Aus hiPSC aussortierte Zellen

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 483 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In letzter Zeit wurden zahlreiche mikrophysiologische Systeme zur Modellierung des proximalen Nierentubulus eingesetzt. Dennoch mangelt es an Forschung zur Verfeinerung der Funktionen der proximalen Tubulus-Epithelschicht – selektive Filtration und Reabsorption. In diesem Bericht werden pseudo-proximale Tubuluszellen, die aus vom Menschen induzierten pluripotenten, aus Stammzellen stammenden Nierenorganoiden extrahiert wurden, mit immortalisierten proximalen Tubuluszellen kombiniert und kultiviert. Es wird gezeigt, dass das kokultivierte Gewebe ein undurchlässiges Epithel ist, das verbesserte Werte bestimmter Transporter, der extrazellulären Matrixproteine ​​Kollagen und Laminin sowie einen überlegenen Glukosetransport und eine überlegene P-Glykoprotein-Aktivität bietet. Es wurden höhere mRNA-Expressionsniveaus festgestellt als bei jedem Zelltyp, was auf eine anomale synergistische Überschneidung zwischen beiden schließen lässt. Daneben werden die Verbesserungen der morphologischen Eigenschaften und der Leistung der immortalisierten proximalen Tubulusgewebeschicht, die nach der Reifung menschlichen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene ausgesetzt ist, gründlich quantifiziert und verglichen. Die Glukose- und Albumin-Reabsorption sowie die Xenobiotika-Effluxraten durch P-Glykoprotein wurden alle verbessert. Die nebeneinander präsentierten Daten unterstreichen die Vorteile der kokultivierten Epithelschicht und der nicht auf iPSC basierenden Doppelschicht. Die hier vorgestellten In-vitro-Modelle können bei personalisierten Nephrotoxizitätsstudien hilfreich sein.

Der proximale Tubulus am äußeren Streifen des Nierenmarks ist der Hauptort für die Rückresorption von Natrium, Wasser, Aminosäuren und anderen essentiellen Nährstoffen wie Glukose und Albumin, die andernfalls aus dem glomerulären Filtrat verschwendet worden wären1,2. Die Orgel ist daher von entscheidender Bedeutung und war Gegenstand verschiedener Modellierungsversuche3,4,5,6,7.

Auch wenn aktuelle Daten die Auswirkungen des endothelialen Gefäßsystems auf das proximale Tubulusepithel deutlich hervorheben6, mangelt es immer noch an Forschung zur Optimierung des Epithelgewebes selbst, da in früheren Modellen entweder Primärzellen oder immortalisierte Zelllinien verwendet wurden. Eine Möglichkeit wäre die Verwendung von Stammzellen wegen ihrer Reproduzierbarkeit und der Fähigkeit, weitaus bessere In-vivo-ähnliche Eigenschaften zu bieten. Dennoch gibt es keine Quellen für Stammzellen, die in der Lage sind, Nephrone im erwachsenen Organ zu produzieren, da alle Nephron-Vorläufer bei der Geburt aufgebraucht sind8,9,10, während die Gewinnung renaler Vorläuferzellen aus embryonalen Nieren ethisch unangemessen erscheinen könnte.

Alternativ können solche Vorläufer aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) nachgebildet und über schrittweise Protokolle direkt in eine Vielzahl von Nierenzelltypen differenziert werden11,12,13,14. Obwohl kürzlich proximale tubuläre Zellen direkt aus iPSC-Linien für On-Chip-Bewertungszwecke erzeugt wurden15, fehlt solchen spezialisierten Produkten im Allgemeinen die in vivo vorhandene 3D-Nische.

Zu diesem Zweck initiieren wir die Idee, Zellen aus hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden zu extrahieren. Von hiPSC abgeleitete Nierenorganoide rekapitulieren späte Entwicklungsstadien, haben eine komplexe 3D-Struktur und enthalten Zellen aus allen Nierenlinien, was sie zu geeigneten Quellen für Zellen mit eher in vivo-ähnlichen Eigenschaften macht. Darüber hinaus stehen sie nicht vor der ethischen Herausforderung, embryonale Nephron-Vorläufer zu gewinnen und zu differenzieren.

In mehreren Studien wurde die Idee vertreten, Nierenorganoide durch Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen (hPSCs) zu erzeugen13,14,16,17,18. Allerdings erzeugen die meisten dieser Protokolle aus den vier Vorläuferpopulationen, die an der menschlichen Nierenentwicklung beteiligt sind, nämlich Nephrone, Ureterepithel-, Endothel- und renale interstitielle Vorläufer, die ersten beiden und bilden nur Nephrone oder Sammelrohre. Der von Takasato et al. eingeführte Differenzierungsprozess von hPSCs in Nierenorganoide. rekapituliert den gesamten Verlauf der menschlichen Nierenorganogenese19,20. Es hat im Vergleich zu früher beschriebenen Methoden den Vorteil, dass alle vier Vorläuferpopulationen, die an der Bildung von Nierenorganoiden beteiligt sind, gleichzeitig produziert werden. Darüber hinaus enthalten diese Organoide die wichtigsten Strukturen der menschlichen Niere. Im Zusammenhang mit der Beurteilung der Zellfunktion wird argumentiert, dass es problematisch wäre, die Organoide den interessierenden Verbindungen auszusetzen und die Zellaufnahme zu bewerten, da die korrekte apikale/basolaterale Polarität der Zellen im Aggregat nicht festgestellt werden kann15. Was aber, wenn diese Zellen so entnommen und auf einer 2D-Plattform abgelegt werden, dass die richtige Polarität entsteht?

Während über Methoden zur direkten Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs)21, hPSCs und hiPSCs22 in proximale tubuläre Zellen berichtet und einige Anwendungen etabliert wurden, besteht allgemeiner Konsens darin, dass das Fehlen von in vivo-ähnlichen Bedingungen wie z ECM ist der Grund für ihre nicht optimale Leistung23.

Um dieses Problem anzugehen, haben einige Studien die Idee vorgeschlagen, diese Zellen mit anderen Zelltypen wie Primärzellen zu mischen. Beispielsweise haben kürzlich Beauchamp et al. zeigten, dass die Kokultivierung von Herzfibroblasten mit hiPSC-Kardiomyozyten (hiPSC-CM) die spontane Schlagaktivität verlängert und die Kontraktionsfrequenz und -amplitude im Vergleich zu reinen iPSC-CMs verbessert24. Der daraus resultierende Verlust der α-SMA-Expression deutete auf ein eher herzgewebeähnliches Muster in der Kokultur hin. Natürlich gibt es andere weit verbreitete Ansätze wie die elektrische Stimulation, die möglicherweise nicht auf Nierenzellen anwendbar sind25.

Hier wurde das proximale Tubulusepithel auf einem mikrophysiologischen System, dem sogenannten proximalen Tubulus auf einem Chip (PToC), unter Verwendung von Zellen gebildet, die aus von hiPSC abgeleiteten Nierenorganoiden extrahiert wurden. Zellen, die durch immunomagnetische Zelltrennung (MACS) getrennt wurden, stammten aus dem proximalen Tubulus, was durch Immunfärbung gegen proximale Tubulus-spezifische Proteine ​​und deren Genexpression nachgewiesen wurde. Bei der Kultivierung sinken die Expressionsniveaus dieser Marker jedoch sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene erheblich, sodass die Frage offen bleibt, ob die aus Organoiden stammenden Zellen das Potenzial haben, ordnungsgemäß zu funktionieren. Darüber hinaus neigten sortierte Zellen dazu, ihre organoide Nische wiederzugewinnen und begannen, Aggregate zu bilden, was es unmöglich machte, die Filtrationsleistung des Gewebes auf der Mikrofluidik-Chip-Membran zu beurteilen. Wir haben festgestellt, dass eine solche Aggregation in einer Kokultur im Verhältnis 1:1 mit immortalisierten proximalen Tubuluszellen stark reduziert werden kann. Soweit wir wissen, wurde das Konzept der Kokultivierung zweier ähnlicher Zelltypen, von denen einer immortalisiert und der andere aus hiPSC-abgeleiteten Organoiden gewonnen wurde, noch nicht untersucht.

Bisher wurden viele sowohl 2D-Mikrofluidik- als auch 3D-Bioprint-Modelle für das Arzneimittelscreening und zur Nachahmung der Filtrationsfunktion des proximalen Tubulus entwickelt3,4,5,6,7. Das Argument lautete, dass 3D-Modelle überlegen seien, weil sie in eine extrazelluläre Matrix eingebettet seien und daher die In-vivo-Nische nachbilden könnten. Unseres Wissens wurde jedoch keine quantitative Analyse durchgeführt, um diesen Vorteil aufzuzeigen. In diesem Projekt beabsichtigen wir, die herkömmliche Sichtweise zu überdenken, indem wir eine 2D-Gewebedoppelschicht mit einem epithelialen/endothelialen Zwischenraum bilden, der schmaler ist als der der zuvor berichteten 3D-Bioprint-Modelle7. Letztendlich bewerten wir den Durchsatz der Albumin- und Glukose-Reabsorptions- und Zytopempsie-Prozesse zusammen mit der Funktionalität des Efflux-Transporters P-Glykoprotein (Pgp) und zeigen, dass selbst ein kurzer Kontakt mit HUVECs die Filtrationsraten erheblich verbessert.

Die 3D-Selbstorganisation und Nephrogenese beginnt am 7. Tag, nach der Ernte der Vorläuferzellmischung und der Pelletierung auf Transwellfiltern (Abb. 1a). Es wurde festgestellt, dass das Organoid am 22. Tag einen optimalen Prozentsatz und Zustand der proximalen Tubuluszellen aufweist. Die EpCAM+-Population (Nierentubuli) wurde als Obermenge der proximalen Tubuluszellen identifiziert, die mit einem Bürstensaummarker, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), markiert sind, und genauer gesagt durch den Albumintransporter Megalin (Abb. 1b). Den früheren Schätzungen zufolge enthält das Organoid etwa 20–30 % der Population proximaler Tubuluszellen19. Eine 3D-konfokale Rekonstruktion des Organoids wird vorgestellt (Zusatzfilme 1 und 2).

a Das vereinfachte Protokoll der hiPSC-Differenzierung in intermediäres Mesoderm und der Bildung von 3D-Nierenorganoiden, gefolgt von der Dissoziation, Sortierung und Aussaat der sortierten Zellen. Dissoziierte Organoide, LTL + und LTL–, beziehen sich auf dissoziierte Organoidzellen, positive Fraktion von MACS bzw. negative Fraktion von MACS. b Wählen Sie Hellfeld- und konfokale Fluoreszenzbilder (z-Intensität projiziert) von Nierenorganoiden am 22. Tag aus. Die Immunchemie gilt für EpCAM und proximale Tubulusmarker, LTL und Megalin. c Einfluss der LTL-Konzentration (Verdünnungsfaktoren 1/50 oder 1/100) auf die Spezifität von MACS, N = 4 Experimente und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Daten dar, *p < 0,05. d Relative Genexpressionsniveaus, erhalten aus Zellen, die 7 Tage lang in Kulturschalen und PToC kultiviert wurden: Organoide, dissoziierte organoide Zellen am Tag 22; LTL+/–, positiver/negativer Anteil der MACS-Produkte. Der weiße Bereich entspricht Proben, die aus dissoziierten (organoiden) und sortierten Zellen stammen, während der graue Bereich Proben aus 7 Tage lang kultivierten Zellen anzeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung mit N = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar. NS, nicht signifikant für p > 0,05; *p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; ****p ≤ 0,0001. e Entwicklung von auf der Membran kultivierten LTL+-Zellen zu Aggregaten, Maßstabsbalken, 200 μm. Der gelbe Rahmen zeigt die Grenze zwischen dem Zellaggregat und der Monoschicht. Maßstabsbalken, 200 μm. f Immunchemie an Tag 7 für EpCAM, LTL und Megalin, Marker der proximalen Tubuli, in sortierten Zellen, die aus Nierenorganoiden extrahiert und auf dem PToC ausgesät wurden. Für das LTL+-Gewebe wurden Fluoreszenzscans an ausgewählten Teilen in der Nähe von Aggregaten durchgeführt, wie in (e) dargestellt. Maßstabsbalken, 50 μm.

Am 22. Tag wurden die Organoide in eine Zellsuspension dissoziiert. Die Suspension wurde teilweise LTL ausgesetzt und MACS unterzogen, nachdem die optimale Antikörperkonzentration bestimmt worden war (Abb. 1c). (Einzelheiten finden Sie auch im Abschnitt „Methoden“ und in der Ergänzungstabelle 1.) Wir untersuchten FACS auch auf seinen höheren Grad an Spezifität und charakterisierten die Produkte sortiert und kultiviert (Ergänzungsabbildungen 1, 2 und Ergänzungsdaten 1). Letztendlich haben wir uns jedoch für MACS entschieden, da es in der Lage ist, Zellen mit phänotypischen Merkmalen zu produzieren, die den primären proximalen Tubuluszellen ausreichend ähneln (Ergänzungsfilme 3–6). Anschließend wurden die positiven und negativen Fraktionen der MACS-Produkte gesammelt und 7 Tage lang unter 2D-Bedingungen kultiviert oder sortiert zusammen mit dem Rest der Zellsuspension lysiert. Um festzustellen, ob das proximale Tubuluskompartiment des Nephrons in unseren Organoiden vorhanden war, und um die Wirkung der 2D-Kultur zu untersuchen, führten wir eine mRNA-Analyse anhand einer Reihe relevanter Gene durch.

Wir fanden heraus, dass das Expressionsniveau von CDH6 (K-Cadherin), einem spezifischen Marker der proximalen Tubulus-Vorläuferzellen16,26,27, während der Kultur zunahm, während der Anstieg bei der negativen Fraktion (LTL–) ausgeprägter war. Der Anstieg betrug nämlich das 2,2-fache bzw. 6,2-fache für die LTL+- bzw. LTL–-Populationen (Abb. 1d). Im Gegensatz dazu war die 2D-Umgebung für die übrigen untersuchten Marker nicht günstig, da die Expressionsniveaus sanken (ABCB1, CUBN, LRP2, SLC3A1 und möglicherweise SLC12A1) oder völlig abnahmen (SLC22A6 (OAT1)).

Das aus den in den Chips kultivierten LTL+-Zellen kultivierte Gewebe (ergänzende Abbildung 3a, b) begann sich zu aggregieren und winzige kugelförmige Agglomerate auf der Membran zu bilden (Abb. 1e). Dennoch bestätigte die Immunfärbung die Häufigkeit proximaler Tubulusproteine ​​in diesen Zellen. EpCAM, LTL und Megalin traten mit hohem Kontrast ausschließlich in LTL+-Zellaggregaten auf, die sich langsam bildeten und um D7 herum erkennbar wurden (Abb. 1f). In der LTL-Gewebeschicht wurden keine Aggregate beobachtet (ergänzende Abbildung 3c).

Nach der MACS wurden sowohl LTL+- als auch LTL–-Fraktionen gesammelt und bei 107 Zellen ml–1 kultiviert. Darüber hinaus wurde eine 50:50-Kokultur jeder Fraktion mit immortalisierten Epithelzellen des proximalen Nierentubulus (RPTEC/TERT1-Zellen, im Folgenden als RPTECs bezeichnet) untersucht (Abb. 2a). Wie in den Hellfeldbildern (Abb. 2b) gezeigt, erlangten LTL+-Zellen ihre organoide Nische zurück und begannen zu aggregieren. Sobald sie jedoch mit RPTEC-Zellen kokultiviert wurden, flachten sie ab, was es ermöglichte, die Barrierefunktion zu untersuchen. Es wurde deutlich, dass sich LTL+- und RPTEC-Zellen gut vermischten, eine konfluente Schicht bildeten und positiv auf EpCAM reagierten (Abb. 2c). Im Gegensatz dazu konnten die LTL–-Zellen in der Mischung zwar geclustert werden, konnten aber nicht zu einem zusammenhängenden Gewebe verschmelzen. Die LTL+/RPTEC-Epithelschicht wurde im Folgenden als Kokultur bezeichnet. Konfokale Laserscans, die von der apikalen zur basalen Seite gerichtet sind, zeigen die Expression von apikalen (LTL, ZO-1 und Pgp) und basolateralen (EpCAM) proximalen Tubulusmarkern (Ergänzungsfilme 7–9).

eine Zeitleiste (in Tagen), die den Kokultur-Assay demonstriert. hiPSCs werden 23 Tage vor der Kokultur wie zuvor beschrieben ausplattiert, gefolgt von RPTECs, die am Tag –5 subkultiviert werden. Nierenorganoide werden nach der Reifung geerntet, dissoziiert und zu gleichen Teilen mit RPTECs gemischt. Anschließend wird das Zellgemisch in den Chip eingebracht. b Hellfeldbilder, die die Entwicklung von LTL+ und kokultivierten Geweben im Laufe der Zeit zeigen. Die positiven Fraktionszellen beginnen ab ∼D4 zu aggregieren und bilden ab D7 trennbare Sphäroide (wie durch rote Pfeilspitzen angezeigt), was das Gerät für Filtrationsbewertungen unpraktisch macht. In der Kokultur mit RPTECs hingegen wird keine Ablösung beobachtet. Maßstabsbalken, 200 μm. c Z-Intensität projizierte Fluoreszenzbilder aus immungefärbten Proben auf D7. DAPI, F-Actin und EpCAM werden jeweils in Blau, Gelb und Grün dargestellt. Nach der Kokultivierung mit RPTECs im Verhältnis 50/50 vermischen sich LTL+-Zellen gut und bilden eine konfluente Gewebeschicht. Die Kokultivierung der LTL–-Fraktion mit RPTECs führt jedoch nicht zu einer konfluenten Gewebeschicht. Das Gewebe löst sich teilweise ab, wie durch weiße Pfeilspitzen angezeigt. EpCAM wird in diesem Gewebe und hauptsächlich in den RPTECs schwach exprimiert. Graue gestrichelte Linien zeigen den Verbleib der PToC-Membran. Maßstabsbalken, 200 μm. d Fluoreszenz-, Hellfeld- und Mischbilder des kokultivierten Gewebes auf D14. Die oberen Reihen zeigen, dass der Kanal in seiner Gesamtheit gleichermaßen von RPTECs und LTL+-Zellen abgedeckt ist. Die stark vergrößerten Bilder in der unteren Reihe verdeutlichen, dass die dissoziierten/sortierten Zellen in der Mischung nicht nur kleine Aggregate bilden, sondern auch nahezu gleichmäßig im gesamten Kokulturgewebe verteilt sind. Die Maßstabsbalken sind in der oberen und unteren Reihe jeweils 1 mm und 100 μm groß. Gestrichelte Linien sollen das Auge leiten.

Für Vorversuche wurden GFP-positive hiPSCs bei der Kultivierung des Organoids eingesetzt, um die Verfolgung der sortierten Zellen zu erleichtern. Es zeigte sich, dass im Kokulturgewebe beide Zelltypen über die gesamte Schicht hinweg ihre Konformität beibehalten. Von Organoiden abgeleitete Zellen sind erkennbar, die etwa 50 % des Epithels besiedeln (Abb. 2d). Am 14. Tag waren die Aggregate in die Kokultur integriert, obwohl einige Cluster noch übrig waren. Zu diesem Zeitpunkt galt das Gewebe als bereit zur Charakterisierung.

Offenbar wird der Bürstensaummarker in aus Nierenorganoiden stammenden LTL+-Zellen stärker exprimiert als in den RPTECs. Außerdem beobachteten wir, dass LTL+-Zellen im Kokulturgewebe ihre eigene ECM in der Nähe von RPTECs absondern, da sowohl Laminin als auch Kollagen IV dort dicht vorkommen, wo LTL-Antikörper stark exprimiert werden. Eine intensive Expression von Pgp in der Kokultur könnte auf eine verbesserte Fähigkeit zur Eliminierung exogener Substanzen hinweisen. (Abb. 3a).

a Immunhistochemie für LTL, Laminin-111 (α1β1γ1)-Heterotrimer, Kollagen IV und Pgp in einschichtigem RPTEC und kokultivierten Gewebeschichten am Tag 14, was die Verstärkung beider ECM-Proteine ​​in letzteren hervorhebt. Laminin- und kollagengebundene Cluster, die morphologisch Inselepithelclustern in vivo ähneln, erscheinen hauptsächlich um LTL+-Zellen herum, die von den Organoiden getrennt wurden, wie durch weiße und grüne Pfeilspitzen angezeigt. Gleiches gilt für das apikale Protein des proximalen Tubulus, Pgp. Maßstabsbalken, 30 μm. b Auftreten von Tight Junctions um LTL+-Zellcluster auf D7 und im gesamten Kokulturgewebe auf D14. In (a) und (b) werden Bildausschnitte von derselben Probe aufgenommen und die Maßstabsbalken betragen 30 μm. c Entwicklung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) mit der Kulturzeit für die reinen RPTEC- und Kokultur-Gewebeschichten. Im Kokultursystem steigt der Widerstand steiler an und erreicht das erste Plateau von zwei (hellgrüne Pfeilspitze), möglicherweise aufgrund kleinerer LTL+-Zellen in der Mischung. Das zweite Plateau (dunkelgrüne Pfeilspitze) entsteht fast gleichzeitig mit der Widerstandssättigung im reinen RPTEC-System und entspricht dem Beitrag der RPTECs in der Mischung (hellblaue Pfeilspitze). TEER wird auf den endgültigen Steady-State-Wert des reinen RPTEC-Gewebes normalisiert. N = 3 bzw. 2 unabhängige Experimente für reine RPTEC- und Kokultur-Fälle. d TEM-Aufnahmen, die die Entstehung und Etablierung von Tight Junctions (dunkelrote Pfeilspitzen) in den Kokultur-Monoschichten auf D7 und D14 verdeutlichen. Maßstabsbalken, 1 μm. V, Vakuole. e Die Immunzytochemie für Megalin und Laminin-111 zeigt eine Verbesserung der Expressionsintensität und Verteilung beider Proteine ​​in der Kokultur, die durch strömungsinduzierten Scherstress verursacht wird. Maßstabsbalken, 50 μm (f) TEM-Aufnahmen repräsentativer Zellen aus dem Kokultursystem vergleichen statische Kultur- und Perfusionskulturbedingungen. In letzterem wird die Bildung verschiedener Epithelgewebemorphologien wie flache Monoschichten (die fast die gesamte Fläche der Membran bedecken), Monoschichten mit Zellvorsprüngen und Zellstapel von vorne nach vorne (apikal-apikal) sichtbar. Alle TEM-Aufnahmen stammen von den auf D14 fixierten Zellen. Maßstabsbalken repräsentieren 2 μm und 6 μm für Mikroaufnahmen, die statische (oben) bzw. perfundierte (unten) Bedingungen darstellen. M, Mitochondrien; N, Kern; mem, PET-Membran. g Quantifizierung der Mikrovillilänge/-dichte und Zellhöhe im Kokultursystem auf D14. Wir definieren die Zottendichte als die Anzahl der Vorsprünge dividiert durch die Länge des Zellmembran-Querschnittsumfangs, gemessen anhand einzelner Schnappschüsse. Durch die Strömung induzierte Scherspannung manifestierte sich das Wachstum nicht nur längerer und dichterer Mikrovilli, sondern auch größerer Zellen, was auf eine Umwandlung der Plattenepithel- in die quaderförmige Morphologie hinweist. Alle Proben sind auf D14. Zu Quantifizierungszwecken wurden aus insgesamt N = 3 unabhängigen TEM-Experimenten pro Bedingung n = 6, 5 und 24 Zellen zufällig ausgewählt, um Zottenlängen, Zottendichten bzw. Zellhöhen zu messen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Daten dar.

Der synergistische Effekt der Kombination von LTL+-Zellen mit RPTECs wird auch durch das starke Auftreten des Tight-Junction-Proteins belegt. ZO-1 erscheint früh auf D7 in der Kokultur (Abb. 3b), was dem ersten Plateau entspricht, das im TEER-Profil von Abb. 3c beobachtet wird. In diesen Diagrammen stellen durchgezogene und gestrichelte Linien eine geglättete Schätzung der TEER-Trends für die RPTEC- bzw. Kokultur-Fälle dar. Das erste Plateau tritt zu einem früheren Zeitpunkt in der Kokultur auf (wie durch eine hellgrüne Pfeilspitze dargestellt), was auf eine kürzere Kontakthemmungsperiode hinweist. LTL+-Zellen sind im Durchschnitt kleiner und weisen eine steilere logarithmische Phase auf. Die Resistenzen konvergieren um den 14. Tag herum, wobei die Kokultur (dunkelgrüne Pfeilspitze) etwas widerstandsfähiger ist als das RPTEC-Gewebe (hellblaue Pfeilspitze). Tight Junctions sind auch in den TEM-Bildern sichtbar (Abb. 3d). Über unsere TEER-Messstrategie und unseren Aufbau wurde bereits früher berichtet28,29. Helle, abgelegte Bilder zeigen die Entwicklung der Gewebekulturschichten auf den TEER-Chips im Laufe der Zeit (ergänzende Abbildung 3d). Vor der Durchführung von Transportmessungen an D14 wurde eine klare Barrierefunktion der Epithelschicht überprüft (ergänzende Abbildung 3e).

Um mögliche Auswirkungen mechanischer Reize zu demonstrieren und zu quantifizieren, haben wir die apikale Seite des Gewebes einer strömungsinduzierten Scherbeanspruchung ausgesetzt. Der Medienfluss hat zwei Auswirkungen auf die Gewebekultur. Im Gegensatz zu einem stagnierenden Zustand trägt die Strömung nicht nur dazu bei, wichtige Bestandteile des Mediums, z. B. Wachstumsfaktoren und Hormone, wieder aufzufüllen, sondern übt auch Scherbelastung auf das darunter liegende Gewebe aus. Diese beiden Effekte wurden in der Literatur zu renalen mikrophysiologischen Systemen selten unterschieden. Auch hier ließen wir das Kulturmedium unter statischen Kulturbedingungen zirkulieren, jedoch mit einer minimalen Durchflussrate (1 μL min–1), um sicherzustellen, dass die Scherspannung vernachlässigbar ist und gleichzeitig die Versorgung mit Medienkomponenten aufrechterhalten wird. Auf diese Weise konnten wir die Wirkung mechanischer Reize auf die apikale Seite des Endothels deutlich erkennen und untersuchen. Es ist bekannt, dass proximale Tubuluszellen innerhalb eines bestimmten Bereichs auf Scherreize reagieren. Es wird gemessen, dass die kontinuierliche Scherspannung entlang des proximalen Tubulus in vivo zwischen 0,1 und mehr als 1 dyn cm–2 variiert30,31. Aufgrund der tubuloglomerulären Rückkopplung könnte der momentane Fluss in den Tubulus jedoch eher pulsierend als gleichmäßig sein32. Es wird erwartet, dass bei einer gegebenen Geschwindigkeit ein pulsierender Fluss stimulierender wäre.

Zuvor hatten Long et al. beobachteten, dass die Zelldifferenzierung, -proliferation und bis zu einem gewissen Grad die Endozytose bei niedrigeren Scherspannungsniveaus verstärkt wurden33. Im Zustand des perfundierten Mediums ließen wir das Medium mit einer Geschwindigkeit von 10 μL min–1 zirkulieren, was zu einer durchschnittlichen Scherspannung von 0,06 dyn cm–2 führte, was ungefähr den in vitro gemeldeten Mindestwerten entspricht. Daraus konnten wir schließen, dass die augenblicklich pulsierende Natur der peristaltischen Pumpe (ergänzende Abbildung 4a, b) möglicherweise eine Rolle bei den hier beobachteten Verbesserungen der Zellmorphologie und -funktion spielt. Die Immunfärbung ergab, dass selbst eine so geringe Menge an Scherspannung die Intensität und Verteilung von Megalin in den reifen Epithelien der Kokultur- und Nicht-iPSC-Doppelschichtsysteme erheblich beeinflusst.

Verschiedene morphologische und funktionelle Faktoren wurden verbessert. Megalin, ein Cotransporter von Albumin, wurde im Zytosol umverteilt und es ist offensichtlich, dass die Lamininsekretion verbessert wurde (Abb. 3e). Auch die Elektronenmikroskopie zeigte deutliche Veränderungen in der Morphologie der Zellen. Neben den charakteristischen Merkmalen reifer proximaler Tubuluszellen mit Bürstensaumstrukturen wurden in den kokultivierten Zellen vakuolen- und mitochondrienreiche Bereiche beobachtet. Zellen, die nur 3 Tage lang dem fließenden Medium ausgesetzt waren, erfuhren eine Verringerung der apikalen und basalen Oberfläche, was auf eine Veränderung des Phänotyps von Plattenepithelkarzinomen zu quaderförmigen Zellen hinweist (Abb. 3f)34,35. Einige dieser geometrischen Veränderungen konnten wir auch durch die Analyse einer großen Anzahl von TEM-Bildern quantifizieren. Wie in den Diagrammen in Abb. 3g dargestellt, wurden kokultivierte Zellen größer und entwickelten längere und dichtere Mikrovilli. Für solche Quantifizierungszwecke haben wir ausschließlich die Zellen in der Monoschicht gezählt und die kleinen Fraktionen des Gewebes, die geschichtete Zellen enthielten, außer Acht gelassen.

Im Vergleich zu beiden Zellquellen waren die mRNA-Expressionsniveaus bestimmter Schlüsselgene im kokultivierten Epithel erhöht (Abb. 4a). Es wurden jedoch Diskrepanzen zwischen diesen Werten und den Proteinexpressionswerten der entsprechenden Marker beobachtet, wie durch Immunfärbung festgestellt wurde. Obwohl ABCB1 beispielsweise in den RPTEC- und Kokultur-Gewebeproben in nahezu gleicher Menge exprimiert wurde, wurde Pgp in letzteren häufiger gefunden. Die Glukose- und Albumintransporter SGLT2 bzw. LRP2 wiesen beide erhöhte mRNA- und Proteinspiegel auf. LRP2 war überraschenderweise um mehr als das Hundertfache erhöht.

a Die Expressionsniveaus bestimmter Gene in der RPTEC/LTL+-Kokultur zeigen eine Verbesserung gegenüber denen jeder Komponente. Funktionelle, ABCB1 (MDR1), AQP1, LRP2, SLC22A2 (OCT2), SLC5A2 (SGLT2) und strukturelle, CDH6 (K-Cadherin) und EpCAM, relative Genexpressionsniveaus (im Vergleich zu denen des ACTB-Niveaus), werden von relativen begleitet Mengen (normiert auf die Werte des RPTEC-Gewebes). Mit Ausnahme von ABCB1 und EpCAM waren die Expressionsniveaus anderer Gene im kokultivierten Gewebe signifikant erhöht. Es gab keine nachteilige Auswirkung auf die mRNA-Expressionsniveaus; N = 2 bzw. 5 biologisch unabhängige Experimente für RPTEC/LTL+-Monokulturen bzw. den Kokultur-Fall; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Daten dar. Reabsorptionsraten von Glucose (b) und scheinbare Permeabilitäten (Papp) für Rh123 (c), gemessen an D14 sowohl für reine RPTEC- als auch für kokultivierte Gewebeschichten, die statischen und perfundierten Kulturbedingungen ausgesetzt sind. Der vektorielle Transport wird in allen Fällen nachgewiesen. Die Übertragungsraten wurden durch die Durchführung einer linearen Regression anhand von Zeitverlaufsdaten geschätzt. a → b, apikal nach basal; b → a, basal bis apikal; Messungen an mindestens N = 3 unabhängigen Chips; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar; NS, nicht signifikant für p > 0,05; *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; ****p ≤ 0,0001.

Wir gingen davon aus, dass ein solcher Anstieg der Transporterproteinspiegel zu einem verbesserten aktiven transepithelialen Transport führen könnte. Um unsere Hypothese zu testen, haben wir die Rückresorptionsrate von Glukose und die Ausscheidungsrate von Rhodamin 123 (Rh123) als Maß für die SGLT2- bzw. Pgp-Aktivität quantifiziert. Wir haben gezeigt, dass die Transportraten von Glukose von apikal nach basal (a → b) in der Kokultur um etwa das 1,75- bzw. 2,50-fache gegenüber denen der reinen RPTEC-Monoschicht unter statischen bzw. perfundierten Kulturbedingungen verbessert wurden (Abb. 4b). Unter allen vier untersuchten Bedingungen waren die a → b-Übertragungsraten des Substrats zwar deutlich höher als die der umgekehrten (b → a) Richtung, es gab jedoch keine signifikanten Änderungen bei den umgekehrten Übertragungsraten. Beide Beobachtungen bestätigen die vektorielle Natur des Glukosetransports.

Die scheinbare Permeabilität (Papp) für das Pgp-Substrat Rh123 ist in Abb. 4c dargestellt. Da die Ausscheidungsraten (b → a) höher sind als die Absorptionsraten (a → b), erfolgt der Transport in allen vier untersuchten Fällen unidirektional. Darüber hinaus wurde das Effluxverhältnis des Substrats, definiert als das Verhältnis von Ausscheidungs- zu Absorptionsraten, im Kokultursystem unter statischen Kulturbedingungen um 90 % erhöht, was eine wesentliche Verbesserung der xenobiotischen Ablagerungskapazität bestätigt.

Um vollständig isolierte proximale tubuläre Epithel- und peritubuläre Endothelkanäle zu erzeugen, haben wir unser Protokoll angepasst, um sicherzustellen, dass vor der Einführung von HUVECs ein vollständig versiegeltes RPTEC-Gewebe gebildet wird (Abb. 5a). Dies verhinderte nicht nur eine Vermischung von EGM2 und REGM, die sonst zur Ablösung von HUVECs geführt hätte (ergänzende Abbildung 4c, d), sondern ermöglichte es uns auch, die Auswirkungen von Endothelzellen auf ein ausgereiftes proximales Tubulus-Epithelgewebe zu untersuchen. Vor der Aussaat haben wir die Membran auf beiden Seiten ausschließlich mit einem Zelladhäsionsmittel beschichtet und den Zellen ermöglicht, ihr eigenes ECM abzusondern. Obwohl kein externes ECM-Protein angewendet wurde, blieb die Doppelschicht mindestens 10 Tage lang sicher erhalten, danach begannen sich die HUVECs abzulösen (ergänzende Abbildung 4e und ergänzende Filme 10 und 11).

a Der Zeitplan für generische Zellaussaat- und -erhaltungsprozesse. HUVECs sind für die einschichtigen Geräte nicht enthalten. b Zeitlicher Verlauf der gemeldeten Resistenzen der reinen RPTEC-Gewebeschichten (blaue Kreise), der Doppelschichtgewebeschichten (rote Quadrate) und der reinen HUVEC-Gewebeschichten (grüne Dreiecke). Bei den Doppelschichtgeräten steigt der Gesamtwiderstand nach der Einführung von HUVECs an Tag 10 bei der Bildung einer konfluenten Endothelschicht an und beginnt dann abzunehmen, bis er an Tag 14/Tag einen stabilen Zustand erreicht. Gestrichelte Linien geben die durchschnittlichen Resistenzen an, die in den letzten 4 Kulturtagen (farbige Balken) für jeden Fall erhalten wurden. Alle gemessenen Werte sind auf den RPTEC TEER im stationären Zustand normiert, d. h. 60 Ω cm2 (blaue gestrichelte Linie). Grüne und rote Pfeile mit zwei Spitzen zeigen jeweils den gemeldeten Widerstand der Nur-HUVEC-Schicht bzw. den Widerstandsanstieg an, der bei Zugabe von HUVECs zum Nur-RPTEC-Gewebe gemessen wird. Auf D14/d4 bildet sich eine stabile Doppelschicht. RPTECs wurden auf N = 6 Geräten kultiviert, von denen N = 3 durch Zugabe von HUVECs auf D10 zu einer Doppelschicht wurden. N = 3 Geräte waren ausschließlich für das HUVEC-Gewebe vorgesehen. c Immunhistochemie für ZO-1, EpCAM und Megalin im RPTEC-Gewebe des Doppelschichtsystems zusammen mit Fluoreszenzbildern der entsprechenden RFP-markierten HUVECs, die die Entwicklung von Tight Junctions, den Grad der Reepithelisierung bzw. die Verteilung des Albumintransporters zeigen . Die Gewebeaktivität und -integrität ist zwischen D14/d4 und D17/d7 am höchsten. Maßstabsbalken, 50 μm. d Wirkung von HUVECs auf die Intensität der ZO-1-Expression; In Gegenwart von HUVECs traten Tight Junctions ab D14/d4 (grüne Pfeilspitze) auf und wurden auf D17/d7 deutlich sichtbar, während sie in Abwesenheit von HUVECs selbst bei einer erheblich höheren konfokalen Laserdurchlässigkeit schwach auftraten. In diesem Experiment wurde kein Triton X verwendet. Maßstabsbalken sind 100 μm. Alle Fluoreszenzbilder werden mit konfokaler Z-Intensität projiziert. Maßstabsbalken, 100 μm.

Ähnlich wie beim einschichtigen Kokultursystem haben wir den gesamten elektrischen Widerstand des RPTEC/HUVEC-Systems während des gesamten Kulturverlaufs in Intervallen untersucht. Zum Vergleich wurden Geräte mit einschichtigem RPTEC- und HUVEC-Gewebe verwendet und alle Werte wurden in Bezug auf den durchschnittlichen RPTEC-TEER skaliert, der während der letzten 4 Tage der Kultur gemessen wurde, d. h. 60 Ω cm2 (Abb. 5b). Der Gesamtwiderstand übersteigt während der Bildung einer konfluenten HUVEC-Monoschicht von D10/d0 bis D13/d3 und erreicht dann nach d4 ein Plateau. Allerdings unterscheidet sich die Amplitude des Widerstandssprungs bei der Bildung der Doppelschicht, wie durch den roten Pfeil in Abb. 5b angezeigt, nicht wesentlich vom Widerstand des reinen HUVEC-Gewebes (grüner Pfeil). Obwohl das Doppelschicht-Resistenzprofil während der Kultur stabil zu sein scheint, ist es daher unwahrscheinlich, dass die Einführung von HUVECs die transepitheliale Resistenz der RPTEC-Schicht wesentlich beeinflusst hat. Normalerweise weisen RPTEC-Monoschichtkulturen TEERs um 0,1 bis 1 kΩ cm2 auf 36,37, während das proximale Tubulusgewebe in vivo bekanntermaßen Werte aufweist, die um eine Größenordnung kleiner sind. Es wird oft argumentiert, dass die undichtere Barrierefunktion des Gewebes in vivo auf einen höheren transzellulären oder parazellulären Transport zurückzuführen ist38. Offenbar und möglicherweise aus dem gleichen Grund liegen die hier gemessenen Widerstandswerte von einigen zehn Ω cm2 zwischen denen der zuvor berichteten Werte für RPTEC-Monoschichten und das proximale Tubulusgewebe in vivo. Später stellen wir fest, dass HUVECs tatsächlich eine Rolle bei einer solchen Verbesserung spielen.

Es ist allgemein bekannt, dass ein parakrines Signalnetzwerk gebildet wird, sobald RPTECs mit Endothelzellen kokultiviert werden, was zu einer verbesserten RPTEC-Proliferationsrate und -Differenzierung führt39. In unserem Fall waren Hinweise auf eine Wechselwirkung und eine solche Signalübertragung zwischen HUVECs und RPTECs anhand von d4 der Doppelschichtbildung erkennbar. Wir beobachteten, dass in Gegenwart von HUVECs die Integrität des Epithelgewebes und möglicherweise auch die Funktion beide irgendwann zwischen dem 4. und 7. Tag der Doppelschichtbildung ihren Höhepunkt erreichen, was durch das unerschütterliche Auftreten von EpCAM/ZO-1 und die Expression von maximal dispergiertem (gleichmäßig verteiltem) Megalin belegt wird d7 (Abb. 5c). Da es sich bei Megalin um einen mobilen Albumintransporter handelt, lässt sich auf eine verbesserte zytosolische Abgabe von Albumin schließen, das bereits im Kulturmedium vorhanden ist.

Dies ist bemerkenswert, da wir im Gegensatz zu einigen früheren Berichten, in denen beide Zelltypen fast gleichzeitig zusammengebracht wurden, eine Verbesserung der Integrität und Funktion des proximalen Tubulusgewebes auch nach 10 Tagen Kultur beobachten. Wie durch Querschnitts-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet wurde, waren 3 μm breite Poren der PET-Membran die einzig möglichen Kanäle, über die diese beiden Zelltypen kommunizieren konnten (ergänzende Abbildung 3b). Tatsächlich reichte eine Porosität von etwa 5 % aus, um einen ausreichenden Zell-Zell-Kontakt herzustellen. Darüber hinaus wurde das Expressionsniveau des RPTEC-Tight-Junction-Proteins im Doppelschichtsystem deutlich erhöht (Abb. 5d), ähnlich wie in einem früheren Bericht6, und damit auch die Häufigkeit seines Auftretens. Infolgedessen konzentrierten sich alle Charakterisierungen und Funktionsbewertungen unabhängig von der Zellquelle auf D14 der Epithelschichtkultur. Beachten Sie, dass ZO-1 im Kokulturgewebe auf D14 deutlich exprimiert wurde, wohingegen es im nur RPTEC-einschichtigen System unter denselben Kulturbedingungen schwach auftrat. Das RPTEC/HUVEC-Doppelschichtsystem wurde einer ähnlichen Prüfung unterzogen wie das Kokulturgewebe.

Wir haben die räumlich-zeitlichen Expressionsmuster bestimmter proximaler Tubulus-spezifischer Proteine ​​durch umfangreiche Immunfluoreszenzbeobachtungen geschätzt. Kurz gesagt, Fluoreszenzintensitäten, die die Expressionsniveaus mehrerer Antikörper darstellen, wurden durch die Analyse von Stapeln konfokaler Bilder quantifiziert, die über die zellbeladenen Membranen aufgenommen wurden. Das Verfahren wird anhand repräsentativer Querschnittsfluoreszenzbilder der RPTEC/HUVEC-Doppelschicht und der entsprechenden Intensitätsprofile veranschaulicht (Abb. 6a, b). Δd bezeichnet den Abstand zwischen den Positionen des Spitzenexpressionsniveaus jedes Antikörpers und des Spitzenexpressionsniveaus von DAPI als Maß für den Aufenthaltsort der Kerne. Durch Auftragen der Δd-Werte gegen die Kulturtage konnten wir die Beweglichkeit der Proteine ​​in der Epithelschicht verfolgen.

a Ausgewähltes konfokales Fluoreszenz-Querschnittsbild des RPTEC/HUVEC-Doppelschichtsystems, immungefärbt für Megalin, das die Definition des relativen Abstands des interessierenden Proteins (z. B. Megalin), gemessen vom Zentrum der Kerne, veranschaulicht. Maßstabsbalken sind 10 μm. b Repräsentative Z-Intensitätsprofile von Fluoreszenzsignalen, die durch Mittelung der Emissionsintensitäten verschiedener Marker über einen Laserscanbereich von 0,1 cm2 mit einem Δz (Abstand) von 200 nm erhalten wurden. Durchschnittlicher proximaler Tubulus-spezifischer Marker-zu-Kern-Abstand in RPTECs (Doppelschicht), erhalten unter statischen und perfundierten Kulturbedingungen für (c) Megalin, (d) LTL und (e) SGLT2; N = 2 unabhängige Chips wurden verwendet, um jeweils n = 3 Zufallsmessungen durchzuführen; Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Datenpaaren werden durch Sternchen *, **, ***, **** für p ≤ 0,05, 0,01, 0,001 bzw. 0,0001 angezeigt. Ausgewählte Querschnitts-TEM-Bilder verdeutlichen das Erscheinungsbild der apikalen Membran von RPTECs unter verschiedenen Kulturbedingungen auf D14/d4: (f) Einzelschicht unter statischen Bedingungen, (g) Doppelschicht unter statischen Bedingungen und (h) Einzelschicht unter Perfusionskulturbedingungen. Das Nahaufnahme-TEM von (i) zeigt eine enge Verbindung (gelbe Pfeilspitze), die sich zwischen zwei benachbarten RPTECs unter Perfusionskultur gebildet hat. j Ein HUVEC auf der gegenüberliegenden Seite der Membran. Maßstabsbalken sind 2 μm. Alle mikroskopischen Aufnahmen stammen von den auf D14/d4 fixierten Zellen. M, Mitochondrien; N, Kern; V, Vakuole; mem, PET-Membran, Pfeile zeigen auf Tight Junctions und die gestrichelten Linien zeigen Zell-Zell-Grenzen. k Quantifizierung der Mikrovillilänge/-dichte und der RPTEC-Höhe. Wir definieren die Zottendichte als die Anzahl der Vorsprünge dividiert durch die Länge des Zellmembran-Querschnittsumfangs, gemessen anhand einzelner Schnappschüsse. RPTECs/HUVECs sind auf D14/d4. Offensichtlich entwickelten RPTECs in der Nähe von HUVECs dichtere apikale Mikrovilli, was zu einer größeren Oberfläche führte. Darüber hinaus ist die Mikrovilli-Dichteverteilung in der Doppelschichtkonfiguration enger. Unter statischen Kulturbedingungen wurde kein signifikanter Unterschied in der Zottenlänge zwischen den Einzelschicht- und Doppelschichtfällen beobachtet. Durch die Strömung verursachte Scherspannung zeigte sich nicht nur länger, sondern auch in einer größeren Dichte der Mikrovilli. Zu Quantifizierungszwecken wurden aus insgesamt N = 3 unabhängigen TEM-Beobachtungen pro Bedingung n = 9, 5 und 5 RPTEC-Mikroaufnahmen zufällig aus einschichtigen (statischen), zweischichtigen (statischen) und einschichtigen (Durchfluss) Kulturbedingungen ausgewählt , um Zottenlängen und -dichten zu messen. Um die Zellhöhe zu messen, wurden n = 8 und n = 9 Mikroaufnahmen auf statische bzw. Strömungsbedingungen untersucht. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Daten dar. l Durchschnittliche Abstände von Basal- und apikalen Proteinen vom Zellkern, dargestellt für reine RPTEC- und Kokultur-Gewebe, die unter Fließkulturbedingungen entwickelt wurden. Daten, die durch Z-Intensitätsprofilierung von Fluoreszenzbildern gewonnen wurden. Statistiken werden auf ähnliche Weise wie (c–e) abgeleitet.

Im Fall von Megalin gilt: Je weiter es von den Kernen entfernt ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass es an die apikale Membran gebunden wird, dh in einem inaktiven Zustand verbleibt. Wir haben festgestellt, dass Megalin, das zunächst an der apikalen Membran exprimiert wird, im Doppelschichtsystem, wenn HUVECs zuerst ausgesät werden, während der 7-tägigen RPTEC-Kultur internalisiert wird (ergänzende Abbildung 5a). Wenn RPTECs hingegen zuerst ausgesät werden, würden sie am Tag 14 vollständig in das intrazelluläre Milieu aufgenommen, was auf eine maximale Endozytoseaktivität hindeutet (Abb. 6c und ergänzende Abb. 5b)40. Die hier präsentierten Daten und die Fluoreszenzbilder in Abb. 3e machen deutlich, dass Perfusion nicht nur die Aktivität von Megalin erhöht, sondern auch seine Häufigkeit im Zytosol. Diese Verbesserung spiegelt sich in einer höheren Rückresorptionsrate von Albumin wider. In Übereinstimmung mit früheren Berichten über die Zunahme der Zellhöhe/-kompaktheit unter Flüssigkeitsscherbelastung 31 haben wir durch Proteinprofilierung hier festgestellt, dass die apikalen Marker LTL und SGLT2 weiter vom Zellkern entfernt erscheinen (Abb. 6d, e).

Die Querschnittselektronenmikroskopie der Zellen auf der obersten Schicht am 14. Tag zeigte die deutlichen Auswirkungen von Scherspannung und Nähe zu HUVECs auch auf die Nicht-iPSC-Epithelien (Abb. 6f – j). Selbstsekretierte ECM-Komponenten diffundieren durch die Membranporen und stellen einen Kommunikationsweg mit HUVECs bereit. Auch wenn die Zellen im Vergleich zu dreidimensionalen röhrenförmigen Strukturen5,7 schuppenartig waren, waren Tight Junctions deutlich erkennbar. Die Beobachtung von Tight Junctions bestätigt die Undurchlässigkeit sowohl von RPTEC-only- als auch von RPTEC/LTL+-Kokultur-Epithelien und ist für die Validierung unserer transzellulären Transportbewertungen von entscheidender Bedeutung. Tight Junctions im reinen RPTEC-Gewebe begannen sich zu einem späteren Zeitpunkt zu bilden als diejenigen im Kokultur-Monoschichtsystem. Es scheint auch, dass sie unter Perfusionskultur enger werden, obwohl dies statistisch nicht bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 6).

Unabhängig von der Quelle der Epithelzellen nahmen die Dichte und Länge der Zotten sowie die Zellhöhe unter dem Einfluss der Scherbeanspruchung zu, was dem Zustand in vivo ähnelte. Interessanterweise traten auf RPTECs, die mit HUVECs in Kontakt kamen, auch ohne mechanische Reize dichtere Zotten auf (Abb. 6k). Eine größere und dichtere Zottenpopulation führt zu einer effizienteren Endozytose und Transzytose.

Auf D14 haben wir die durchschnittlichen relativen Abstände von Basal- (Laminin und Kollagen IV), subapikalen (ZO-1) und apikalen (Pgp) Proteinen vom Zellkern in den einschichtigen RPTEC-only- und Kokultursystemen gemessen (Abb. 6l). Da sowohl die ECM als auch die apikalen Proteine ​​im kokultivierten Gewebe weiter von den Kernen entfernt exprimiert werden, lässt sich davon ausgehen, dass die proximalen Tubuluszellen des kokultivierten Gewebes im Durchschnitt höher wuchsen. Zweifellos weist RPTEC-Gewebe eine gleichmäßigere Dicke über die Membran auf und der kollektive Grad der Zellorientierung und -polarisierung ist höher (kleinere Fehlerbalken für Pgp und ZO-1). Beachten Sie auch, dass ZO-1 im Nur-RPTEC-Gewebe deutlich unterhalb des apikalen Pgp exprimiert wird. Die Quantifizierung der Zellhöhen auf der Grundlage von TEM-Beobachtungen einzelner Zellen führte nicht ganz zu den gleichen Ergebnissen wie in Abb. 6l; Der Trend war jedoch ähnlich. Wir glauben, dass die Diskrepanz auf den Prozess der Z-Intensitätsprofilierung zurückzuführen ist, bei dem die durchschnittlichen relativen Abstände zwischen apikalen und basalen Markern verkürzt werden, weil die PET-Membran nicht flach ist. Da apikale Proteine ​​nicht unbedingt direkt auf dem Höhepunkt der Zellen exprimiert werden, würde die Messung der Zellhöhe von der Membran bis zur Zellspitze zu größeren Werten führen. Allerdings war die Auswirkung der Scherbeanspruchung auf die Zellhöhe in der Kokultur ausgeprägter, d. h. 37 % Anstieg im reinen RPTEC-Gewebe gegenüber 99 % in der Kokultur (Zellhöhen in Abb. 3g und Abb. 6k).

Das Protokoll zur Bildung der RPTEC/HUVEC-Doppelschicht ist noch einmal in Abb. 7a dargestellt. Um festzustellen, ob das Vorhandensein von HUVECs die Marker der Struktur und Funktion der proximalen Tubuli beeinflussen würde, führten wir eine qPCR-Analyse durch. Abgesehen von den morphologischen Verbesserungen, die in der apikalen Membran der Mikrovilla beobachtet wurden, stellten wir fest, dass die mRNA-Spiegel bestimmter RPTEC-Gene unter strömungsinduzierter Scherbeanspruchung und in Gegenwart von HUVECs erhöht sind. Einerseits sind AQP1, EpCAM, MDR1, OCT2 und möglicherweise SGLT2 im reifen Doppelschichtsystem, das dem Perfusionsfluss ausgesetzt ist, hochreguliert, andererseits hat die Nähe zu HUVECs unter Medienperfusion zu den Expressionsniveaus von AQP1, EpCAM, MDR1 und geführt OCT2 nimmt zu (Abb. 7b).

a Das generische Protokoll zur Quantifizierung der renalen Reabsorption und Ausscheidung mithilfe des PToC. Die Messungen beginnen am 14. Tag, unabhängig vom verwendeten Test und der Konfiguration der Gewebeschicht. Die Medien sowohl in Epithel- als auch Gefäßmikrokanälen werden zirkuliert, um die Diffusion großmolekularer Substrate (z. B. BSA-AF488) zu verbessern. Die Übertragungsraten (Reabsorption von Albumin/Glukose oder scheinbare Permeabilität für Rh123) wurden durch die Durchführung einer linearen Regression anhand von Zeitverlaufsdaten geschätzt. b Relative Expressionsniveaus (im Vergleich zu ACTB) von Strukturgenen, CDH6 (K-Cadherin) und EpCAM sowie funktionellen Genen, nämlich ABCB1 (MDR1), AQP1, SLC22A2 (OCT2), SLC5A2 (SGLT2), im Vergleich zum Niveau von ACTB-Gen in den RPTEC-only- und RPTEC/HUVEC-Systemen. Es werden vier Gruppen vorgestellt, nämlich (i) RPTECs auf D14 in den Kulturschalen; (ii), RPTECs der Doppelschicht unter statischen Kulturbedingungen; (iii), RPTECs der Doppelschicht unter perfundierten Kulturbedingungen; (iv) Einschichtige RPTECs unter perfundierten Medien. Die Nähe zu HUVECs unter Medienperfusion hat die Expressionsniveaus von AQP1, EpCAM, MDR1, OCT2 und SGLT2 erhöht (vergleiche Gruppen iii und iv). Unabhängig davon hat die Perfusion die Expressionsniveaus derselben Gene (mit der möglichen Ausnahme von SGLT2) in der Co-Kultur erhöht (vergleiche Gruppen II und III). n = 5 PCR-Replikate wurden für jedes Gen/jede Probe analysiert, die aus einer Versuchsreihe erhalten wurden. c Übertragungsraten der Glukosesonde 2NBDG, gemessen unter statischen und perfundierten Kulturbedingungen. Sowohl die Reabsorptionsrate (a → b) als auch die Rückübertragungsrate (b → a) wurden quantifiziert. Auch die hemmende Wirkung von Phlorizin (P.) auf den Glukosetransport wurde untersucht; n = 3 unabhängige Chips. d Offensichtliche Permeabilitäten für Rh123 sowohl in der Ausscheidungsrichtung (b → a) als auch in der umgekehrten Richtung (a → b). Verapamil (V.), ein Kandidat für die Rh123-Extrusion, wurde angewendet, um den Rh123-Ausfluss abzuschwächen und die Funktion von Pgp zu bestätigen; N = 3 unabhängige Chips. e Fluoreszierende konfokale z-gestapelte Bilder der RPTEC-Gewebeschicht in Doppelschicht- und Einzelschichtkonfigurationen. Im basolateralen Milieu der RPTECs im Doppelschichtsystem wurde eine erheblich höhere Menge an BSA ausgefällt, was auf eine höhere Aufnahme des Substrats hinweist. Etwas BSA wird im einschichtigen RPTEC auf D17 (weiße Pfeilspitze) ausgefällt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. f Transportraten von AF488-konjugiertem Rinderserumalbumin (BSA-AF488) in beide Richtungen. In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkung einer Reduzierung der Inkubationstemperatur (auf 4 °C) auf den selektiven Transport von BSA-AF488; Minimum N = 6 unabhängige Chips. In (b–d, f) wurde wie angegeben ein Zwei-Stichproben-t-Test zwischen Paaren von Datensätzen durchgeführt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar; ND, nicht erkannt; N/A, nicht verfügbar; NS, nicht signifikant; *, **, ***, ****, für p ≤ 0,05, 0,01, 0,001 bzw. 0,0001. a → b, apikal nach basal; b → a, basal bis apikal.

Daher haben wir erwartet, dass das Epithel, das in die Nähe von HUVECs gebracht wird, nicht nur eine dichtere Struktur, sondern auch höhere Xenobiotika-Eliminations- und Glukoseaufnahmeraten aufweisen könnte. Diese Annahmen wurden durch eingehende Untersuchungen der Glukose-Reabsorptions- und Rh123-Ausscheidungsraten bestätigt, was darauf hindeutet, dass auch der Spiegel der Proteine, die SGLT2 und MDR1 entsprechen (SGLT2 und Pgp), erhöht war (Abb. 7c, d). Die a → b-Glukose-Reabsorptionsraten wurden in Gegenwart von HUVECs und unter Perfusionsfluss unabhängig voneinander signifikant verbessert, wohingegen die b → a-Raten nahezu unverändert blieben. Darüber hinaus blockierte Phlorizin als klassischer kompetitiver Inhibitor von SGLT1 und SGLT241,42,43 wirksam die Rückresorption von Glukose.

Obwohl LRP2 nicht stabil nachgewiesen wurde, wurde das Vorhandensein und die ordnungsgemäße Funktion von Megalin in RPTECs durch die Analyse der Albumin-Reabsorptionsraten bestätigt. Wir haben gezeigt, dass die Albuminaufnahmekapazität von RPTECs in Gegenwart von HUVECs erheblich zunimmt. Dies wird durch die Akkumulation von BSA auf der basolateralen Seite von RPTECs im Doppelschichtsystem belegt (Abb. 7e). Darüber hinaus zeigte die Doppelschicht eine höhere Rate an Albumin a → b-Transzytose (Abb. 7f). Eine Senkung der Temperatur während der Messungen scheint die Reabsorptionsraten erheblich verringert zu haben, wie bereits zuvor untersucht wurde44,45.

Diese Ergebnisse sind insbesondere deshalb interessant, weil die Reabsorptions- und Ausscheidungsraten erhöht sind, obwohl die Endothelschicht intuitiv den Transfer von Biomolekülen über die Kanäle behindern kann. Die parakrine Signalübertragung zwischen den beiden Zelltypen hat die Megalin-, SGLT2- und Pgp-Funktion in dem Maße verbessert, dass Glukose, Albumin und Rh123 alle mit erheblich höheren Raten durch das Doppelschichtgewebe übertragen werden. Darüber hinaus sind die apikalen Mikrovilli in den mit HUVECs kokultivierten RPTECs auch ohne mechanische Reize dichter geworden (Abb. 5k). Beachten Sie, dass es im RPTEC/HUVEC-Doppelschichtsystem keine spürbare Verbesserung des Gesamtausflussverhältnisses von Rh123 gab, wohingegen sowohl die Glucose- als auch die Albumin-Reabsorptionsraten erhöht waren. Zuletzt haben wir die Kapazität des basolateralen xenobiotischen Transporters OCT2 in den Einzelschicht- und Doppelschichtsystemen bewertet. OCT2 ist für die Aufnahme von Chemotherapeutika wie Oxaliplatin und Cisplatin verantwortlich, von denen bekannt ist, dass sie medikamenteninduzierte Nierenschäden verursachen46. Unter Verwendung von Cimetidin als OCT2-Inhibitor zeigten wir eine selektive Aufnahme von kationischem fluoreszierendem EtBr und eine vektorielle Aufnahme von 4-Di-1-ASP (ASP+), beides als OCT2-Substrate bekannt (ergänzende Abbildung 7). Im Gegensatz zu Albumin-, Glucose- und Rh123-Filtrationsassays, bei denen HUVECs nachweislich die Transportraten in der Doppelschicht verbesserten, absorbierte die RPTEC-Einzelschicht ASP+ effizienter, da das Substrat durch HUVECs blockiert wurde.

Wir berichten über die Entwicklung eines 2D-proximalen Tubulusgewebes durch die Kombination von Zellen, die aus hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden (LTL+) extrahiert wurden, mit differenzierten menschlichen RTPEC/TERT1-Zellen. Die künstliche Gewebeschicht zeigte im Vergleich zu ihrem nicht auf iPSC basierenden Gegenstück eine verbesserte Filtrations-/Reabsorptionskapazität. Darüber hinaus wurden die mRNA-Expressionsniveaus bestimmter proximaler Tubulus-spezifischer Gene in der Kokultur verstärkt, was auf einen höheren Reife- und Funktionsgrad hinweist. Unser konstruiertes Epithel, das aus perfekt verschmolzenen, aus Nierenorganoiden gewonnenen und immortalisierten Zellen besteht, konnte seine Konformität mindestens bis zum 14. Tag stabil beibehalten.

Wie im Protokoll dargelegt, kann während der intermediären Mesodermdifferenzierung das Verhältnis von metanephrischem Mesenchym zu Ureterepithel-Vorläufern durch Auswahl des Tages der CHIR-zu-FGF9-Umstellung angepasst werden19. Ein späterer Wechseltermin wird mehr von Ersterem produzieren, wodurch das Kappenmesenchym entsteht und mehr Nephrone entstehen. Da wir lediglich an der Ernte proximaler tubulärer Zellen interessiert sind, haben wir den späteren Zeitpunkt des Wechsels (Tag 5) gewählt. Der erhebliche Anstieg des Expressionsniveaus von K-Cadherin, der nach der 2D-Kultur beobachtet wurde und über den zuvor berichtet wurde, kann auf die höhere Proliferationsrate von CDH6-hohen und LTL-niedrigen Zellen zurückgeführt werden, von denen bekannt ist, dass sie als proximale Tubulus-Vorläufer dienen, im Vergleich zu mehr reife CDH6-niedrige, LTL-hohe differenzierte Population47.

Parallel dazu haben wir die Literatur zu 2D-Modellen des proximalen Tubulus erneut untersucht und die Auswirkungen von Endothelzellen und strömungsinduzierter Scherbeanspruchung auf die Eigenschaften und die Leistung reifer, kontaktgehemmter Epithelschichten des proximalen Tubulus, die auf PET-Membranen entwickelt wurden, untersucht und hervorgehoben. Es wurde festgestellt, dass HUVECs die Intensität und Häufigkeit des Auftretens von Tight Junctions, die mRNA-Spiegel von AQP1, EpCAM, OCT2, MDR1 und SGLT2 sowie die vektoriellen Transportraten der jeweiligen Substrate, Glucose und Rh123, deutlich verbessern. Die ergänzenden Tabellen 2 und 3 fassen die Verbesserungen der Glukoseaufnahmeraten und Rh123-Ausflussverhältnisse in den Doppelschicht- und Kokultursystemen im Vergleich zum reinen RPTEC-Fall zusammen. Im Gegensatz zu LTL+-Zellen wurde LRP2 in RPTECs nicht nachgewiesen (oder nur in winzigen Mengen gefunden), was die früheren Studien bestätigt15. Megalin, dessen Menge durch den Perfusionsfluss moduliert werden konnte, wurde jedoch reichlich exprimiert. Wir haben auch die Geschwindigkeiten des Albumintransports demonstriert und gemessen. Obwohl die hier erzielten Geschwindigkeiten weitaus geringer sind als in vivo, ist es offensichtlich, dass der größte Teil des Stofftransfers durch die Membran behindert wird.

Nach unserem besten Wissen wurden in keiner früheren Studie unabhängig voneinander proximale Tubuluszellen einbezogen, die aus hiPSC-basierten Nierenorganoiden stammen. Auch hat noch niemand versucht, ein 2D-Funktionsgewebe durch Kokultivierung von hiPSC-Nieren-Organoid-abgeleiteten Epithelzellen mit immortalisierten Zelllinien zu konstruieren. Andere haben proximale tubuläre Zellen durch gezielte Differenzierung von iPSCs erzeugt und charakterisiert, indem sie zunächst Zellen des intermediären Mesoderms (IM) erzeugten und dann die IM-Zellen in Nierenzellen trieben15. Ihr Differenzierungsprotokoll erzeugte Zellcluster, die frühen Stadien der Nierenentwicklung ähnelten und bis zu 7 Tage stabil waren. Es wurden typische Marker wie CDH6 und LRP2 nachgewiesen, die mRNA-Spiegel mit einem ähnlichen hier untersuchten Muster exprimieren, wohingegen keine Spuren von ABCB1 vorhanden waren. Im Gegenteil, wir haben das Gen in geringen Mengen in unseren LTL+-Zellen nachgewiesen. Während zwischen RPTEC und Kokultur-Geweben kein wesentlicher Unterschied im Expressionsniveau von ABCB1 beobachtet wurde, waren Proteinniveau und -aktivität in der Kokultur deutlich verbessert. Daher stimmen wir der Annahme zu und bestätigen sie, dass das Pgp-Protein/die Pgp-Aktivität nicht unbedingt seinen Genexpressionsniveaus folgt. Obwohl in dieser früheren Arbeit die Pgp-Funktion qualitativ durch die Akkumulation von Calcein-AM in Gegenwart eines kompetitiven Pgp-Inhibitors, Cyclosporin A (CsA), nachgewiesen wurde, wurden quantitative Transportdaten wie die Effluxraten nicht untersucht.

Wir glauben, dass unser Kokultursystem einige Vorteile gegenüber bestehenden Modellen des proximalen Tubulusepithels bietet. Es ermöglicht beispielsweise eine patientenspezifische Krankheitsmodellierung, ein Arzneimittelscreening und Pathogenesestudien durch die Einbeziehung relevanter, vom Patienten stammender iPSCs zur Bildung der Organoide. Diese Organoide können dann dem gleichen hier beschriebenen Verfahren unterzogen werden, um die erkrankten Zellen zu erhalten, die mit Zelllinien kokultiviert werden können, um schließlich ein homogenes Gewebe für Analyse- und Behandlungszwecke zu bilden. Darüber hinaus könnte das Konzept, aus iPSC-abgeleiteten Organoiden gewonnene Zellen mit immortalisierten Zellen zu mischen, um die Sekretion von ECM zu erleichtern oder zu beschleunigen und ein 2D-Funktionsgewebe zu bilden, allgegenwärtige Anwendungen im Tissue Engineering bieten.

Bei Experimenten zur Zellsortierung haben wir festgestellt, dass geringfügige Änderungen im Protokoll die Effizienz der Ernte insbesondere der positiven Fraktion optimieren können. Die Variabilität in der Anzahl lebender Zellen, die von mehreren Organoiden dissoziiert wurden, wirkte sich deutlich auf die MACS-Erfolgsrate aus, dies konnte jedoch durch eine Anpassung der Antikörperkonzentration behoben werden. Die Tatsache, dass das semi-iPSC-basierte Gewebe schneller eine Epithelbarriere bildet als der Konkurrent, wurde durch unsere robuste TEER-Messtechnik mit vier Sonden nachgewiesen. Unsere Wahl des Protokolls zur Erzeugung von Nierenorganoiden war kein Zufall. Als wir das Konzept der Extraktion iPSC-abgeleiteter Zellen aus Nierenorganoiden initiierten, erzeugte das von Takasato et al.19 vorgeschlagene Protokoll die komplexesten hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoide. Spätere Fortschritte auf diesem Gebiet zeigten Nierenorganoide mit möglicherweise komplexeren Nephronstrukturen14.

Obwohl die PET-Membran den Transport durch die Doppelschicht erheblich behindert, konnten wir die Transportraten unter verschiedenen Bedingungen quantifizieren und den vektoriellen Transport von Albumin, Glucose und Rh123 mit der Fähigkeit, jeden durch relevante klassische Inhibitoren zu modulieren, nachweisen. Ein ausreichender Epithel-Endothel-Crosstalk durch die Membran führte zu einer verbesserten Gewebeintegrität (Tight Junctions), dichteren apikalen Mikrovilli und Genexpressionsniveaus, insbesondere denen der Transporter MDR1, OCT2 und SGLT2.

Der Hauptunterschied zwischen unserer Methode und den vorherigen Protokollen6,7 ist unsere Strategie, eine bereits reife (kontakthemmte) epitheliale proximale Tubulusschicht zu bilden/untersuchen, bevor Endothelzellen in die Gleichung eingeführt werden. Darüber hinaus haben wir darauf verzichtet, eine zusätzliche (künstliche) ECM-Beschichtung auf die Membran aufzutragen, damit die Zellen ihre eigene ECM absondern können. Das Gewebekonstrukt sollte bewusst flach geformt sein, um die Charakterisierung der Kokultur und die quantitative Analyse relevanter Reabsorptions-/Filtrationsraten in einem Mikrofluidikchip zu erleichtern.

Die Chips bestehen aus zwei identischen PDMS-Platten und einer dazwischen liegenden porösen PET-Membran (ergänzende Abbildung 3a). PET-Membranen mit einer Porengröße und Porosität von 3,0 μm bzw. 5 % wurden von Falcon-durchlässigen Trägern (Corning 353091) abgeschnitten. Die Platten wurden auf ¼-Zoll-Si(100)-Wafern mit geprägten mikrofluidischen Kanalmustern nachgeformt, die mithilfe der standardmäßigen SU-8-Photolithographie erzeugt wurden. Kurz gesagt wurde eine 10:1-Mischung aus PDMS (Sylgard 184, Toray Dow Corning) und Härter gegossen auf den in Petrischalen positionierten Formen. Nach dem Aushärten und Lösen der Platten aus den Formen untersuchten wir zwei Methoden zur Montage und Bindung der Membran. Beim ersten Ansatz wurde eine sehr dünne Schicht ungehärtetes PDMS auf die untere Platte geschleudert, um als zu dienen Adhäsionsschicht, auf der die Membran positioniert wurde. Die obere Platte wurde dann auf die Membran gelegt und sorgfältig unter dem Mikroskop ausgerichtet, sodass sich die durch die Membran getrennten mikrofluidischen Kanäle vollständig überlappten. Der Chip wurde schließlich in einem Ofen bei 65 °C ausgehärtet für 1 Stunde. Auf diese Weise konnten die Platten vor dem Härtungsschritt einfach und präzise ausgerichtet werden; die Membran wurde jedoch bei hoher Härtungstemperatur verformt. Darüber hinaus diffundierte ein Teil des ungehärteten PDMS in die Kanäle und verringerte die verfügbare Fläche der Membran für die Zellkultur. Auf diese Weise hergestellte Geräte wurden für vorläufige Validierungsexperimente einschließlich Zellkultur und Immunfärbung verwendet. Bei der zweiten Methode wurde keine Haftschicht aufgetragen. Kurz gesagt wurden die Membran und die Bodenplatte mit der Mikrokanalseite nach oben 1 Minute lang unter O2-Plasma (Covance-1MP, Femto Science Inc.) behandelt, um die Oberflächen hydrophil zu machen. Anschließend wurde die Membran auf die Bodenplatte gelegt. Als nächstes wurde die obere Platte zusammen mit der membrantragenden unteren Platte 1 Minute lang O2-Plasma ausgesetzt. Die Platten wurden sofort zusammengebracht und unter dem Mikroskop verbunden. Auf diese Weise bestand eine einmalige Chance, die Mikrokanäle unter dem Mikroskop auszurichten, da oxidierte PDMS-Platten nach dem Kontakt stark miteinander verbunden würden. Da der gesamte Prozess jedoch bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, blieb die Membran vollkommen flach. Nach dem Verkleben wurden an beiden Enden der Mikrokanäle 2 mm breite Löcher durch die Platten gestanzt. Im Allgemeinen konnten wir keine größeren Abweichungen in den Messergebnissen feststellen, die auf eine leichte Membrankrümmung oder eine Verringerung ihrer scheinbaren Fläche zurückzuführen wären. Zur Quantifizierung der Transportraten wurden jedoch bei Raumtemperatur hergestellte Geräte verwendet.

hiPSCs wurden vor der Aussaat zur Differenzierung dreimal passagiert. Nach dem Auftauen wurden alle drei Passagen in Platten mit 6 Vertiefungen transportiert. Die Platten wurden zunächst mit iMatrix-511 (0,5 mg mL–1, Nippi, 892011/892012) mit 3 μg mL–1 beschichtet, zubereitet in 1 ml DPBS pro Vertiefung (1/6). Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, dann mit 0,75 ml (pro Vertiefung) StemFit (Ajinomoto, AK02N), das 10 μM ROCK-Inhibitor (Y27632, 10 mM, Wako, 253-00511) enthielt, gefüllt und erneut inkubiert. Kryoröhrchen mit 106 Zell-ml–1 unmarkierter hiPSCs (weibliche CRL1502-C32-Fibroblasten, abgeleitet von ATCC CRL-1502 fetalen Fibroblasten48) oder markierten hiPSCs (H2B-GFP-integriertes 1502.3), eingefroren in 200 µL Stem Cell Banker, wurden schnell in einem 37 °C Wasserbad. Die Zellen wurden vorsichtig mit 1-ml-Pipettenspitzen mit breiter Bohrung in 5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 5 ml StemFit überführt. Das Röhrchen wurde 5 Minuten lang bei 200 G zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstands wurden die Zellen in 100 μl StemFit resuspendiert und gezählt. Eine 1,5-ml-Zellsuspension wurde in StemFit für jede Vertiefung so vorbereitet, dass sie 104 Zellen enthielt, und in mit iMatrix beschichtete Wellplatten gegeben. Nach der Aussaat wurden die Platten 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, um eine homogene Bedeckung der gesamten Vertiefung aufrechtzuerhalten, und dann bei 37 °C inkubiert. Zwischen den Passagen und vor der Dissoziation wurden die Zellen zweimal mit DPBS (1 ml pro Vertiefung) gewaschen, in 0,3 ml TrypLE (Fisher, 12563-029) eingeweicht, 5 Minuten lang inkubiert, durch einmaliges Klopfen gerührt und erneut 3 Minuten lang inkubiert Mindest. Aus jeder Vertiefung wurden Zellen durch Zugabe von 1 ml StemFit in 5-ml-Röhrchen gesammelt und wie oben beschrieben mit 104 Zellen pro Vertiefung auf iMatrix-beschichteten Vertiefungsplatten erneut ausgesät. Nach dreimaliger Passage wurden die Zellen dissoziiert und am Tag –1 kultiviert. Die Differenzierung wurde am Tag 0 begonnen, wie in Lit. beschrieben. 19. Kurz gesagt, der hintere Primitivstreifen wurde durch die Aktivierung des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) und der kanonischen WNT-Signalisierung unter Verwendung des Glykogensynthasekinase (GSK-3)-Inhibitors, CHIR99021, in APEL induziert. CHIR wurde am 5. Tag auf FGF9 umgestellt, um intermediäres Mesoderm zu induzieren. Am siebten Tag wurde die 3D-Selbstorganisation durch die Kultivierung von Aggregaten auf Transwellfiltern eingeleitet. Die Wachstumsfaktoren wurden am 12. Tag abgesetzt.

Kryokonservierte immortalisierte RPTEC/TERT1-Zellen (ATCC® CRL-4031™), die mit 106 Zellen/Fläschchen und einer Passagenzahl von weniger als 9 gelagert wurden, wurden aufgetaut und in T25-Zellkulturflaschen subkultiviert, bis sie eine Konfluenz von etwa 90 % erreichten. Während der Subkulturperiode, die 5 Tage dauerte, wurde DMEM/F12 (Gibco 11320033), ergänzt mit hTERT immortalisiertem RPTEC-Wachstumskit (ATCC® ACS4007™), gemäß den Anweisungen des Herstellers als Kulturmedium verwendet. Die Zellen wurden trypsinisiert und mit 4 × 106 Zellen/ml in REGM™ (Lonza CC-3190) resuspendiert. Die Chip-Mikrokanäle und -Reservoirs wurden mit 70 % Ethanol sterilisiert, unter einer sauberen Bank getrocknet und 1 Stunde lang UV-Licht ausgesetzt. Vor der Aussaat wurde die Membran mit einem Zelladhäsionsmittel, FNC Coating Mix® (Athena 0407), beschichtet und 1 Minute lang bei 37 °C inkubiert, um die Geschwindigkeit der Zellanhaftung zu erhöhen. Nachdem der untere Kanal jedes Geräts mit 200 μl REGM gefüllt wurde, wurden 30 μl der Zellsuspension vorsichtig in den oberen Kanal injiziert. Die Geräte wurden 1 Stunde lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert, bis sich die RPTECs vollständig abgesetzt und an der Membran befestigt hatten. Anschließend wurden 170 μl REGM in den oberen Kanal gegeben. Die Geräte wurden im Inkubator aufbewahrt und überwacht, während die Medien in beiden Kanälen täglich aktualisiert wurden.

Auf Chips, die die Doppelschicht tragen sollen, wurden RFP-HUVECs am 10. Tag auf der gegenüberliegenden Seite der Membran kultiviert. Kurz gesagt, RFP-markierte HUVECs (Angio-Proteomie Co. cAP-0001RFP), gelagert mit 5 × 105 Zellen/Fläschchen mit Passagennummer weniger als 4 wurden in EGM2™ (Lonza CC-3162) auf ähnliche Weise wie RPTECs subkultiviert. Bei Konfluenz (ca. 90 %) wurden die Zellen mit 4 × 106 Zellen/ml in EGM2 resuspendiert. Nach dem Absaugen von REGM wurden 30 μl der HUVEC-Suspension vorsichtig in den unteren Kanal jedes Geräts injiziert. Die Geräte wurden sofort umgedreht und 2 Stunden lang inkubiert, bis sich die Endothelzellen richtig anhefteten. Anschließend wurden die Geräte umgedreht und 170 μl EGM2 in den unteren Kanal gegeben. Danach wurden REGM und EGM2 täglich ausgetauscht.

Wir haben ein maßgeschneidertes Perfusionskultursystem entwickelt, das bei 37 °C und 5 % CO2 betrieben werden kann und sechs Geräte gleichzeitig bedienen kann. Ab Tag 11/Tag 1 der RPTEC/HUVEC-Kultur wurden REGM und EGM2 aus sterilisierten Glasgefäßen mit jeweils 3 ml entweder mit 10 μL min–1 oder 1 μL min–1 durch die entsprechenden Mikrokanäle perfundiert, um die Kulturbedingungen nachzuahmen statische bzw. fließende Medien. Bei einer Flussrate von Q = 10 μL min–1 wurde die auf die apikale Membran der Epithelzellen ausgeübte Scherspannung, τ, auf 0,06 dyn cm–2 geschätzt

wobei η = 0,7 die ungefähre mittlere Viskosität bei 37 °C ist und h = 0,35 mm und W = 1,0 mm die Kanalhöhe bzw. -breite sind. Das gesamte Medium in den Gläsern wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht.

Zellen auf beiden Seiten der Membran wurden durch 10-minütiges Auftragen von 4 % Paraformaldehyd in DPBS (1X) (Gibco®) in beide Kanäle fixiert, 10 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert, sofern nicht anders angegeben, und dann eingeweicht Blockierungspuffer aus 10 % Eselserum für 1 Stunde, alles bei Raumtemperatur. Im Blockierungspuffer vorbereitete Mischungen primärer Antikörper wurden in beide Mikrokanäle aufgetragen und die Proben über Nacht bei 4 °C belassen. Am folgenden Tag wurden die Membranen dreimal jeweils 30 Minuten lang gründlich mit DPBS gespült und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in der in DPBS zubereiteten Mischung sekundärer Antikörper eingeweicht. Die Membranen wurden dann 10 Minuten lang mit DAPI behandelt, gefolgt von einem Antifade-Eindeckmittel (Fisher, S36937) und auf Objektträger montiert. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wurde mit einem Olympus FV3000-Mikroskop durchgeführt. Die Bilder wurden mit der Viewer-Software FV31S-SW (v2.5.1.228, Olympus) und Image J (v1.53f51, NIH, USA) analysiert. In der Ergänzungstabelle 4 sind die Konzentrationen der verwendeten Antikörper aufgeführt.

Zellbeladene Membranen in den Chips wurden zuerst mit DPBS gespült, über Nacht bei 4 °C mit einem Puffer bestehend aus 2 % Glutaraldehyd (EM-Qualität, Electron Microscopy Science) und 0,1 M NaPO4 in Wasser fixiert und anschließend in 2 % OsO4 nachfixiert (Crystal, Heraeus Chemicals, Südafrika) für 3 Stunden in einem Eisbad. Die Chips wurden für die Mikroskopie ausgelagert. Bei der Ankunft in der Einrichtung wurden die Proben in abgestuftem Ethanol (50, 70, 90, 100, 100 und 100 %, jeweils für 15 Minuten) dehydriert und in Epoxidharze eingebettet. Ultradünne 80-nm-Schnitte wurden mit der Ultramikrotomtechnik geschnitten. Ultradünne Schnitte, die 10 Minuten lang mit Uranylacetat und 5 Minuten lang mit Bleifärbelösung gefärbt wurden, wurden auf einem HITACHI H-7600 bei 100 kV analysiert.

Die Gesamt-mRNA wurde aus drei Einzelproben pro Bedingung mit dem RNA-Isolierungskit (NucleoSpin® RNA) extrahiert und gereinigt. Wir haben eine maximale Menge von 3 μg/60 μL mRNA für die reverse Transkription mit dem PrimeScript™ RT Master Mix Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Template-cDNA-Proben wurden in TaqMan® Universal PCR Master Mix und TaqMan® Gene Expression Assay Forward- und Reverse-Primern pro Gen von Interesse verdünnt (1:10) und auf 5 Wells einer 384-Multiwell-Reaktionsplatte verteilt. Quantitative RT-PCR wurde mit dem QuantStudio® 5 Real-Time PCR-Nachweissystem (ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Als endogenes Gen wurde β-Actin verwendet. Die Primerdaten sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt.

30 Nierenorganoide (KOs) wurden nach dem Protokoll von Takasato et al. hergestellt. (2016). Die Organoide wurden am D22 der Induktion geerntet und unter Verwendung der im Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec, Nr. 130-095-929) bereitgestellten Enzyme gemäß den Anweisungen des Herstellers dissoziiert. Die so hergestellten Dreifachenzyme H, R und A wurden in einem Trennpuffer in Konzentrationen von 4, 2 bzw. 0,5 % (v/v) gelöst. Der Trennpuffer bestand aus DPBS, EDTA (Fisher, 15575020) in einer Konzentration von 2 mM und FBS in einer Konzentration von 0,5 % (v/v). Dissoziierte Zellen wurden während des gesamten Trenn- und Sortiervorgangs bis zur Aussaatphase im gleichen Puffer suspendiert. Die Sortierung wurde mit einem BD FACSAria™ III-Zellsortierer durchgeführt und die sortierten Zellen wurden zur Aussaat oder mRNA-Isolierung in REGM resuspendiert, das 10 μM ROCK-Inhibitor (Fuji Film, CultureSure® Y-27632) enthielt. Weitere Einzelheiten finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1, 2.

Für jedes Experiment wurden 16 KOs vorbereitet. Die Organoide wurden zwischen dem 22. und 26. Tag der Induktion geerntet, auf ähnliche Weise wie bei FACS dissoziiert, im Trennpuffer suspendiert und vor dem Sortieren während des gesamten Prozesses auf Eis konserviert. Die Proben wurden kurz zentrifugiert, resuspendiert und in zwei gleiche Portionen aufgeteilt (8 KO pro Portion). Jede Portion wurde durch ein 10-µm-PluriStrainer®-Sieb (pluriSelect, #43-50010-03) geleitet, um alle verbleibenden Zellcluster zu entfernen. Die gesiebten Portionen wurden erneut gemischt, zentrifugiert, in Trennpuffer resuspendiert und gezählt. Biotinyliertes Lotus-Tetragonolobus-Lectin (LTL), ein robuster Marker für den Bürstenrand des proximalen Tubulus, wurde im Verhältnis 1:100 als primärer Antikörper auf die Suspension aufgetragen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4 °C wurde die Probe zentrifugiert und zweimal resuspendiert, um alle nicht gebundenen Antikörper vollständig zu entfernen. Zur indirekten magnetischen Markierung wurden monoklonale Anti-Biotin-MicroBeads (Miltenyi Biotec, Nr. 130-105-637) im Verhältnis 1:5 aufgetragen. Die Suspension wurde dann 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, zentrifugiert und in Trennpuffer (500 μl) resuspendiert. Die Suspension wurde vorsichtig auf eine MS-Säule (Miltenyi Biotec, #130-042-201) aufgetragen, die in einen der acht Schlitze eines OctoMACS-Separators (Miltenyi Biotec, #130-042-108) gesteckt war. Vor dem Auftragen der Suspension wurde ein 30-µm-Vortrennfilter (Miltenyi Biotec, Nr. 130-041-407) auf die Säule gelegt, um alle Klumpen zu entfernen, die sonst die Poren verstopfen würden, und die gesamte Säule wurde mit 500 µL DPBS benetzt. Nach dem Auftragen der Suspension wurde die Säule zweimal mit 500 µL Trennpuffer gespült, um die negative Fraktion (LTL–) vollständig zu entfernen (Gesamtvolumen 1,5 ml). Um die positive Fraktion (LTL+) zu sammeln, wurde die Säule aus dem Separator entfernt, auf ein Sammelröhrchen gestellt und sofort mit 1 ml Trennpuffer gespült. Die MACS-Erfolgsrate bezieht sich auf die Summe des endgültigen MACS-Produkts (LTL+- und LTL–-Zellen), dividiert durch die Gesamtzahl der gefilterten lebenden Zellen (< 10 μm), die LTL-Marker und Mikrokügelchen ausgesetzt und anschließend auf die Trennsäulen aufgetragen wurden. Offensichtlich gingen bei der Markierung mit Antikörpern 50 % der Zellen verloren. Im Verlauf von Optimierungsexperimenten hatten wir festgestellt, dass die Spezifität um 7 % steigen würde, wenn die Konzentration des LTL-Antikörpers in der Zellsuspension von 1:50 auf 1:100 verringert würde. Die Diagramme in Abb. 1c zeigen die relativen Populationen der MACS-Endprodukte als Funktion der LTL-Antikörperkonzentration. Ergänzende Tabelle 1 zeigt die Statistiken des MACS-Prozesses. Die Daten werden aus sieben aufeinanderfolgenden Experimenten gesammelt. Schließlich wurden beide Fraktionen in REGM, das 10 μM ROCK-Inhibitor enthielt, zur Aussaat oder mRNA-Isolierung resuspendiert.

Kleinvolumige Aliquots von AF488-Konjugat-BSA (ThermoFisher, A13100) wurden mit 5 mg mL–1 hergestellt und bis zur Verwendung bei –30 °C gelagert. Mit unserem selbstgebauten Perfusionssystem ließen wir unabhängig von der Gewebekonfiguration (einzelne Schicht oder zweischichtige) 3 ml REGM mit 50 μg ml–1 AF488-konjugiertem BSA (ThermoFisher, A13100) und makelloses EGM2 durch den oberen bzw. unteren Kanal zirkulieren . Die Medien wurden 24 Stunden lang perfundiert und zirkuliert. In Abständen von 6 Stunden wurden 10-μl-Proben aus dem EGM2-haltigen Reservoir entnommen, das den unteren Kanal bezog. Die Diffusionskonzentrationen in EGM2 wurden sofort mit einem Spektrophotometer (NanoDrop™ 3300) gemessen. Es wurde angenommen, dass das viermalige Entfernen von Volumina von 10 μL aus einer 3-ml-Quelle das Diffusionsgleichgewicht nicht stört. Wir haben festgestellt, dass die Medienzirkulation sowohl in den Konzentrat- als auch in den Diluatkanälen notwendig ist, um einen ausreichenden Albuminkonzentrationsgradienten aufrechtzuerhalten. Aufgrund seines hohen Molekulargewichts (66 kDa) konnte im statischen Fall nur eine winzige Menge BSA diffundieren (Ergänzungstabelle 6). Der umgekehrte Transfer von basal nach apikal wurde auf ähnliche Weise quantifiziert, aber stattdessen wurde AF488-konjugiertes BSA in EGM2 gelöst, das den unteren Kanal versorgte, und oben in makellosem REGM gemessen. Um die hemmende Wirkung einer Temperatursenkung auf die Albumin-Reabsorption zu beurteilen, wurde der Aufbau anstelle des Inkubators in einen dunklen Raum mit 4 °C gestellt.

Stammlösungen von 2-NBD-Glucose und einer fluoreszierenden Glucoseaufnahmesonde (2-NBDG, Abcam, ab1462002) wurden bei 30 mM hergestellt und zur späteren Verwendung bei –30 °C gelagert. Nach dem Abspülen des Mediums wurden 200 μl DPBS+ (Gibco, 14040133) auf den oberen und unteren Kanal aufgetragen und die Geräte anschließend 30 Minuten lang bei 37 °C eingeweicht. Die Messung der Glukose-Reabsorption begann mit dem Ersetzen von 100 μl DPBS+ im oberen Kanal durch das gleiche Volumen einer 1 mM 2-NBDG-Lösung, um eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erreichen. In 1-Stunden-Intervallen wurde das Diffusat im unteren Kanal vorsichtig, aber gründlich gemischt, indem ein Volumen von 100 μl zweimal manuell zirkuliert (pipettiert) wurde. Die gleiche Menge wurde entnommen und in dunklen Eppendorf-Röhrchen aufbewahrt. Erschöpfter Puffer wurde sofort durch Zugabe von 100 μl frischem DPBS+ wieder aufgefüllt. Die Probenkonzentrationen wurden zwischen den Probenahmeintervallen mit NanoDrop™ 3300 gemessen. Wir haben die zeitliche Konzentration der Glukose aus der Konzentration der in jedem Intervall entnommenen Proben berechnet, indem wir die eliminierte Menge anhand der folgenden Gleichung widerspiegeln:

Dabei stellen Ct und Ct–1 die tatsächlichen Konzentrationen von 2-NDBG im Kanal zum aktuellen bzw. vorherigen Probenahmezeitpunkt dar, und Rt und Rt–1 sind die entsprechenden Probenkonzentrationen, alle in nmol min–1. Die Volumina 200 μL und 100 μL beziehen sich auf das gesamte Kanal- bzw. Probenvolumen. Die Raten wurden durch die Durchführung einer linearen Regression der zeitlichen Konzentrationsdaten über 0 ≤ t ≤ 3 Stunden ermittelt. Die SGLT-Hemmung wurde durch die Verabreichung von Phloridzin bewertet. Aliquots von Phloridzin (P3449, Sigma) wurden in 70 % Ethanol bei 100 mM hergestellt und zur späteren Verwendung bei –30 °C gelagert. Das Arzneimittel wurde in einer Konzentration von 1000 μM (100-fache Verdünnung) angewendet. Die vektorielle Exozytose von Glucose wurde durch Quantifizierung der Massentransferraten in umgekehrter Richtung, dh von basal nach apikal, untersucht. In diesem Fall wurde 2-NBDG auf den unteren Kanal aufgetragen und oben gemessen.

Wir untersuchten die Leistung der Pgp-Effluxpumpe, indem wir die Übertragungsrate von Rh123 (Fisher, R302) gemessen, das bei 2,5 μM angewendet wurde. Um den Rh123-Ausfluss zu hemmen, haben wir Verapamil als Rh123-Anwärter in einer Konzentration von 300 μM hinzugefügt. Nach dem Entfernen und Abspülen des Kulturmediums wurden der obere und der untere Kanal mit 200 μl HBSS pH 6 bzw. HBSS pH 7,4 gefüllt. Die Geräte wurden 30 Minuten lang bei 37 °C vorinkubiert. Die Probenahme erfolgte auf ähnliche Weise wie bei der Messung der Glukose-Reabsorption. Da jedoch die Effluxrate (basal nach apikal) erwünscht war, wurde das Substrat hauptsächlich auf den unteren Kanal aufgetragen und oben gemessen. Kurz gesagt, um eine Quellenkonzentration von 2,5 μM aufrechtzuerhalten, wurden 100 μL des Puffers aus dem unteren Kanal durch eine 5 μM-Lösung von Rh123 ersetzt, hergestellt in HBSS, pH 7,4, mit oder ohne Verapamil. In Abständen wurden 100-μl-Proben aus dem oberen Kanal entnommen und in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit schwarzem Boden (Corning, CLS3925) überführt. Jede Vertiefung wurde mit HBSS vorgefüllt, um ein Arbeitsvolumen von 200 μl zu erreichen, wie vom Hersteller des Mikroplatten-Lesegeräts empfohlen. Der obere Kanal wurde unmittelbar nach der Probenahme mit 100 μl HBSS pH 6 aufgefüllt. Vor der Probenahme wurde eine einzelne Reihe der 96-Well-Platte mit Rh123-Lösungen bekannter Konzentration gefüllt, um Kalibrierungsdaten zu erhalten. Die Fluoreszenzemission der Proben wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, SpectraMax® iD5) gemessen. Um die Transferraten in umgekehrter Richtung zu quantifizieren, wurde Rh123 (mit oder ohne Verapamil) in HPSS pH 6 gelöst und über den oberen Kanal verabreicht.

Die Kalibrierungsdaten aller fluoreszierenden Substrate sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt.

Für die Ethidiumbromid (EtBr)-Aufnahmeexperimente bestanden die Kontrollproben nur aus HUVEC-Monoschichten, die auf der obersten Schicht kultiviert wurden. Ähnlich wie beim Rh123-Assay wurden alle Proben in sauren und neutralen HBSS-Puffer vorinkubiert. Als kationische Fluoreszenzsonden führten wir getrennt 2,5 μM EtBr in den unteren Kanal (Basalseite für RPTECs) oder 2,5 μM 4-Di-1-ASP (ASP+) in die apikale und basale Seite ein. Nach dem Einbringen der Sonden wurden die Geräte 4 Stunden lang inkubiert. RPTEC- und HUVEC-Monoschichten wurden dann mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop in 60-Minuten- bzw. 30-Minuten-Intervallen für EtBr- bzw. ASP+-Experimente abgebildet. Gleichzeitig verabreichten wir 1 mM Cimetidin als OCT2-Inhibitor, um die transporterabhängige Aufnahme von EtBr und ASP+ zu überprüfen. Die relativen Fluoreszenzintensitäten der Proben wurden aus einzelnen Schnappschüssen mit der Image J-Software berechnet und auf die des RPTEC ohne Inhibitor normalisiert.

Die Messungen wurden in Mikrofluidik-Chips mit einem maßgeschneiderten Vier-Sonden-Aufbau28 durchgeführt. Kurz gesagt, RPTECs oder RPTEC/LTL+-Zellmischungen wurden wie zuvor beschrieben auf der oberen Schicht der Membran kultiviert. Die Impedanz der zellbeladenen Membranen wurde mit einem LCR-Messgerät (ZM2731, NF Co.) mit sinusförmigem Reiz über einen Frequenzbereich von 100 Hz bis 10 kHz bei einer Spitze-zu-Spitze-Spannung von 20 mV gemessen. Die Grundimpedanz wurde vor dem Seeding aufgezeichnet, wobei beide Kanäle mit REGM gefüllt waren. TEER-Werte wurden durch Subtrahieren des Grundwiderstands von den gemessenen Widerständen ermittelt. Alle Messungen wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt. Die Vier-Sonden-Technik ermöglicht es uns, Serienwiderstände des Kulturmediums und die elektrische Doppelschicht auf der Oberfläche von Elektroden zu eliminieren. Wir haben einen Tiefpassfilter mit schneller Fourier-Transformation (FFT) angewendet, um die TEER-Kurven mit einer Grenzfrequenz von zu glätten

mit Punkten mit einem Fensterwert von n = 6 und einem Zeitintervall von Δt = 0,5 Tagen.

Im Allgemeinen wurden insgesamt N = 3 unabhängige Geräte (Chips) pro Bedingung verwendet, um Messdaten (Transportraten usw.) zu sammeln, sofern nicht anders angegeben. Um die Signifikanz zwischen zwei Datengruppen zu untersuchen, wurde ein T-Test mit zwei Stichproben durchgeführt, wobei das Signifikanzniveau auf 0,05 eingestellt war. Wir haben die statistische Signifikanzanalyse der qPCR-Daten aus Abb. 4a ausgeschlossen, da es nur N = 2 unabhängige Experimente für RPTEC- und LTL+-Fälle gab. Die in den Zusatzinformationen (d. h. den ergänzenden Abbildungen 1d, 2b) dargestellten qPCR-Daten stammen aus einem Experiment pro Bedingung mit n = 5 technischen Replikaten. Daher wurde keine statistische Analyse zwischen den Gruppen durchgeführt. Weitere Details werden in den Bildunterschriften erläutert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Numerische Quelldaten für Grafiken und Diagramme werden unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22339615.v2 gespeichert.

Zhuo, JL & Li, XC Proximales Nephron. Kompr. Physiol. 3, 1079–1123 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Curthoys, NP & Moe, OW Funktion der proximalen Tubuli und Reaktion auf Azidose. Klin. Marmelade. Soc. Nephrol. 9, 1627–1638 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jansen, J. et al. Menschliche proximale Tubulus-Epithelzellen, kultiviert auf Hohlfasern: lebende Membranen, die aktiv organische Kationen transportieren. Wissenschaft. Rep. 5, 16702 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Homan, KA et al. Bioprinting von 3D-gewundenen proximalen Nierentubuli auf perfundierbaren Chips. Wissenschaft. Rep. 6, 34845 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

King, SM et al. 3D-Proximaltubulusgewebe rekapitulieren wichtige Aspekte der Nierenphysiologie, um Nephrotoxizitätstests zu ermöglichen. Vorderseite. Physiol. 8, 123 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vedula, EM, Alonso, JL, Arnaout, MA & Charest, JL Ein mikrofluidischer proximaler Nierentubulus mit aktiver Reabsorptionsfunktion. PLoS ONE 12, e0184330 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, NYC et al. Renale Reabsorption in 3D-Modellen vaskularisierter proximaler Tubuli. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 116, 5399–5404 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lusis, M. et al. Isolierung klonogener, sich langfristig selbst erneuernder embryonaler Nierenstammzellen. Stammzellres. 5, 23–39 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McMahon, AP Entwicklung der Säugetierniere. Curr. Spitze. Entwickler Biol. 117, 31–64 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hendry, C., Rumballe, B., Moritz, K. & Little, MH Definition und Neudefinition der Nephron-Vorläuferpopulation. Pädiatr. Nephrol. 26, 1395–1406 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, DM, Church, GM & Ingber, DE Gezielte Differenzierung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen in reife Nierenpodozyten und Etablierung eines Glomerulus-Chips. Nat. Protokoll. 13, 1662–1685 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takasato, M. et al. Durch die Lenkung der Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen in Richtung einer Nierenlinie entsteht eine selbstorganisierende Niere. Nat. Zellbiol. 16, 118–126 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Taguchi, A. et al. Die Neudefinition des In-vivo-Ursprungs metanephrischer Nephron-Vorläufer ermöglicht die Erzeugung komplexer Nierenstrukturen aus pluripotenten Stammzellen. Cell Stem Cell 14, 53–67 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tsujimoto, H. et al. Ein modulares Differenzierungssystem kartiert mehrere menschliche Nierenlinien aus pluripotenten Stammzellen. Cell Rep. 31, 107476 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chandrasekaran, V. et al. Erzeugung und Charakterisierung von iPSC-abgeleiteten renalen proximalen tubulären Zellen mit erweiterter Stabilität. Wissenschaft. Rep. 11, 11575 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morizane, R. & Bonventre, JV Nierenorganoide: eine translatorische Reise. Trends Mol. Med. 23, 246–263 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Xia, Y. et al. Gezielte Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen zu Ureterknospen-Vorläuferzellen. Nat. Zellbiol. 15, 1507–1515 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Taguchi, A. & Nishinakamura, R. Nierenorganogenese höherer Ordnung aus pluripotenten Stammzellen. Cell Stem Cell 21, 730–746.e736 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takasato, M., Er, PX, Chiu, HS & Little, MH Erzeugung von Nierenorganoiden aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Nat. Protokoll. 11, 1681–1692 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takasato, M. et al. Nierenorganoide aus menschlichen iPS-Zellen enthalten mehrere Abstammungslinien und modellieren die menschliche Nephrogenese. Natur 526, 564–568 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Narayanan, K. et al. Menschliche embryonale Stammzellen differenzieren sich in funktionelle renale proximale tubuläre Zellen. Niere Int. 83, 593–603 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kandasamy, K. et al. Vorhersage von arzneimittelinduzierter Nephrotoxizität und Verletzungsmechanismen mit vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen und Methoden des maschinellen Lernens. Wissenschaft. Rep. 5, 12337 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, YK, Nam, SA & Yang, CW Anwendungen von Nierenorganoiden, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnen werden. Koreanischer J. Intern. Med. 33, 649–659 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beauchamp, P. et al. Die 3D-Co-Kultur von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mit Herzfibroblasten verbessert die gewebeähnlichen Merkmale von Herzsphäroiden. Vorderseite. Mol. Biowissenschaften. 7, 14 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ronaldson-Bouchard, K. et al. Fortgeschrittene Reifung von menschlichem Herzgewebe, das aus pluripotenten Stammzellen gezüchtet wurde. Natur 556, 239–243 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paul, R. et al. Cadherin-6, ein Zelladhäsionsmolekül, das spezifisch im proximalen Nierentubulus und im Nierenzellkarzinom exprimiert wird. Krebs Res. 57, 2741–2748 (1997).

CAS PubMed Google Scholar

Cho, EA et al. Differenzielle Expression und Funktion von Cadherin-6 während der Entwicklung des Nierenepithels. Entwicklung 125, 803–812 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takata, Y. et al. Bewertung des transepithelialen elektrischen Widerstands des proximalen Tubulusgewebes durch Einschluss und Entfernung extrazellulärer Calciumionen. Im Jahr 2021 IEEE 34. Internationale Konferenz über mikroelektromechanische Systeme (MEMS) 415–418 (IEEE, Gainesville, FL, USA, 2021).

Takata, Y. et al. Bewertung des transepithelialen elektrischen Widerstands durch Entfernung und Wiederauffüllung von extrazellulärem Ca2+. IEEJ Trans. Sens. Micromachines E (J. Sens. Micromachines) 142, 21–28 (2022).

Artikel Google Scholar

Duan, Y. et al. Scherinduzierte Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts der proximalen Tubuluszellen und der apikalen Verbindungskomplexe. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 11418–11423 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jang, KJ et al. Proximaler Tubulus auf einem Chip einer menschlichen Niere für den Medikamententransport und die Beurteilung der Nephrotoxizität. Integr. Biol.: Quant. Biowissenschaften. Nano Macro 5, 1119–1129 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Ferenbach, DA & Bonventre, JV Nierentubuli: intertubuläre, vaskuläre und glomeruläre Wechselwirkung. Curr. Meinung. Nephrol. Hypertonie 25, 194–202 (2016).

Artikel Google Scholar

Long, KR et al. Die apikale Endozytose des proximalen Tubulus wird durch Flüssigkeitsscherspannung über einen mTOR-abhängigen Weg moduliert. Mol. Biol. Zelle 28, 2508–2517 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tanner, GA & Evan, AP Glomeruläre und proximale tubuläre Morphologie nach Einzelnephron-Obstruktion. Niere Int. 36, 1050–1060 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kondo, T. & Hayashi, S. Mechanismen von Zellhöhenänderungen, die die epitheliale Invagination vermitteln. Entwickler (Camb., Engl.) 57, 313–323 (2015).

Google Scholar

Prozialeck, WC, Edwards, JR, Lamar, PC & Smith, CS Epithelbarriereeigenschaften und Expression von Zelladhäsionsmolekülen in von proximalen Tubuli abgeleiteten Zelllinien, die üblicherweise für In-vitro-Toxizitätsstudien verwendet werden. Toxicol. In Vitro 20, 942–953 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Secker, PF, Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U. & Dietrich, DR Funktionelle transepitheliale Transportmessungen zum Nachweis von Nephrotoxizität in vitro unter Verwendung der RPTEC/TERT1-Zelllinie. Bogen. Toxicol. 93, 1965–1978 (2019).

King, SM et al. 3D-Proximaltubulusgewebe rekapitulieren wichtige Aspekte der Nierenphysiologie, um Nephrotoxizitätstests zu ermöglichen. Vorderseite. Physiol. 8, 123 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tasnim, F. & Zink, D. Crosstalk zwischen primären menschlichen Nierentubuluszellen und Endothelzellen in Kokulturen. Bin. J. Physiol. – Ren. Physiol. 302, F1055–F1062 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Dickson, LE, Wagner, MC, Sandoval, RM & Molitoris, BA Der proximale Tubulus und die Albuminurie: wirklich! Marmelade. Soc. Nephrology 25, 443–453 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Abbas, G., Al Harrasi, A., Hussain, H., Hamaed, A. & Supuran, CT Die Behandlung von Diabetes mellitus – zwingende Rolle von Naturstoffen gegen Dipeptidylpeptidase-4, α-Glucosidase und natriumabhängige Glucose-Co -Transporter 2 (SGLT2). Bioorg. Chem. 86, 305–315 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blaschek, W. Naturstoffe als Leitverbindungen für Natriumglukose-Cotransporter (SGLT)-Inhibitoren. Planta Med. 83, 985–993 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hummel, CS et al. Strukturelle Selektivität menschlicher SGLT-Inhibitoren. Bin. J. Physiol. Zellphysiologie. 302, C373–C382 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ohlson, M., Sörensson, J. & Haraldsson, B. Glomeruläre Größe und Ladungsselektivität bei der Ratte, ermittelt durch FITC-Ficoll und Albumin. Bin. J. Physiol. Ren. Physiol. 279, F84–F91 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Wilmer, MJ et al. Neuartige bedingt immortalisierte humane proximale Tubuluszelllinie, die funktionelle Influx- und Efflux-Transporter exprimiert. Zellgeweberes. 339, 449–457 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Yonezawa, A., Masuda, S., Yokoo, S., Katsura, T. & Inui, K.-I. Cisplatin und Oxaliplatin, jedoch nicht Carboplatin und Nedaplatin, sind Substrate für menschliche organische Kationentransporter (SLC22A1–3 und Multidrug- und Toxin-Extrusionsfamilie). J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 319, 879–886 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Marable, SS, Chung, E. & Park, JS Hnf4a ist für die Entwicklung von Cdh6-exprimierenden Vorläufern in proximalen Tubuli in der Mäuseniere erforderlich. Marmelade. Soc. Nephrol. 31, 2543–2558 (2020).

Briggs, JA et al. Integrationsfreie induzierte pluripotente Stammzellen modellieren genetische und neuronale Entwicklungsmerkmale der Ätiologie des Down-Syndroms. Stammzellen 31, 467–478 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Die Autoren danken dem Hanaichi UltraStructure Research Institute für die Unterstützung bei der TEM-Mikroskopie. Wir möchten uns auch bei Mayumi Moriwake, Yoshikazu Kameda, Shiho Morimoto und Aki Kubo für ihre Unterstützung bei der Erhaltung von Nierenorganoiden, der reversen Transkription, qPCR und Mikrofabrikationsexperimenten bedanken. Besonderer Dank geht an Yoshiki Sahara für seine Hilfe bei der Entwicklung des MACS-Protokolls. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Center of Innovation Program (COI) von MEXT und JST (Fördernummer JPMJCE1307), das AMED-MPS-Projekt (Fördernummer JP22be1004204 und JP17be0304205) und den Kyoto University Nanotechnology Hub im „Nanotechnology Platform Program“ gefördert vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan, (Fördernummer JPMXP09F19KT0107).

Abteilung für Mikrotechnik, Universität Kyoto, Kyoto, 615-8540, Japan

Ramin Banan Sadeghian, Ryohei Ueno, Yuji Takata, Akihiko Kawakami, Cheng Ma und Ryuji Yokokawa

Zentrum für iPS-Zellforschung und -anwendung (CiRA), Universität Kyoto, Kyoto, 606-8507, Japan

Toshikazu Araoka

RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research (BDR), Kobe, 650-0047, Japan

Minoru Takasato

Graduate School of Medicine, Universität Osaka, Osaka, 565-0871, Japan

Minoru Takasato

Graduate School of Biostudies, Universität Kyoto, Kyoto, 606-8501, Japan

Minoru Takasato

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RBS und RY konzipierten und überwachten das Projekt, interpretierten die Daten und verfassten das Manuskript. RBS erstellte die Protokolle für Zellkultur/-erhaltung, Immunfärbung, konfokale Mikroskopie, Bildanalyse, Z-Intensitätsprofilierung, TEER-Messung, qPCR, Glukose- und Albumintransporttests, Chip-Mikrofabrikation, führte die Experimente durch und analysierte die Daten. RU entwarf die Pgp- und OCT2-Transporttests, führte Zellkulturen durch und führte die entsprechenden Messungen am RPTEC/HUVEC-Doppelschichtsystem durch. YT und RU haben TEER-Experimente entworfen und durchgeführt. KA führte den Pgp-Transporter-Assay auf dem RPTEC/LTL+-Kokultursystem durch. CM entwarf das Finite-Elemente-Modell für den Chip, der zur Modellierung der strömungsinduzierten Scherspannung verwendet wurde, und führte die Simulation durch. MT stellte die Protokolle für die Kultivierung und Aufrechterhaltung von aus hiPSC stammenden KOs und MACS bereit und unterstützte bei der Dateninterpretation. TA stellte das Protokoll für FACS bereit und unterstützte bei relevanten Sortierexperimenten und Datenanalysen. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen, bearbeitet und kommentiert.

Korrespondenz mit Ryuji Yokokawa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Roberto Gramignoli und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Simona Chera, Eve Rogers und George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Banan Sadeghian, R., Ueno, R., Takata, Y. et al. Aus hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden sortierte Zellen gekoppelt mit immortalisierten Zellen modellieren zuverlässig den proximalen Tubulus. Commun Biol 6, 483 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

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Eingegangen: 19. September 2022

Angenommen: 21. April 2023

Veröffentlicht: 04. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

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