang im Dunkeln, um die vollständige Reduktion des Metalls und keine weitere Farbveränderung zu bestätigen. Kürzlich wurde die vollständige Reduktion von Na2SO3 durch die Wirkung von Metaboliten, die vom endophytischen Pilzstamm P. crushosum abgesondert werden, beobachtet, während die Se0-Form nach 24-stündiger Inkubation abgeschlossen war14. Auch die Herstellung von Se-NPs durch die Reduktion von Na2SO3 unter Verwendung von Metaboliten, die von Trichoderma atroviride abgesondert werden, wurde nach 24 Stunden beobachtet, und es wurde keine weitere Farbänderung festgestellt22.

Dabei wurde nach 24 Stunden die Absorption der gebildeten Farbe gemessen, um die maximale Oberflächenplasmonresonanz (SPR) zu ermitteln. Wie gezeigt, zeigte die Inkubationszeit einen positiven Einfluss auf die Farbintensität, ohne dass es zu einer Verschiebung des SPR-Bereichs kam. Abbildung 2 zeigt, dass der Absorptionspeak bei Wellenlängen von 270 nm, 265 nm, 265 nm und 280 nm für die endophytischen Pilzstämme AR.1, AR.2, AR.3 bzw. AR.4 aufgezeichnet wurde. Interessanterweise wurden die maximale Farbintensität und der maximale SPR-Absorptionspeak für den Stamm AR.1 aufgezeichnet. Die erhaltenen Ergebnisse stimmten mit den Berichten überein, wonach die maximale SPR für von Pilzstämmen synthetisierte Se-NPs im Bereich von 250–300 nm liegt. Beispielsweise zeigten unter 75 endophytischen Pilzstämmen nur vier Stämme, die als Aspergillus quadrilineatus, A. ochraceus, A. terreus und Fusarium equiseti identifiziert wurden, eine hohe Aktivität für die Se-NP-Synthese, basierend auf Farbveränderung und maximalem SPR, das bei 265 nm auftrat11. Außerdem wurde die maximale SPR von Se-NPs, die von Penicillium corylophilum und dem endophytischen Pilzstamm P. crushosum hergestellt wurden, bei 275 bzw. 270 nm beobachtet14,23.

UV-Vis-Spektroskopie von Se-NPs, die von vier endophytischen Pilzstämmen hergestellt wurden, um die wirksamsten Isolate basierend auf der maximalen SPR auszuwählen.

Den Daten der UV-Vis-Spektroskopie zufolge wurde der als AR.1 bezeichnete endophytische Pilzstamm als der wirksamste Stamm für die grüne Synthese von Se-NPs ausgewählt. Dieser Stamm wurde einer molekularen Identifizierung auf der Grundlage der Amplifikation und Sequenzierung von internen transkribierten Spacer-Genen (ITS) unterzogen und als Penicillium verhagenii identifiziert (Abb. 3). Die ITS-Sequenz des endophytischen Stammes AR.1 wurde in der GenBank unter der Zugangsnummer OP471232 hinterlegt. Penicillium besteht aus verschiedenen Arten, die sich durch ihre Fähigkeit auszeichnen, verschiedene aktive Metaboliten zu produzieren, die als Reduktions- und Stabilisierungsmittel während der grünen Synthese verwendet werden 24.

Phylogenetischer Baum des wirksamsten endophytischen Pilzstamms.

Wie bereits erwähnt, war die Farbänderung, gefolgt vom Nachweis des maximalen SPR mittels UV-Vis-Spektroskopie, der erste Monitor für die erfolgreiche Bildung von Se-NPs. Das endophytische Pilzisolat AR.1 zeigte die höchste Farbintensität und den höchsten Absorptionspeak bei 270 nm, was dem SPR für Se-NPs entspricht. Die funktionellen Gruppen kommen in Pilzbiomasse vor und ihre Aktivität bei der Reduktion und Stabilisierung synthetisierter Se-NPs wurde durch Fourier-Transformations-Infrarotanalyse (FT-IR) untersucht. Wie gezeigt, enthielt das Filtrat der Pilzbiomasse nur vier Peaks bei den Wellenzahlen 3380, 2068, 1634, 535 cm–1, wohingegen im Fall von Se-NPs die Anzahl der Peaks bei den Wellenzahlen 3400, 2880, 1565, 1415 auf neun anstieg. 1380, 920, 780, 512 und 410 cm–1 (Abb. 4A). Der starke und breite Peak bei 3380 cm–1 konnte den O–H- und N–H-Gruppen von Proteinen und Aminosäuren zugeschrieben werden25,26, dieser Peak war bei Se-NPs auf 3400 cm–1 verschoben. Der Breitenpeak bei 2068 cm–1 hängt mit der Kohlenhydrateinheit zusammen, die von endophytischen Pilzstämmen abgesondert wird. Darüber hinaus entspricht der Peak bei 1634 cm–1 der Carbonylgruppe (C=O), die mit der streckenden NH-Gruppe der im Biomassefiltrat vorhandenen Polysaccharide überlappt4. Dieser Peak wurde nach der grünen Synthese von Se-NPs auf 1565 cm–1 verschoben. Ein Peak bei 535 cm–1 im Biomassefiltrat könnte auf die Streckung C–l der Haloverbindung zurückzuführen sein. Das Vorhandensein anderer Peaks im FT-IR-Diagramm von Se-NPs könnte mit der Wechselwirkung zwischen Metaboliten im Biomassefiltrat mit Natriumselenit während der Reduktion und Verkappung der so gebildeten Se-NPs zusammenhängen. Der mittlere Peak bei 2880 cm–1 bedeutet C–H-streckendes Alkan, während die mittleren Peaks im Bereich von 1380–1420 cm–1 dem gebogenen O–H von Carbonsäure entsprechen könnten27,28. Die Peaks im Bereich von 400–800 cm–1 entsprechen der Biegung und Streckung von Se-O, die aus der Reaktion von Se-NPs mit Carbonylgruppen resultiert und letztendlich eine Überzugsschicht um die Se-NP-Oberfläche bildet, die die Aggregation und Agglomeration verhindert wie bereits berichtet29. Basierend auf der FT-IR-Analyse zeigte das Vorhandensein verschiedener Metaboliten in Pilzbiomassefiltraten wie Proteine, Polysaccharide, Kohlenhydrate und Aminosäuren eine entscheidende Rolle bei der Reduktion von Natriumselenit zur Bildung von Se-NPs, gefolgt von der Bildung einer Beschichtung, die die verstärkt NPs stabilisieren und verhindern die Aggregation.

Charakterisierung synthetisierter Se-NPs mittels FT-IR (A) und XRD (B).

Die Kristallstruktur der gebildeten Se-NPs wurde durch Röntgenbeugungsanalyse (XRD) untersucht (Abb. 4B). Wie gezeigt, zeigte das XRD-Muster acht Absorptionspeaks von (100), (101), (110), (102), (111), (201), (112) und (202), die mit der Bragg-Beugung bei 2θ-Werten von übereinstimmten 23,5°, 29,3°, 41,3°, 45,51°, 52,53°, 55,71° bzw. 62,74°. Das erhaltene XRD-Muster wurde mit denen abgeglichen, die die kristalline Struktur von Se-NPs gemäß der JCPDS-Standardkarte Nr. 06-0362 bestätigten. Das erhaltene XRD-Muster ist kompatibel mit veröffentlichten Studien zur grünen Synthese von Se-NPs14,30,31. Das Fehlen zusätzlicher Peaks im XRD-Diagramm zeigte die hohe Reinheit der synthetisierten Se-NPs (bestätigt durch EDX-Spektren). Die durchschnittliche Kristallitgröße von Se-NPs wurde auf der Grundlage einer XRD-Analyse unter Verwendung der Debye-Scherrer-Gleichung zu 55 nm berechnet. In einer aktuellen Studie wurden die durchschnittlichen Kristallitgrößen, die von vier endophytischen Pilzflecken, Aspergillus quadrilineatus, A. ochraceus, A. terreus und Fusarium equiseti, erzeugt werden, auf der Grundlage einer XRD-Analyse zu 55,4, 45,2, 30,9 bzw. 30,1 nm berechnet11.

Die morphologischen Eigenschaften von durch Pilze synthetisierten Se-NPs wie Größe, Form und Aggregation sind Hauptfaktoren, die die biologischen Aktivitäten beeinflussen, und wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse untersucht. Die Abbildungen 5A und B zeigen die Kugelform synthetisierter Se-NPs, die ohne Agglomeration gut angeordnet sind und Größen im Bereich von 25–75 nm mit einer durchschnittlichen Größe von 44,1 ± 15,4 nm aufweisen. Das TEM-Bild von Se-NPs, die bei einer Konzentration von 1,5 mM durch Nutzung von Metaboliten von Acinetobacter sp. gebildet wurden. SW30 zeigte die erfolgreiche Herstellung einer Kugelform mit einer Größe von 78 nm32. Der Einbau von NPs in verschiedene Anwendungen hängt hauptsächlich von verschiedenen Faktoren wie Verkappungsmittel, Oberflächenladung, Form, Größe und Agglomeration ab21. Mit abnehmender Größe nahm die Aktivität zu. Beispielsweise zeigten Se-NPs, die durch Biomassefiltrat von Pantoea agglomerans synthetisiert wurden, bei kleineren Größen eine höhere antioxidative Aktivität33. Außerdem variieren die Aktivitäten von NPs je nach Form. Beispielsweise zeigten Se-NPs eine hohe antioxidative Aktivität bei kubischer Form und eine hohe antimikrobielle Aktivität bei sphärischer Form34.

(A) Transmissionselektronenmikroskopie zeigt die Kugelform, (B) Größenverteilung, (C) die dynamische Lichtstreuung und (D) Zetapotentialanalyse von Se-NPs, die vom endophytischen Pilzstamm P. verhagenii hergestellt wurden.

Die Größe von pilzbasierten Se-NPs in kolloidaler Lösung wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) ermittelt. Wie gezeigt, betrug die durchschnittliche hydrodynamische Größe der synthetisierten Se-NPs 91,2 nm (Abb. 5C). In der aktuellen Studie ist die durch DLS ermittelte durchschnittliche Größe größer als die durch TEM und XRD ermittelte. Dieser Befund könnte darauf zurückzuführen sein, dass das DLS den hydrodynamischen Rückstand (hydratisierten Zustand) misst, während TEM den Durchmesser des festen Zustands berechnet35. Darüber hinaus wird DLS durch Beschichtungsmittel und eine inhomogene Verteilung beeinträchtigt, wodurch die Größen zunehmen36,37. In einer ähnlichen Studie betrugen die durchschnittlichen Partikelgrößen von Se-NPs, die durch TEM erhalten wurden, 15–40 nm, wohingegen die durch DLS erhaltenen 20–60 nm 4 betrugen, was durch die hydrodynamische Beschichtung um die Partikel erklärt wurde.

Die Stabilität synthetisierter Se-NPs wurde anhand des Zeta-Potentials untersucht, das die elektrische Ladung auf der NP-Oberfläche misst. In der aktuellen Studie weisen die pilzbasierten Se-NPs einen Zeta-Potenzialwert von -32 mV auf, was auf die hohe Stabilität hinweist (Abb. 5D). In ähnlicher Weise betrug der Zeta-Potenzialwert von Se-NPs, die durch wässrigen Extrakt von Carica papaya hergestellt wurden, –32 mV38. Die Stabilität der in der aktuellen Studie hergestellten Se-NPs könnte auf das Vorhandensein einer negativen Ladung zurückgeführt werden, die die negative elektrostatische Kraft zwischen den Partikeln erhöht und somit die Dispersion verbessert. Außerdem kann die Stabilität von NPs anhand der Zetapotentialwerte wie folgt klassifiziert werden: instabil, mäßig, stabil und hohe Stabilität für die Werte ± 0–10, ± 10–20, ± 20–30 bzw. ˃ ± 3039 . Darüber hinaus könnte das Fehlen von Doppelladungen (positiv und negativ) und das Vorhandensein einer einzelnen Ladung (negativ) auf den NP-Oberflächen die Stabilität erhöhen, da die Dispersion zwischen den Partikeln die gleiche Ladung trägt, um eine Aggregation zu vermeiden. Dhanjal und Cameotra40 berichteten, dass das Vorhandensein positiver Ladungen auf der Oberfläche einiger Partikel und negativer Ladungen auf anderen in derselben Lösung deren Aggregation verstärkt.

Der Großteil der Mortalität oder Morbidität weltweit ist auf mikrobielle Infektionskrankheiten zurückzuführen. Bakterielle Infektionen nehmen aufgrund des Missbrauchs von Antibiotika täglich zu, was zur Entstehung antibiotikaresistenter Stämme führt6,41. Darüber hinaus sind Candida-Stämme opportunistische Pilze und gelten als der häufigste Erreger von Infektionskrankheiten wie oraler Candidiasis, Candidämie, Vaginitis, systematischen Infektionen und kutaner Candidiasis bei immungeschwächten Patienten42. Daher ist es wichtig, neue Wirkstoffe zu entwickeln, die sicher und kostengünstig sind, um diese Herausforderungen zu meistern. Selenionen erwiesen sich als antimikrobielle Wirkstoffe und wurden aufgrund ihrer vielversprechenden antimykotischen Wirkung früher als Zusatz zu Antischuppenshampoos verwendet43. Leider werden sie aufgrund ihrer Toxizität für Säugetierzellen nur in geringen Mengen verwendet38. Daher konzentrierten sich die Forscher darauf, ihre Toxizität durch die Umwandlung in den Nanomaßstab zu verringern.

In der aktuellen Studie wurde die Aktivität von grün synthetisierten Se-NPs zur Hemmung des Wachstums pathogener Bakterien untersucht, die durch Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus sowie verschiedene pathogene Candida-Arten, die als C. albicans und C. glabrata bezeichnet werden, vertreten sind , C. Tropicalis und C. Parapsilosis wurden mit der Bohrlochdiffusionsmethode untersucht. Die Datenanalyse zeigte, dass die antimikrobielle Aktivität von Se-NPs konzentrationsabhängig war. Die gewonnenen Erkenntnisse waren mit der veröffentlichten Literatur kompatibel. Beispielsweise zeigten die durch die Wirkung der Metaboliten im wässrigen Extrakt von Ceropegia Bulbosa gebildeten Se-NPs eine hohe antimikrobielle Aktivität gegen B. subtilis und E. coli bei 100 µg mL–1, gefolgt von Konzentrationen von 75, 50 und 25 µg ml–116. In der aktuellen Studie wurde die höchste antibakterielle und Anti-Candida-Aktivität bei 400 µg mL–1 mit Hemmzonen von 15,7 ± 0,6, 15,3 ± 0,6, 20,7 ± 0,7, 18,3 ± 0,6, 18,3 ± 0,6, 17,7 ± 0,5, 17,3 aufgezeichnet ± 0,5 und 16,7 ± 0,6 mm für B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans, C. Tropicalis, C. glabrata bzw. C. parapsilosism (Abb. 6A, B). Die Aktivität verringerte sich bei niedrigen Konzentrationen auf 12,3 ± 0,6, 11,7 ± 0,5, 16,7 ± 0,7, 14,0 ± 0,0, 12,3 ± 0,6, 14,0 ± 0,0, 13,0 ± 1,0 und 12,7 ± 0,6 bei 200 µg mL–1 synthetisiertem Se- NPs für die gleiche Sequenz der oben genannten Testorganismen. Die im wässrigen Blattextrakt von Withania somnifera gebildeten Se-NPs zeigten eine antibakterielle Aktivität gegen B. subtilis, S. aureus und Klebsiella pneumoniae mit einer Hemmzone von 14,0 ± 0,0, 19,7 ± 0,6 bzw. 12,0 ± 0,0 mm ohne Aktivität gegen E. coli6. Außerdem zeigten die durch Biomassefiltrat von Penicillium corylophilum hergestellten Se-NPs eine breite antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien (B. subtilis und S. aureus) und gramnegative Bakterien (P. aeruginosa und E. coli)23.

Antimikrobielle Aktivität von Se-NPs, die von einem endophytischen Pilzstamm von P. verhagenii hergestellt werden, gegen grampositive und gramnegative Bakterien (A) und einzellige Pilze (B) in verschiedenen Konzentrationen. Die unterschiedlichen Buchstaben bei gleicher Konzentration bedeuten, dass es sich bei den Daten um signifikante Unterschiede handelt (p ≤ 0,005) (n = 3).

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die niedrigste Konzentration, die das mikrobielle Wachstum wirksam hemmt. Die Auswahl bioaktiver Verbindungen, die in den biomedizinischen Sektor integriert werden sollen, hängt von der Bewertung des MHK-Werts ab44. Dabei zeigten die synthetisierten Se-NPs je nach Organismus unterschiedliche MHK-Werte. Beispielsweise betrug der MHK-Wert für grampositive Bakterien 50 µg mL–1, während er für gramnegative Bakterien, P. aeruginosa und E. coli, 12,5 bzw. 25 µg mL–1 betrug (Abb. 6A). Andererseits lag der MHK-Wert der getesteten einzelligen Pilze im Bereich von 50–100 µg mL–1 (Abb. 6B). Kürzlich wurde der MHK-Wert der grün synthetisierten Se-NPs gegen Candida-Arten je nach Art der Art so variiert, dass er im Bereich von 25–200 µg mL–1 liegt14. Außerdem wurden die antibakterielle Aktivität und die MHK-Werte entsprechend dem Biosyntheseansatz variiert. Beispielsweise betrug der MHK-Wert von Se-NPs, die von Aspergillus quadrilineatus und A. ochraceus gegen E. coli synthetisiert wurden, 62,5 µg mL–1, während er für die von A. terreus und Fusarium equiseti hergestellten Se-NPs 250 µg mL–1 betrug11. Dieser Befund kann auf das von Mikroorganismen oder Pflanzen abgesonderte Schutzmittel zurückgeführt werden, das eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung der Nanomaterialien spielt8,45. Basierend auf den erhaltenen Daten zeigten die so gebildeten Se-NPs des endophytischen Pilzstamms P. verhagenii eine hohe antimikrobielle Aktivität gegenüber pathogenen Bakterien und Candida spp.

Die antibakterielle Aktivität von Se-NPs könnte mit der Zellwandstruktur zusammenhängen, die bei grampositiven Stämmen aus dicken Peptidoglycanschichten besteht, verglichen mit dünnen Schichten bei gramnegativen Stämmen. Dieser Unterschied kann die Diffusion von NPs innerhalb der Zellen beeinflussen. Die dicke Peptidoglycanschicht kann die Diffusion von Se-NPs verhindern oder verzögern, was zu einer geringeren antimikrobiellen Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien als gegenüber gramnegativen Bakterien führt46. Die Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien kann auf die starke elektrostatische Abstoßung von Se-NPs gegenüber der negativen Ladung von Lipopolysacchariden zurückgeführt werden, die in gramnegativen Bakterien in größeren Mengen vorhanden sind als in grampositiven. Dies führte zu einer starken Ablagerung von Se-NPs auf der Oberfläche grampositiver Stämme, was zum Zelltod führte47. Ein weiterer antimikrobieller Mechanismus von Se-NPs könnte die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beim Eintritt in mikrobielle Zellen sein. Diese ROS wie H2O2, O2•– und •OH können die selektive Permeabilitätsfunktion der Zytoplasmamembran zerstören, den Stress innerhalb der Zelle erhöhen, zur Hemmung der DNA-Replikation führen, die Proteinsynthese zerstören und den normalen Zellstoffwechsel hemmen. Alle diese Funktionsstörungen führen zum Zelltod48,49.

Interessanterweise zeigte die durch Pilze vermittelte grüne Synthese von Se-NPs eine hohe Aktivität gegen verschiedene Candida-Stämme. Dieser Befund könnte mit seiner Aktivität zur Zerstörung des Sterolprofils in der Candida-Zellwand durch Hemmung des Ergosterol-Biosynthesewegs zusammenhängen50. Außerdem führt eine starke Anreicherung von Se-NPs auf der Candida-Zellwand zur Reaktion von Se mit schwefelhaltigen Aminosäuren wie Methionin und Cystein51. Als Folge dieser Wechselwirkung wurde die neue Struktur S-Se-S gebildet und veränderte die Struktur von Proteinen, was zur Blockierung ihrer katalytischen Funktionen führte52.

Die Abfangaktivität freier Radikale durch grün synthetisierte Se-NPs wurde mit der DPPH-Methode im Vergleich zur Kontrolle (Ascorbinsäure) untersucht (Abb. 7). Die Datenanalyse ergab, dass die Aktivität zum Abfangen freier Radikale konzentrationsabhängig ist. Die Aktivität steht im direkten Verhältnis zur Konzentration der grün synthetisierten Se-NPs. Der erhaltene Befund stimmte mit veröffentlichten Literaturstellen überein, in denen berichtet wurde, dass die Fängeraktivität von Se-NPs, die von Pflanzen, Pilzen und Actinomyceten hergestellt werden, von deren Konzentrationen abhängt4,11,53. Die maximale DPPH-Fängeraktivität wurde bei 1000 µg mL–1 mit Prozentsätzen von 86,8 ± 0,6 % aufgezeichnet, verglichen mit Ascorbinsäure bei derselben Konzentration, die einen Prozentsatz von 97,3 ± 0,2 % aufwies (Abb. 7). Die DPPH-Fängeraktivität erreichte 19,3 ± 4,5 % bei der niedrigsten Se-NPs-Konzentration von 1,95 µg mL–1. Dies weist darauf hin, dass die synthetisierten Se-NPs in geringen Konzentrationen eine antioxidative Aktivität besitzen. In einer ähnlichen Studie zeigten Se-NPs, die von endophytischen Pilzstämmen von A. quadrilineatus, A. ochraceus, A. terreus und F. equiseti hergestellt wurden, eine DPPH-Fängeraktivität mit Prozentsätzen von 93,8 ± 9,5, 83,6 ± 6,3, 79,2 ± 9,3. bzw. 79,8 ± 4,7 % bei 1000 µg mL–1 im Vergleich zu 100 % Abfangaktivität für Ascorbinsäure. Diese Prozentsätze erreichten 25,8 ± 2,1, 28,4 ± 2,6, 18,0 ± 3,5 und 10,3 ± 2,1 % bei einer Konzentration von 25 µg mL–1 im Vergleich zur Kontrolle (21,3 ± 1,5 %) bei derselben Konzentration11. In der aktuellen Studie betrugen die Werte von EC50 (effektive Konzentration zum Abfangen von 50 % der freien Radikale) 28,7 ± 1,6 µg mL–1 und 5,4 ± 0,8 µg mL–1 für Se-NPs bzw. Ascorbinsäure. Unsere Daten waren nicht mit den aufgezeichneten Daten kompatibel, wonach der EC50-Wert von Se-NPs, die durch Biomassefiltrat des Pilzstamms Monascus purpureus synthetisiert wurden, 85,9 µg mL–154 betrug, was auf die vielversprechende antioxidative Aktivität der hier synthetisierten Se-NPs hinweist.

DPPH-Fängeraktivität von Se-NPs, die von endophytischem P. verhagenii synthetisiert werden, im Vergleich zu Ascorbinsäure als Kontrolle.

Antioxidative Substanzen oder Fänger freier Radikale sind solche, die Zellschäden verhindern, die durch instabile Moleküle oder freie Radikale verursacht werden, die unter Stress wie Krankheitserregern, Schadstoffen, radioaktiven Substanzen, Toxinen usw. synthetisiert werden.55 Die Hauptsymptome dieser freien Radikale sind Rheuma, Immunschwäche, Parkinson, Leukämie, Herzinfarkt, Stoffwechselstörungen und Atemversagen56. Der Ursprung dieser Radikalfänger sind entweder natürliche Quellen wie Phenole, Flavonoide, Phytoöstrogene und Tannine oder synthetische Quellen wie Nanomaterialien38. Metall- und Metalloxid-Nanopartikel zeichnen sich durch ihre Fähigkeit als Radikalfänger aus33,56. Die Aktivität von Se-NPs als Antioxidantien könnte auf ihre Wirksamkeit bei der Aktivierung von Selenoenzymen wie Glutathionperoxidase zurückgeführt werden, die die Zellen unter In-vivo-Bedingungen vor der schädlichen Wirkung freier Radikale schützen4,45. Außerdem könnten die Antioxidantien von NPs auf die Hemmung und Neutralisierung der Bildung freier DPPH-Radikale durch Elektronentransfer zurückzuführen sein57. Darüber hinaus können die einzigartigen Eigenschaften von NPs, insbesondere die große Oberflächengröße, die antioxidative Aktivität verbessern58.

Die Antikrebsaktivität von grün synthetisierten Se-NPs wurde gegenüber zwei Krebszellen mit der Bezeichnung MCF7 und PC3 untersucht, während die Biokompatibilität gegenüber zwei normalen Zellen mit der Bezeichnung Vero und WI38 bewertet wurde. Die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellproliferation aufgrund der Behandlung mit Se-NPs wurden mit der MTT-Assay-Methode bewertet. Die Datenanalyse zeigte, dass die durch endophytische Pilzstämme vermittelte grüne Synthese von Se-NPs eine vielversprechende Antikrebsaktivität gegen getestete Krebszelllinien auf Konzentrationsbasis aufweist. Bei niedrigen Konzentrationen (≤ 62,5 µg mL–1) haben die Se-NPs keine signifikanten Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von Krebs- und normalen Zelllinien (die Zelllebensfähigkeit liegt im Bereich von 89–99 % für alle Zellen), wohingegen bei a Bei einer Konzentration von 125 µg mL–1 betrug die Lebensfähigkeit von PC3 89,7 ± 0,9 % im Vergleich zu den Krebszelllinien MCF7 (99,6 ± 3,2 %) und zwei normalen Zelllinien (98,4 ± 3,1 % und 99,9 ± 1,2 % für Vero und WI38). bzw.) (Abb. 8). Durch die Erhöhung der Se-NPs-Konzentration auf 500 µg mL–1 verringerte sich die Lebensfähigkeit der Krebszelllinien stark und erreichte 26,3 ± 1,8 % bzw. 8,3 ± 0,9 % für MCF7 und PC3 im Vergleich zur Lebensfähigkeit normaler Zelllinien (44,4). ± 0,7 % und 43,1 ± 0,9 % für Vero bzw. WI38). Im Einklang mit den erhaltenen Ergebnissen hing die Aktivität phytosynthetisierter Se-NPs von den Konzentrationen gegenüber den Krebszelllinien MCF-7, Caco-2, IMR-32 und der normalen Zelllinie Vero38 ab. Auch die antiproliferative Aktivität von Se-NPs, die durch die Nutzung von Metaboliten von Acinetobacter sp. SW30 gegen 4T1, MCF7, NIH/3T3 und HEK293 waren konzentrationsabhängig32. Die Datenanalyse zeigte, dass die Toxizität der pilzvermittelten grünen Synthese von Se-NPs gegenüber PC3 im Vergleich zu MCF7 am höchsten war (Abb. 8). Andererseits war die Empfindlichkeit zweier normaler Zellen gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Se-NPs ähnlich, außer dass bei 250 µg mL–1 die Lebensfähigkeit von WI38 im Vergleich zu Vero-Zellen verringert war.

Zelllebensfähigkeit mithilfe der MTT-Assay-Methode von Krebszellen (PC3 und MCF7) und normalen Zellen (Vero und WI38) nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Se-NPs.

Die IC50 (Konzentration zur Hemmung der zellulären Lebensfähigkeit um 50 %) von Se-NPs wurde mit 225,7 ± 3,6, 283,8 ± 7,5, 454,8 ± 29,9 und 472,8 ± 5,8 µg mL–1 für PC3-, MCF7-, WI38- und Vero-Zellen bewertet Zeilen bzw. Die erhaltenen Daten zeigen die Zielorientierung von Se-NPs in Richtung krebsartiger Zelllinien in geringen Konzentrationen im Vergleich zu normalen Zelllinien. Dieser Befund bestätigte die Fähigkeit, Se-NPs in biomedizinischen Bereichen in einer Konzentration unter 300 µg mL–1 zu integrieren, um aktiver gegen Krebszellen zu sein und dabei vernachlässigbare Auswirkungen auf normale Zellen zu haben. Die minimalen zytotoxischen Wirkungen synthetisierter Se-NPs auf normale Zellen könnten mit dem normalen Redoxgleichgewicht zusammenhängen, wie bereits berichtet59.

Die mikroskopische Untersuchung von mit Se-NPs behandelten Zellen zeigte eine vollständige oder teilweise Zerstörung einer Monoschicht von Epithelzellen unter hohen Konzentrationen (siehe ergänzende Daten, Abb. S1, S2, S3, S4). Darüber hinaus neigen die Zellen bei diesen Konzentrationen dazu, rund oder körnig zu werden, zu schrumpfen, zu schwimmen und ihre Gesamtzahl zu verringern. Diese negativen Auswirkungen wurden bei niedrigen Konzentrationen reduziert, insbesondere bei normalen Zellen. Die geringe Größe ist der Grund für die zytotoxische Aktivität, da sie die Zellmembranen von Säugetieren durchdringen und mit Zellbestandteilen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Aminosäuren interagieren, was zu zellulärer Dysfunktion führt60. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Se-NPs in den Zellen die Bildung von ROS erhöhen, die schädliche Auswirkungen auf die Mitochondrien haben und letztendlich zum apoptotischen Tod führen14. Shiny et al. berichteten, dass die Exposition von Lungenkarzinomzellen (A549) gegenüber Silber- und Platin-Nanopartikeln zur Zerstörung des zellulären Zytoskeletts und damit zur Freisetzung spezifischer Enzyme namens zytosolische LDH-Enzyme führt, die für die Lyse der Zellen verantwortlich sind60.

Der Einsatz chemischer Substanzen zur Bekämpfung von Mückenüberträgern hatte nicht nur negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, sondern auch auf die Umwelt und führte zur Entstehung neuer resistenter Vektoren61. Daher ist es dringend erforderlich, sichere, umweltfreundliche, kostengünstige und schnell wirkende Wirkstoffe zu entwickeln. Hierin zeigten pilzbasierte Se-NPs eine hohe Mortalität gegenüber den verschiedenen Larvenstadien (I, II, III und IV) von Aedes albopictus in verschiedenen Konzentrationen (10, 20, 30, 40 und 50 µg mL–1) (Tabelle 1). Wie gezeigt, war die Aktivität von Se-NPs gegen Larven im Stadium konzentrationsabhängig. Der gewonnene Befund war mit der Literatur über die Wirkung von grün synthetisierten Nanomaterialien gegen Mückenvektoren kompatibel62,63. Die Datenanalyse ergab, dass die höchste Sterblichkeit (85,1 ± 3,1 %) für die Larve im ersten Stadium bei einer Konzentration von 50 µg mL–1 verzeichnet wurde, wohingegen dieser Prozentsatz durch Verringerung der Konzentration auf 59,0 ± 2,0 % bei 10 µg mL–1 verringert wurde. 1. Andererseits zeigten die so gebildeten Se-NPs eine hohe Aktivität gegen Larven im IV-Stadium mit Sterblichkeitsraten von 31,3 ± 1,5, 34,1 ± 0,0, 42,2 ± 1,0, 46,2 ± 1,6 und 51,0 ± 1,0 % für Konzentrationen von 10–50 µg ml–1.

Die Varianzanalyse ergab, dass die LC50 und LC90 für Larven im I-, II-, III- und IV-Stadium von A. albopictus (15,2, 33,6, 45,5 und 54,3 µg mL–1) und (132,8, 138,9, 142,4 und 180,3 µg) betrugen ml–1) (Tabelle 1). In einer ähnlichen Studie lagen die LC50 und LC90 pflanzlicher Se-NPs gegen Larven von A. albopictus im Stadium von (15,2–52,3 mg L–1) bzw. (132,7–178,3 mg L–1)16. Aus wässrigem Blattextrakt von Clausena dentata hergestellte Se-NPs zeigten eine larvizide Aktivität gegenüber Culex quinquefasciatus, Aedes Aegypti und Anopheles stephensi mit LC50-Werten von 99,6, 104,1 bzw. 240,7 mg L–164.

Die Aktivität von Se-NPs gegenüber A. albopictus könnte auf ihre Wirksamkeit zurückgeführt werden, die Zellmembran zu durchdringen und mit verschiedenen Zellkomponenten zu interagieren, was zu Funktionsstörungen führt16. Außerdem kann das Vorhandensein von Se-NPs in der Zelle den oxidativen Stress erhöhen, der letztendlich zum Zelltod führt, indem toxische ROS erzeugt werden. Darüber hinaus können Se-NPs die Zellen zerstören, indem sie mit der -SH-Gruppe von Aminosäuren oder phosphorhaltigen Nukleinsäuren reagieren65.

Die Wurzeln von Knoblauch (Allium sativum L.) von gesunden Pflanzen wurden gesammelt und als Quelle für die Isolierung von Pilzendophyten verwendet. Unsere Arbeit steht im Einklang mit institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen. Knoblauch kommt auf der ganzen Welt vor und bedarf keiner Genehmigung oder Lizenz, da es sich bei der Art, mit der wir arbeiten, um eine kosmopolitische Nutzpflanze handelt, die laut IUCN weder gefährdet noch endemisch ist. Die Wurzelproben wurden auf landwirtschaftlichen Flächen im Gouvernement El-Menofia, Ägypten (30° 38′ 40,9″ N 30° 56′ 49,9″ E) mit Genehmigung (Nummer: EM2/2022) des örtlichen Landwirtschaftsamtes im Gouvernement gesammelt. Wurzeln gesunder Knoblauchpflanzen wurden gesammelt und in sterilisierten Polyethylenbeuteln aufbewahrt, bevor sie mithilfe einer Kühlbox ins Labor gebracht wurden. Bei der Probenentnahme wurden fünf einzelne Pflanzen gewonnen und von jeder Pflanze wurden drei einzelne Wurzeln gesammelt.

Die gesammelten Wurzeln werden dreimal mit Leitungswasser gespült, um anhaftende Partikel zu entfernen, und anschließend mit sterilisiertem destilliertem H2O gespült. Danach wurden die Wurzeln einer Oberflächensterilisation unterzogen, indem sie der Reihe nach in die folgenden Lösungen getaucht wurden: sterilisiertes destilliertes H2O für 60 s, Ethanol (70 %) für 30 s, Natriumhypochlorit (2,5 %) für vier Minuten, Ethanol (70 % ) für 30 s und waschen Sie abschließend die Wurzeln mit sterilisiertem Dis. H2O. Um den Oberflächensterilisationsprozess zu bestätigen, wird das sterilisierte Dis. H2O aus der letzten Wäsche wurde in geeignete Agarmedien für das Wachstum verschiedener Mikroorganismen (Nähragar für Bakterien, Czapek Dox für Pilze und Stärkenitrat für Actinomyceten) beimpft. Die beimpften Platten wurden unter geeigneten Bedingungen inkubiert und täglich beobachtet, um das Wachstum von Mikroben zu überprüfen. Das Fehlen von mikrobiellem Wachstum in beimpften Agarmedien zeigt den Erfolg des Oberflächensterilisationsprozesses an.

Die sterilisierten Wurzeln wurden in kleine Segmente (4 mm/Segment) geschnitten und zehn Teile pro einzelne Pflanze wurden auf die Oberfläche der Czapek-Dox-Agarplatte (5 Segmente/Platte) gelegt, der Chloramphenicol zur Unterdrückung des Bakterienwachstums zugesetzt war. Die Platten wurden 15 Tage lang bei 25 ± 2 °C inkubiert und täglich beobachtet, um das Auftreten von Pilzwachstum aus dem inneren Pflanzengewebe zu überprüfen. Anschließend wurden sie entnommen und erneut auf eine neue Platte geimpft. Die gereinigten Pilzisolate wurden anhand morphologischer und kultureller Merkmale gemäß Standardschlüsseln für Penicillium spp.66, Aspergillus spp.67 und Alternaria spp.68 identifiziert.

Die Wirksamkeit isolierter endophytischer Pilzstämme als Biokatalysator zur Herstellung von Se-NPs wurde untersucht. Eine Scheibe (10 mm) von jedem Pilzstamm wurde separat in 100 ml Czapek Dox-Bouillon-Medium inokuliert und 7 Tage lang bei 25 ± 2 °C unter Schüttelbedingungen (150 U/min) inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Pilzbiomasse durch Filtration der inokulierten Nährmedien mit Whatman Nr. 1 gesammelt und dreimal mit sterilisierter Desinfektionslösung gewaschen. H2O, um anhaftende Medienbestandteile zu entfernen. Ungefähr 7 g der für jeden Pilzstamm gesammelten Biomasse wurden in 100 ml dispergiert. H2O und 24 Stunden bei 25 ± 2 °C inkubiert, gefolgt von Zentrifugation, um das Biomassefiltrat zu sammeln, das zur Herstellung von Se-NPs wie folgt verwendet wurde: 85,5 mg Metallvorläufer (Na2SO3) wurden in 10 ml dis gelöst. H2O hinzugefügt und zu 90 ml Pilzbiomasse gegeben, um eine Endkonzentration von 5 mM zu erhalten. Die Mischung wurde eine Stunde lang bei 40 °C gerührt und der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 8 eingestellt, bevor sie über Nacht unter dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Die Umwandlung der Farbe von farblos in rubinrot zeigt die Bildung von Se-NPs an, gefolgt von der Messung ihrer Absorption bei einer Wellenlänge im Bereich von 200–700 nm, um die maximale Oberflächenplasmonresonanz (SPR) zu ermitteln31. Als Kontrolle wurde das Filtrat der Pilzbiomasse ohne Metallvorläufer verwendet. Der wirksamste Pilzstamm wurde aufgrund seiner Wirksamkeit zur Bildung der höchsten rubinroten Farbe und des maximalen SPR-Werts ausgewählt. Das Ergebnis wurde gesammelt und dreimal mit Dis. gespült. H2O, bevor es 4 Stunden lang bei 200 °C im Ofen getrocknet wird.

Das ausgewählte wirksamste endophytische Pilzisolat mit der Bezeichnung AR.1 wurde einer molekularen Identifizierung durch Amplifikation und Sequenzierung von ITS-Genen gemäß dem Protokoll von White et al.69 unterzogen. Das ITS-Gen wurde unter Verwendung eines Primers von ITS1 (5' CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') und ITS4 (5' TCCTCGCTTATTGATATGC 3') amplifiziert. Die PCR-Mischung enthält Folgendes: 0,5 mM MgCl2, PCR-Puffer, 2,5 U Taq-Polymerase (QIAGEN, GERMANTOWN, MD-20874, USA), 0,5 µM jedes Primers, 2,25 mM dNTP, extrahierte genomische DNA (5 ng). Der Lauf wurde mit einem DNA Engine Thermal Cycler (PTC-200, BIO-RAD, USA) durchgeführt und drei Minuten lang auf 94 °C eingestellt, gefolgt von 30 Zyklen bei 94 °C für eine halbe Minute, 55 °C für eine halbe Minute. Eine Minute lang 72 °C und schließlich zehn Minuten lang 72 °C. Die PCR-Produkte wurden mit Agarosegel (1 %) überprüft, bevor sie auf GATC Biotech [einem Unternehmen, das als Partner von Sigma Aldrich, Kairo, Ägypten einen DNA-Sequenzierer (ABI-3730xl) verwendet] sequenziert wurden. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der im GenBank-Softwarepaket ClustalX 1.8 (http://www.clustal.org/clustal2)70,71 hinterlegten Datenbank verglichen. Die phylogenetische Analyse wurde mit der Software „Neighbor-Joining Method“ (MEGA v6.1) durchgeführt, wobei die Zuverlässigkeit durch Bootstrap-Analyse (1000 Wiederholungen) getestet wurde.

Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) (Cary-660-Modell) wurde verwendet, um die verschiedenen funktionellen Gruppen in der Pilzbiomasse sowie in so gebildeten Se-NPs nachzuweisen. In dieser Analyse wurden 10 mg synthetisierter Se-NPs mit KBr gemischt und zu einer Scheibe gepresst, die einem Scan bei einer Wellenlänge im Bereich von 400–4000 cm-122 unterzogen wurde. Die kristallographische Struktur der durch Pilze vermittelten grünen Synthese von Se-NPs wurde durch Röntgenbeugung (XRD, PANalytical-X'Pert-Pro-MRD) mit einer CuKα-Elektrode als Röntgenquelle (λ = 1,54 Å) beurteilt. Die Analyse wurde bei Strom und Spannung von 30 mA bzw. 40 kV im Bereich von 2θ-Werten von 10°–80° durchgeführt. Die Kristallitgröße wurde basierend auf der XRD-Analyse nach der Debye-Scherrer-Gleichung wie folgt berechnet:

Dabei ist K eine Scherrer-Konstante von 0,94, λ die Wellenlänge des Röntgenstrahls von 1,54, β die volle Breite des Beugungspeaks bei einem halben Maximum und θ der Beugungswinkel.

Die morphologischen Eigenschaften (Form und Größe) wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL, Ltd-1010, Tokio, Japan) überprüft. Das grüne synthetisierte Se-NP-Pulver wurde unter Ultraschall in H2O suspendiert und einige Tropfen auf das TEM-Kohlenstoffgitter gegeben. Das beladene Gitter wurde trocknen gelassen, bevor es der Analyse unterzogen wurde72,73.

Dynamische Lichtstreuung (DLS) (Nano-ZS, Malvern Ltd, Malvern, UK) wurde verwendet, um die Größenverteilung in der kolloidalen Lösung zu untersuchen. Die synthetisierten Se-NPs wurden in einem hochreinen Lösungsmittel (MiliQ H2O) dispergiert, um das Auftreten von Schatten auf dem Signal während der Streuanalyse zu verhindern. Darüber hinaus wurde die Oberflächenladung synthetisierter Se-NPs mit einem Zeta-Sizer-Gerät (Nano-ZS, Malvern, UK)74 bewertet.

Die Aktivität pilzbasierter Se-NPs als antimikrobielle Wirkstoffe wurde gegenüber einer Gruppe pathogener Mikroben untersucht, darunter Escherichia coli ATCC8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 (gramnegative Bakterien), Bacillus subtilis ATCC6633 und Staphylococcus aureus ATCC6538 (grampositive Bakterien). Außerdem wurde die Aktivität gegenüber einer Gruppe klinischer Candida-Stämme mit der Bezeichnung C. albicans, C. glabrata, C. Tropicalis und C. parapsilosis bewertet, die im Microbiology Laboratory des National Research Centre in Gizeh, Ägypten, gesammelt wurden. Die antimikrobielle Aktivität wurde mithilfe der Agar-Well-Diffusionsmethode75 bewertet. Bei dieser Methode wurden die ausgewählten Bakterien- und Pilzstämme über Nacht auf Nähragar (fertig vorbereitet, Oxoid) und Sabouraud-Dextrose-Agarplatten (enthaltend gL-1: Dextrose, 40; Pepton, 10; Agar, 15) subkultiviert 35 ± 2 °C. Danach wurde eine einzelne Kolonie von jedem Organismus aufgenommen und mit einem sterilisierten Tupfer gleichmäßig auf der Oberfläche der Muller-Hinton-Agarplatte (fertig vorbereitet, Oxoid) verteilt, gefolgt von der Herstellung von vier Vertiefungen (0,6 mm Durchmesser) in jeder Platte. Diese Vertiefungen wurden mit 100 µL der vorbereiteten Se-NPs-Lösung (400, 300, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 µg mL–1) gefüllt. Das Lösungsmittelsystem (DMSO) lief mit dem Experiment als Kontrolle. Die gefüllten Platten wurden 24 Stunden lang bei 35 ± 2 °C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Ergebnisse als Durchmesser einer klaren Zone aufgezeichnet, die sich um jede Vertiefung bildete. Es wurde die niedrigste Se-NP-Konzentration ermittelt, die das mikrobielle Wachstum hemmt (MIC-Wert). Das Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Die antioxidative Aktivität der durch Pilze vermittelten Biosynthese von Se-NPs wurde mit der DPPH-Methode (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) bewertet. Bei dieser Methode wurden verschiedene Konzentrationen biosynthetisierter Se-NPs (1,95–1000 µg mL–1) in hochreinem Wasser (Milli-Q H2O) hergestellt. Danach wurde ein ml der vorbereiteten Lösung in ein Reagenzglas gegeben, das einen ml DPPH (in Methanol zubereitet) und 450 µL Tris-HCl-Puffer (pH 7,4, 50 mM) enthielt, gut gemischt und dann bei 37 °C inkubiert eine halbe Stunde unter Schütteln (100 U/min) im Dunkeln. Eine weitere Versuchsreihe mit Ascorbinsäure (Positivkontrolle) wurde unter den gleichen Bedingungen/Konzentrationen durchgeführt. Auch die Negativkontrolle, bei der es sich um DPPH und Tris-HCl-Puffer in Abwesenheit von Se-NPs oder Ascorbinsäure handelte, wurde mit dem Experiment unter den gleichen Inkubationsbedingungen durchgeführt. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Absorption der gebildeten Farbe bei 517 nm gemessen. Die Prozentsätze der freien Radikalfänger wurden mithilfe der folgenden Gleichungen 6 berechnet:

Dabei sind AbC und AbT die Absorptionen der Kontrolle (Ascorbinsäure) bzw. der Behandlung (Se-NPs).

Die beiden Krebszellen, bezeichnet als MCF7 (menschlicher Brustkrebs) und PC3 (Prostatakrebszelle), sowie zwei normale Zellen, dargestellt durch Vero (Affennieren-Epithelzelle) und WI38 (menschlicher Lungenfibroblast), wurden von der Holdinggesellschaft für biologische Produkte gekauft und Impfstoffe (VACSERA), Kairo, Ägypten.

Die Antikrebsaktivität von Se-NPs gegen zwei Krebszellen (MCF und PC3) und der Biokompatibilitätstest gegenüber zwei normalen Zellen (Vero und WI38) wurden mithilfe der MTT-Assay-Methode bewertet. Bei dieser Methode wurde jeder Zelltyp in 96-Well-Gewebekulturplatten mit einer Intensität von 1 × 105 Zellen/100 µL/Well inokuliert und 24 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Sobald die Monoschichtschicht gebildet war, wurde sie zweimal mit Waschmedium gespült und 100 µL RPMI-Erhaltungsmedium mit 2 % Serum hinzugefügt. Anschließend wurden die wachsenden Zellen mit der doppelten Konzentration an Se-NPs (31,25–1000 μg mL–1) behandelt und 48 Stunden lang inkubiert. Als Kontrolle dienten drei Vertiefungen ohne Se-NPs. Nach der Inkubationszeit wurde das verbleibende Medium in jeder Vertiefung verworfen und mit 50 µL MTT-Lösung (5 mg mL–1 Phosphatpuffer-Kochsalzlösung) versetzt und 5 Minuten lang gründlich geschüttelt, bevor es 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde. Nach der vollständigen Inkubationszeit wurde die MTT-Lösung verworfen und durch Zugabe von 100 µL DMSO (10 %) löste sich der gebildete Formazankristall durch 30-minütiges Schütteln auf. Die Absorption der gebildeten Farbe wurde bei 570 nm mit einem ELIZA-Lesegerät76 gemessen. Die morphologischen Veränderungen in den Zellen aufgrund der Behandlung mit Se-NPs wurden mithilfe der inversen Mikroskopie (Nikon, ECLIPSE Ts2, Shinjuku, Tokio, Japan) beobachtet, während die Prozentsätze der Zelllebensfähigkeit nach der folgenden Gleichung berechnet wurden:

wobei AbT und AbC die Extinktionen der Behandlung bzw. der Kontrolle sind.

Die Wirksamkeit von Se-NPs bei der Abtötung von Larven im Stadium von Aedes albopictus wurde untersucht. Die Larven der A. albopictus-Mücke wurden vom Medical Entomology Centre, Gizeh, Ägypten, bezogen. Die gesammelten Larven wurden in mit entionisiertem Wasser gefüllten Plastikbechern gehalten und unter Laborbedingungen konserviert. Zur Fütterung der Larven wurde eine Mischung aus Hefe und Hundefutter (1:1 w/w) verwendet. Das Experiment wurde bei 70 % relativer Luftfeuchtigkeit, 30 °C und Photoperiode 12:12 h (dunkel/hell) Bedingungen durchgeführt. Das Experiment wurde gemäß dem Standard der WHO-Richtlinien77 durchgeführt. Bei dieser Methode wurden 25 gesunde Larven aus jedem Stadium (I, II, III und IV) separat in einem Behälter inkubiert, der 200 ml Leitungswasser gemischt mit einer Se-NP-Konzentration (50, 40, 30, 20 und 10 µg) enthielt ml–1) für 48 Stunden. Als Kontrolle diente der Behälter mit Leitungswasser ohne Se-NPs. Die Larven galten als tot, wenn sie nach einer Störung des Behälters nicht mehr an die Leitungswasseroberfläche gelangen konnten. Die Sterblichkeitsprozentsätze wurden anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Dabei ist A die Sterblichkeit unter Kontrolle und B die Sterblichkeit unter Behandlung. Das Experiment wurde in fünf Wiederholungen für jede Se-NP-Konzentration durchgeführt.

Zur Analyse der gewonnenen Daten wurde das Statistikpaket SPSS v17 verwendet und anhand von drei unabhängigen Replikaten dargestellt. Zur Messung des Unterschieds zwischen den Behandlungen wurde der t-Test oder die ANOVA gefolgt vom Tukey-HSD-Test bei p < 0,05 verwendet. Die Larvensterblichkeitsprozentsätze wurden durch Probit-Analyse gemessen, wobei LC50 und LC90 nach der Finney-Methode berechnet wurden.

„Unsere Arbeit steht im Einklang mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen.“

Unter vier endophytischen Pilzstämmen, die Knoblauchwurzeln besiedelten, wurde P. verhagenii als bester Se-NP-Produzent ausgewählt. Der ausgewählte Stamm wurde durch traditionelle Methoden sowie durch Sequenzierung von ITS-Genen identifiziert. Die synthetisierten Se-NPs wurden durch UV-Vis-Spektroskopie, FT-IR, XRD, TEM, DLS und Zeta-Potenzialanalysen charakterisiert. Untersucht wurden antimikrobielle Aktivität, Antioxidationsmittel, In-vitro-Zytotoxizität gegen Krebs und normale Zelllinien sowie larvizide Aktivität. Die Daten zeigten unterschiedliche Hemmzonen aufgrund der Behandlung pathogener grampositiver Bakterien, gramnegativer und einzelliger Pilze mit unterschiedlichen Konzentrationen und MHK-Werten im Bereich von 12,5–100 µg mL–1. Die Aktivität zum Abfangen freier Radikale wurde mit der DPPH-Methode im Vergleich zu Ascorbinsäure untersucht. Se-NPs zeigen eine unterschiedliche DPPH-Fängeraktivität, basierend auf den Konzentrationen, die im Bereich von 31–87 % liegen. Darüber hinaus zielen Se-NPs auf Krebszellen, MCF7 und PC3, mit geringen Konzentrationen im Vergleich zu normalen Zellen, WI38 und Vero. Dieser Befund fördert ihre Integration in die Krebsbehandlung ohne vernachlässigbare Auswirkungen auf normale Zellen. Darüber hinaus können die so gebildeten Se-NPs als larvizides Mittel für ein biomedizinisches Insekt, A. albopictus, mit Sterblichkeitsraten von 51 % für Larven im IV-Stadium und 85 % für Larven im I-Stadium bei einer Konzentration von 50 µg mL verwendet werden –1. Die erhaltenen Daten bestätigten, dass die endophytischen Pilze ein hohes Potenzial zur Herstellung aktiver Se-NPs besitzen, die in verschiedene Sektoren integriert werden können.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die Sequenz in der aktuellen Studie wurde bei NCBI (GenBank) unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP471232 hinterlegt.

Selen-Nanopartikel

Brustkrebs beim Menschen

Prostatakrebszelle

Epithelzellen der Affenniere

Menschlicher Lungenfibroblast

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

Interner transkribierter Spacer

Dimethylsulfoxid

Weltgesundheitsorganisation

Minimale Hemmkonzentration

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Wir danken der Fakultät für Naturwissenschaften (Jungen) des Lehrkrankenhauses der Tanta-Universität der Al-Azhar-Universität und der Fakultät für Medizin der Tanta-Universität für ihre unerschütterliche Unterstützung während dieser Forschung.

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB). Die Open-Access-Finanzierung erfolgt durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Tanta Universal Teaching Hospital, Universität Tanta, Tanta, Ägypten

Abdel-Rahman A. Nassar

Abteilung für Botanik und Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Al-Azhar-Universität, Nasr City, Kairo, 11884, Ägypten

Ahmed M. Eid, Hossam M. Atta und Amr Fouda

Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie, Medizinische Fakultät, Universität Tanta, Tanta, Ägypten

Wageih S. El Naghy

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AME und AF; Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Software, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf und Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. A.-RAN; Methodik, Validierung, formale Analyse, Software, Datenkuration und Schreiben – Originalentwurf. HMA und WSEN; Konzeptualisierung, Validierung, Ressourcen und Überwachung. Alle Autoren genehmigen die endgültige Version des Manuskripts, die veröffentlicht werden soll.

Korrespondenz mit Amr Fouda.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nassar, AR.A., Eid, AM, Atta, HM et al. Erforschung der antimikrobiellen, antioxidativen, krebshemmenden, biokompatiblen und larviziden Wirkung von Selen-Nanopartikeln, die vom endophytischen Pilzstamm Penicillium verhagenii hergestellt werden. Sci Rep 13, 9054 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35360-9

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Eingegangen: 3. November 2022

Angenommen: 17. Mai 2023

Veröffentlicht: 03. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35360-9

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