Entwicklung eines bispezifischen Antikörpers gegen PD

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18011 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der programmierte Todesligand 1 (PD-L1) und der T-Zell-Immunrezeptor mit Ig- und ITIM-Domänen (TIGIT) sind zwei potenzielle Ziele für die Krebsimmuntherapie. Frühe klinische Studien zeigten, dass die Kombinationstherapie von Anti-PD-L1 und Anti-TIGIT eine synergistische Wirksamkeit hatte sowohl im Hinblick auf die Gesamtansprechrate (ORR) als auch auf das Gesamtüberleben (OS). Es ist sinnvoll, bispezifische Antikörper zu konstruieren, die auf PD-L1 und TIGIT abzielen. Neben der Beibehaltung der Wirksamkeit der Kombinationstherapie können bispezifische Antikörper (BsAbs) einen neuen Wirkmechanismus bereitstellen, beispielsweise eine Überbrückung zwischen Tumorzellen und T/NK-Zellen. Hier haben wir einen bispezifischen Antikörper vom IgG1-Typ mit optimaler Zytotoxizität entwickelt. In dieser Studie haben wir 16 IgG-VHH-Formate mit variablen Orientierungen und Linkerlängen gründlich untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der (G4S)2-Linker nicht nur zwei Bindungsdomänen ordnungsgemäß trennte, sondern auch die höchste Proteinausbeute aufwies. Darüber hinaus bewahrte die VHH-HC-Orientierung die Bindungs- und Zytotoxizitätsaktivität der variablen Domäne der schweren Kette des Nur-Schwere-Kette-Antikörpers (VHH) und des Immunglobulin G (IgG) perfekt. Nach der Behandlung mit BiPT-23 wurde das Tumorwachstum in vivo deutlich unterdrückt, wobei mehr zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) und natürliche Killerzellen (NK) infiltrierten und regulatorische T-Zellen (Tregs) selektiv dezimiert wurden. BiPT-23 stellt eine neuartige Immuntherapie dar, die entwickelt wurde, um ein übermäßiges Fortschreiten von Krebs durch PD-1-Blockade zu verhindern und vorzugsweise PD-L1+-Tumorzellen und TIGIT+-Tregs abzutöten, aber CD11b+F4/80+-Immunzellen innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) zu erhalten.

In den letzten zwei Jahrzehnten boten bispezifische Antikörper enorme Möglichkeiten für die Behandlung von Gerinnungsstörungen1 und Krebs2,3,4. Von 1997 bis 2020 wurden 272 klinische Studien mit bispezifischen Antikörpern durchgeführt. BsAbs verfügten über Hunderte von Formaten5 und etwa sechs Wirkmechanismen6. Je nach Wirkmechanismus (MOA) sollten unterschiedliche Formate übernommen werden. Allerdings sind nicht alle Formate für die industrielle Fertigung geeignet. IgG-like und BiTE weisen nachweislich eine gute Entwickelbarkeit auf und sind patentgeschützt7. Seit der Entdeckung von VHH im Jahr 19938 erregte VHH große Aufmerksamkeit von akademischen Instituten und Biotech-Unternehmen. Die Zulassung von Caplacizumab durch die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2019 gab VHH9 Auftrieb. Aufgrund seiner geringen Größe (15 kDa) ist es praktisch, bispezifische Antikörper mit VHH zu konstruieren.

Von allen klinischen Studien handelte es sich bei 17,28 % um eine duale Checkpoint-Blockade10. Immun-Checkpoint-Inhibitoren hatten das Potenzial, die Krebsimmuntherapie neu zu definieren. Kürzlich wurde festgestellt, dass T-Zell-Immunglobulin und die ITIM-Domäne (TIGIT) zusammen mit PD-1 auf tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) exprimiert werden11, und die Kombination aus PD-L1/PD-1-Blockade mit Anti-TIGIT zeigte sich überlegen ORR und OS als PD-L1/PD-1-Einzelwirkstoff bei PD-L1-positiven (Tumor-Proportion-Score [TPS] ≥ 1 %) Krebspatienten12. In China befinden sich mehrere bispezifische Antikörper in der klinischen Entwicklung, die auf PD-L1 und TIGIT13,14 abzielen. Allerdings wurde keiner von ihnen für die Auslösung einer antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) und einer antikörperabhängigen zellulären Phagozytose (ADCP) optimiert.

In Tumoren wird PD-L1 sowohl auf Tumorzellen15 als auch auf Immunzellen16 exprimiert, und präklinische Daten zeigten, dass funktionelles Fc die Antitumoraktivität von PD-L1-Antikörpern über das ADCC gegen die PD-L1-positiven immunsuppressiven myeloischen Zellen17 und verstärken könnte Tumorzellen18. Bei mehreren zugelassenen oder in klinischen Studien befindlichen PD-L1-Antikörpern handelt es sich um monoklonale IgG1-Antikörper mit Effektorfunktion19. Kürzlich haben Forscher einen monoklonalen Anti-TIGIT-Antikörper (mAb), T4, entwickelt, der eine signifikante Verringerung der Häufigkeit intratumoraler regulatorischer T-Zellen verursachte und zusätzliche Antitumor-CD8+-T-Zell-Reaktionen aktivierte20. Die anschließende Fc-Entwicklung zur Verbesserung der FcγR-Eingriffsfähigkeit verbesserte die Antitumorwirksamkeit weiter20. Darüber hinaus könnte die Interaktion mit FcγR auf APCs die Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für Anti-TIGIT21 verbessern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Fc-FcγR-Interaktion bei PD-L1- und TIGIT-Blockaden nicht nur dazu beitrug, dass NK Tumorzellen und Tregs dezimierte, sondern auch die Kommunikation zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) verstärkte.

In dieser Studie untersuchten wir systematisch den Zusammenhang zwischen der Zytotoxizität von BsAb und den IgG-VHH-Formaten. Zunächst konstruierten wir 16 BsAbs basierend auf IgG und VHH und zeigten, dass die Verbindung von VHH mit der leichten Kette von IgG das Paar zwischen HC und LC schwächte. Als nächstes bestätigten wir, dass die Platzierung des VHH am N-Terminus der schweren Kette die Zytotoxizität des parentalen VHH aufrechterhielt, nicht jedoch am C-Terminus. Schließlich zeigte die In-vivo-Antitumoraktivität, dass der Spitzenkandidat das Wachstum von MC38-Dickdarmkarzinomen unterdrücken, die Häufigkeit intratumoraler Treg-Zellen reduzieren, NK- und T-Zellen erhöhen und CD11b+F4/80+-Immunzellen, einschließlich DCs und Makrophagen, aufrechterhalten konnte die TME.

YN035 (IgG, Anti-PD-L1) und hTIGI7.6, hTIGI7.11E (VHH, Anti-TIGIT) wurden zuvor von Oricell Therapeutics entwickelt. hTIGI7.6 und hTIGI7.11E aus derselben Vorläufersequenz von hTIGI7 wiesen nur wenige Aminosäureunterschiede in CDR3 auf. Basierend auf YN035 und hTIGI7.6 haben wir 16 bispezifische Antikörper (angehängte IgGs) mit unterschiedlichen Formaten und Linkerlängen entworfen (Abb. 1). Die Bivalenz könnte nicht nur die Konjugatbildung verbessern, was dazu beitragen könnte, dass TIGIT-exprimierende T/NK-Zellen in die Nähe von PD-L1-Tumorzellen gelangen22, sondern auch die Blockierungsaktivität der Elternantikörper aufrechterhalten. Die beste Option des flexiblen und löslichen Linkers war (G4S)n, der zum Verbinden von Domänen verwendet wurde, die ein gewisses Maß an Bewegung erforderten23. Der längste Linker war (G4S)3, dessen Länge rechnerisch etwa 5,7 nm23 betrug und damit kürzer als der Abstand der Immunsynapse (13 nm)24. Durch die einfache Anpassung der n-Anzahl ermöglichte der Linker die ordnungsgemäße Faltung der BsAbs und erzielte so die höchste Ausbeute und optimale biologische Aktivitäten. In unserem Design wurde n ≥ 4 vermieden, einerseits war (G4S)3 lang genug, um zwei Bindungsdomänen zu trennen25; Andererseits ist GSG das Motiv für die O-Xylosylierung und die Gesamtmenge der Xylosylierung nimmt zu, wenn die Anzahl der GSG-Motive im Linker zunimmt26.

Das Design bispezifischer Antikörper. Grün ist das VHH gegen TIGIT, tiefes Blau ist die schwere Kette von Anti-PD-L1, Braun ist die leichte Kette und Schwarz ist der Linker: (GGGGS)n, n = 0–3.

Alle BsAbs wurden in EXPI293-Zellen (Thermo Fisher Scientific, A14527CN) exprimiert. Nach der Reinigung mit Protein A wurden die Aggregation und Dissoziation von BsAbs mithilfe der analytischen Größenausschlusschromatographie (SEC) bewertet (Abb. 2). In diesem Assay wurden theoretisch BsAbs mit 180 kDa berechnet, darunter ein 150 kDa IgG und zwei 15 kDa VHHs. Die Monomerelutionszeit der BsAbs betrug etwa 7,1–7,4 Minuten. Bei allen BsAbs wurde keine signifikante Aggregation beobachtet. Allerdings wiesen die IgG-[L]-VHH-Formate (Abb. 2I–P) bei der Elutionszeit von 8,1–8,4 Minuten einen kleinen Peak (7–17 %) auf, bei dem es sich möglicherweise um die schwere Kette von BsAbs handelte, nicht aber um eine leichte Kette Dies wurde im SEC-Assay beobachtet, da die Dissoziation bei den Expressions- oder Reinigungsschritten und nicht bei der Lagerung erfolgte. Die Ergebnisse der Daten zeigten, dass bispezifische IgG-[H]-VHH-Antikörper stabiler waren als IgG-[L]-VHHs, daher wurden AH-Formate (Abb. 2) für die weitere Analyse ausgewählt und die bispezifischen Antikörper BiPT-18 gegen BiPT- konstruiert. 25 basierend auf YN035 und hTIGI7.11E.

SEC von 16 bispezifischen Antikörpern bei einer Konzentration von 1 mg/ml. (A–H) IgG-[H]-VHH-Formate zeigten keine Aggregation und keinen Peak nur der schweren Kette. (I–P) IgG-[L]-VHH-Formate hatten keinen Aggregationspeak, jedoch schwächte die Verbindung von VHH mit der leichten Kette die Assoziation von HC und LC, es gab einen kleinen Peak bei der Elutionszeit von 8,1–8,4 Minuten.

Die Bindungsfähigkeit von BiPT-18–25 wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der PD-L1-überexprimierenden 293-T-Zelllinie analysiert, um den Einfluss von VHH auf IgG zu untersuchen. Hier banden alle IgG-[H]-VHHs PD-L1+ 293 T-Zellen im gleichen Ausmaß, sowohl im Hinblick auf die maximale als auch auf die halbmaximale effektive Konzentration (EC50) (Abb. 3A, Tabelle 1). Im Vergleich zum Elternantikörper YN035 zeigte BiPT-18–25 einen 1,5–2,0-fachen Verlust in EC50, wir konnten jedoch im ForteBio-Assay keine Affinitätsverringerung feststellen (Daten nicht gezeigt). Um den möglichen Einfluss des VHH auf die CD16a-Bindungsregion auf BsAbs zu bewerten, führten wir außerdem In-vitro-Zytotoxizitätstests durch. Alle bispezifischen Antikörper, YN035, hTIGI7.11E, und die Kombination der Elternantikörper wurden mit PD-L1+ 293 T gemessen und menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) (Abb. 3B). Alle Gruppen mit Ausnahme von hTIGI7.11E wiesen hinsichtlich der maximalen Lyse und EC50 den gleichen Grad an Zytotoxizität auf. Diese Ergebnisse zeigten, dass die VHH-Fusion an die schwere Kette die Bindung von Fc an CD16a nicht unterbrechen würde. Als nächstes untersuchten wir die Bindungsfähigkeit und Zytotoxizität des VHH-Arms von BsAbs. Zunächst wurde eine Durchflusszytometrie unter Verwendung der TIGIT-überexprimierenden 293-T-Zelllinie durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass BiPT-22–25 (VHH-HC-Ausrichtung) die Bindungsaktivität von hTIGI7.11E und BiPT-18–21 (HC-VHH-Ausrichtung) beibehielt. zeigten eine signifikante Verringerung der Bindung und der Bindungsverlust verstärkte sich mit kürzerer Linkerlänge (Abb. 3C, Tabelle 1). Es gab eine sterische Behinderung für die Antigenerkennung, wenn das VHH an den C-Terminus der schweren Kette fusioniert wurde. Die gleichen Ergebnisse konnten im Zytotoxizitätstest beobachtet werden: BiPT-18–21 schnitt bei der Zelllyse schlechter ab als BiPT-22–25 (Abb. 3D, Tabelle 1). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Linkerlänge für die Bindung und Zytotoxizität von VHH in der HC-VHH-Orientierung entscheidend ist, nicht jedoch in der VHH-HC-Orientierung. Angesichts der Bedeutung der Zytotoxizität für TIGIT-Antikörper waren BiPT-22, 23, 24 und 25 bessere Kandidaten für die weitere Entwicklung.

Bindungs- und ADCC-Aktivitäten von BiPTs. (A) Die Bindungsfähigkeit an menschliches PD-L1 wird gezeigt. (B) ADCC-Aktivität gegenüber der PD-L1-überexprimierenden 293-T-Zelllinie wird gezeigt. (C) Die Bindungsfähigkeit an menschliches TIGIT wird gezeigt. (D) ADCC-Aktivität gegenüber der TIGIT-überexprimierenden 293 T-Zelllinie wird gezeigt.

Neben der biologischen Aktivität von BsAbs wurden auch die Expressionsausbeute und die Stabilität analysiert. BiPT-18–25 wurden in 100 ml bzw. 300 ml EXPI293 exprimiert und dann unter den gleichen Bedingungen wie Materialien und Methoden gereinigt. Die Ergebnisse zeigten, dass der (G4S)2-Linker sowohl in der HC-VHH- als auch in der VHH-HC-Ausrichtung die höchste Ausbeute aufwies (Tabelle 1). Der Stabilitätstest zeigte keinen Unterschied zwischen BiPT-22–25 (Abb. 4A, B), jedoch verlor hTIGI7.11E bei 60 °C die Fähigkeit zur Halbbindung an TIGIT und BiPTs waren nicht beeinträchtigt. Das unerwartete Ergebnis zeigte, dass IgG zur Stabilisierung des VHH in BsAbs beitrug. Im Gegenteil, die Denaturierung von VHH bei 70 °C beeinträchtigte die Bindungsfähigkeit von BiPT-22–25 an PD-L1. Unter Berücksichtigung aller Ergebnisse war BiPT-23 der beste BsAb, der PD-L1 und TIGIT gleichzeitig binden konnte (Abb. 4C). BiPT-23 wurde zur Bewertung der Antitumoraktivität im menschlichen TIGIT-KI C57BL/6-Mausmodell ausgewählt.

Der Stabilitätstest von BiPT-22-25. (A) Nach der Erhitzungsbelastung bei variablen Temperaturen wurden 25 nM Antikörper mit der PD-L1-überexprimierenden 293 T-Zelllinie inkubiert, um ihre Bindungsfähigkeit zu bestimmen. (B) Nach der Erhitzungsbelastung bei variablen Temperaturen wurden 25 nM Antikörper mit der TIGIT-überexprimierenden 293 T-Zelllinie inkubiert, um ihre Bindungsfähigkeit zu bestimmen. (C) BiPT-23 könnte PD-L1 und TIGIT gleichzeitig im ForteBio Octet-Assay binden.

Da YN035 eine Kreuzreaktivierung zwischen menschlichem und Maus-PD-L1 aufwies, erkannte hTIGI7.11E nur menschliches TIGIT, und menschliches TIGIT konnte den Maus-Poliovirus-Rezeptor (PVR) kreuzerkennen27. Wir verwendeten die TIGIT-humanisierte C57BL/6-Maus und das MC38-Dickdarmkarzinom, um die In-vivo-Wirksamkeit zu bewerten und eine dosisabhängige Tumorregression zu beobachten. 36 mg/kg BiPT-23 zeigten im Vergleich zur IgG1-Fc-Gruppe eine Hemmung des Tumorwachstums (TGItv) von 53,7 % (Abb. 5A). Die durchflusszytometrische Analyse von Immunzellen innerhalb des TME zeigte, dass die T-Zellen in drei BiPT-23-Gruppen signifikant zunahmen (Abb. 5E). Bei den erhöhten T-Zellen handelte es sich größtenteils um CD8-positive CTL (Abb. 5F), während CD4-positive Th-Zellen einen leichten Rückgang zeigten (Abb. 5G). Wie bereits in einem früheren Bericht berichtet, reduzierten TIGIT-überexprimierende Treg-Zellen die ADCC-Aktivität von BiPT-23 deutlich (Abb. 5H). Darüber hinaus haben wir auch die Häufigkeit anderer PD-L1-positiver Immunzellen festgestellt, und BiPT-23 veränderte die Zusammensetzung der myeloischen Untergruppe nicht (Abb. 5C), was bedeutet, dass BiPT-23 andere PD-L1+-Tumorzellen als PD-L1+ selektiv depletierte Immunzellen, im Einklang mit einem anderen Bericht28. NK-Zellen nahmen auch in den Tiragolumab- und BiPT-23-Gruppen zu, obwohl es keinen statistischen Unterschied gab (Abb. 5D). Im Jahr 2018 stellte das Labor von Zhigang Tian fest, dass die Blockade von TIGIT die Erschöpfung tumorinfiltrierender NK-Zellen umkehrte und die Häufigkeit tumorinfiltrierender NK-Zellen erhöhte, die CD107a, Tumornekrosefaktor, Interferon-γ und CD226 exprimierten.

BiPT-23 hemmte das Tumorwachstum in vivo und erhöhte vorzugsweise die NK- und CTL-Zellen, verringerte die Treg-Zellen und hielt die CD11b+F4/80+-Immunzellen im TME aufrecht. (A) Die Antitumoraktivität von BiPT-23 mit drei Dosen. (B) Die Analyse von mCD45+-Zellen als Anteil lebender Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. (C) Die Analyse von mCD11b+ F4/80+-Zellen als Anteil der mCD45+-Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. (D) Die Analyse von NK-Zellen (CD3-NK1.1+) als Anteil der mCD45+-Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. (E) Die Analyse von T-Zellen (CD3+) als Anteil der mCD45+-Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. (F) Die Analyse von CTL-Zellen (CD4-CD8+) als Anteil der mCD45+-Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. (G) Die Analyse der T-Helferzellen (Th) (CD4+CD8-) als Anteil der mCD45+-Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. (H) Die Analyse von Treg-Zellen (CD4+FoxP3+) als Anteil der mCD4+-Zellen innerhalb des TME wird gezeigt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt und unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA nach dem Tukey-Test im Vergleich zu jeder Gruppe analysiert. (*p < 0,05, ***p < 0,001).

PD-L1 wird in den meisten normalen Geweben nicht exprimiert, mit Ausnahme von Makrophagen. Seine Expression kann jedoch durch viele Zytokine, insbesondere Interferon-γ30, induziert und aufrechterhalten werden. In vielen menschlichen Tumoren wurde über hohe Expressionsniveaus von PD-L1 berichtet30, und während einer aktiven Antitumor-Immunantwort könnte PD-L1 einen Mechanismus zur Tumorflucht bereitstellen31. Die PD-L1-Expression ist ein Indikator für eine schlechte Prognose für das Patientenüberleben32. Darüber hinaus korrelierte die Reaktion des Anti-PD-L1-mAb stärker mit der PD-L1-Expression auf Immunzellen wie Makrophagen, dendritischen Zellen und T-Zellen, außer Tumorzellen Zellen33.

Avelumab, ein humaner IgG1-Anti-PD-L1-mAb, wurde 2017 von der FDA zur Behandlung von Merkelzellkarzinomen entwickelt und zugelassen. Die klinische Analyse ergab, dass Avelumab menschliche Lungentumorzelllinien wie H460 und H441 lysieren konnte, nicht jedoch autologe PD-L1-positive PBMC von Krebspatienten, selbst das Expressionsniveau von PD-L1 war dem von H46028 ähnlich. Es scheint, dass Anti-PD-L1-mAb mit kompetentem Fc sowohl als Checkpoint-Blockade als auch als tumorzellspezifischer Killer fungieren kann. Darüber hinaus behielten sie laut der offiziellen Website von CStone Pharmaceuticals das ADCP eines zugelassenen Anti-PD-L1-Antikörpers (Sugemalimab) bei, um die direkte Tumorabtötung durch Makrophagen zu induzieren und die Tumorantigenpräsentation für eine langfristige Antitumorimmunität zu verbessern.

In den klinischen Studien verwendeten die meisten Anti-TIGIT-mAbs IgG1-Fc, wie Tiragolumab (Roche), Vibostolimab (Merck) und Ociperlimab (BeiGene)34. Ein gemeinsamer Mechanismus war die selektive Depletion von TIGIT-überexprimierenden Tregs innerhalb der Tumormikroumgebung20. Über ADCC/ADCP von IgG1-Fc hinaus fanden Forscher heraus, dass zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) und TIGIT-mAbs für eine optimale T-Zellaktivität die Bindung von menschlichem CD16a an APCs erfordern. Die In-vitro-Stimulierung menschlicher PBMCs ergab, dass die IL-2-Sekretion von der CD16a-hIgG1-Wechselwirkung abhängt und dass DLE-mutiertes Fc sogar die IL-2-Produktion steigert. Anti-TIGIT-mAbs mit funktionellem Fc könnten dabei helfen, die Immunsynapse von T-Zellen und APCs zu bilden21.

Eines der Probleme bei der Entwicklung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren ist die durch Fc vermittelte Zytotoxizität aufgrund der Lyse von PD-L1+- und TIGIT+-Immunzellen. Allerdings könnte funktionelles Fc auch für zusätzliche MOA der Antitumoraktivität sorgen.

Hier haben wir einen tetravalenten bispezifischen Antikörper entwickelt, der auf PD-L1 und TIGIT abzielt und mit einem voll funktionsfähigen Fc ausgestattet ist. Wir nutzten die Vorteile von VHH, um das beste bispezifische Antikörperformat und den besten Linker mit optimaler Entwicklungsfähigkeit und Zytotoxizität auszuwählen. Wir fanden heraus, dass die Assoziation von schwerer Kette (HC) und leichter Kette (LC) erheblich durch die Position von VHH beeinflusst wurde. Wenn sich die Fusionsstelle an der leichten Kette befand, betrugen 7–17 % der schweren Kette unabhängig von der Länge des Linkers 7–17 %. Nur-Kettenprodukt, gemischt mit den gereinigten BsAbs (Abb. 2I–Q). Die VHH-Bindungsfähigkeit erlitt auch einen Verlust im Durchflusszytometrie-Assay (Daten nicht gezeigt). Der konstante Bereich der LC trennte den variablen Bereich der leichten Kette (VL) und VHH, der längste Linker (GGGGS)3 beträgt etwa 5,7 nm23, sodass es für VHH keinen Grund gab, sich mit VL in cis zu paaren.

Einige Berichte untersuchten die Beziehung zwischen BsAb-Formaten und ADCC35. Forscher entwickelten einst tetravalente IgG1-Antikörper mit dualem IGF-1R-EGFR-Targeting auf der Basis von IgG und einem einkettigen variablen Fragment (scFv). Sie fanden heraus, dass die scFv-Fusion an den N-Terminus von HC oder LC zu einer geringen Ausbeute an BsAbs führte, was nicht der Fall war beobachtet in unserem BiPT-22–25 (Tabelle 1). Darüber hinaus wurde durch die Bindung von scFv an den C-Terminus von HC die Zytotoxizität bispezifischer Antikörper vollständig aufgehoben, obwohl die Affinität von scFv nur um das Zweifache sank. In unseren HC-VHH-Orientierungsformaten hatte die Fusion von VHH mit HC keinen Einfluss auf die Fc-FcγR-Wechselwirkung (Abb. 3) und die ADCC-Aktivität stand in positivem Zusammenhang mit der Bindungsfähigkeit von VHH (Abb. 4). Es scheint, dass die beste Fusionsstelle für scFv der C-Terminus von LC war, für VHH war der N-Terminus von HC die beste Wahl in unserer Arbeit.

Es gibt mehrere Lösungen zur Stabilisierung von VHH, darunter das Pfropfen komplementaritätsbestimmender Regionen in stabile Gerüste, die Einführung nichtkanonischer Disulfidbindungen, Zufallsmutagenese mit anschließender stringenter Selektion und Punktmutation negativer oder positiver Ladungen sowie genetische Fusionen36,37. Forscher nutzten einst den Säureschwanz von α-Synuclein (ATS) als Fusion mit einem Einzeldomänen-Antikörper (sdAb), dem die Disulfidbindung fehlte, was zur Stabilisierung des sdAb38 beitrug. Es wurde angenommen, dass eine Senkung des isoelektrischen Punkts (pI) von sdAbs zu einer Erhöhung führen könnte ihre Stabilität39. In unserer Arbeit haben wir jedoch herausgefunden, dass die Fusion von VHH mit dem HC von YN035 die Bindungsleistung von VHH nach der Erhitzungsbelastung verbesserte (Abb. 4). Die gleichen Ergebnisse können auch bei der Langzeitstabilität bei 40 °C beobachtet werden Assay (Daten nicht gezeigt). Der pI von YN035 wurde mit 8,54 berechnet, VHH betrug 8,34, BiPTs betrug etwa 8,50, VH von YN035 betrug 9,20 und HC von YN035 betrug 8,77, der variable Bereich der schweren Kette (VH) plus VL betrug 8,61, es gab keinen Grund um den pI von VHH durch IgG zu senken. Im Gegenteil, andere Berichte zeigten, dass positiv geladenes VHH möglicherweise aggregationsresistenter ist37,40, was mit unserem Ergebnis übereinstimmt.

In vivo unterdrückte BiPT-23 das Tumorwachstum deutlich, indem es die Infiltration von CD8+ T-Zellen und NK-Zellen verstärkte und TIGIT+ Treg-Zellen dezimierte. Interessanterweise zeigte BiPT-23 keinen Rückgang der CD11b+F4/80+-Zellen, einschließlich dendritischer Zellen (DCs) und Makrophagen. Die PD-L1-Expression durch DCs ist ein wichtiger Regulator der T-Zell-Immunität bei Krebs. Die PD-1-Signalübertragung kann die T-Zell-Antworten während der Kreuzpräsentation von Tumorantigenen durch DCs41 einschränken. BiPT-23 fungiert möglicherweise nicht nur als Blockade von PD-L1 und TIGIT, sondern verstärkt auch die Wechselwirkung zwischen TIGIT-exprimierenden T-Zellen und PD-L1+FcRs+ DCs. Unseres Wissens war BiPT-23 der erste bispezifische Antikörper, der für die ADCC-Aktivität optimiert war und Potenzial für die klinische Entwicklung hatte.

In Zukunft könnte sich unser bispezifischer Antikörper mit Zytokinen verbinden, die die NK-Proliferation und -Funktion wie Interleukin-2 und Interleukin-15 verstärken, um NK-vermittelte ADCC gegen Antikörper-beschichtete Tumorzellen und reguläre T-Zellen zu verstärken.

Die T-Zelllinie 293 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben.

Die PBMCs wurden von gesunden Spendern gewonnen und die Einverständniserklärung wurde von ihnen eingeholt.

Diese Studie mit Mäusen wurde von Biocytogen gemäß den AAALAC-Richtlinien durchgeführt. Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee von Biocytogen und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt. Am Ende des Experiments wurden die Tiere mit einem Überschuss an CO2 eingeschläfert.

Alle Studien in diesem Artikel wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Unterstütztes Wachstum von EXPI293 auf eine Dichte von 1,6 × 106 Zellen/ml mit OPM-293 CD05-Medium (OPM, 12112701), SMM293-TII (SB, RZ14JL0801) und 8 mM Gluta MAX-1 (100x) (gibco, 2085465) , inkubiert in einem Orbitalschüttler bei 37 °C, ≥ 80 % relativer Luftfeuchtigkeit und 8 % CO2, 120 U/min. Am nächsten Tag erreichten EXPI293-Zellen eine Dichte von 3 × 106 lebensfähigen Zellen/ml. Unter Verwendung von OPTI-MEM (gibco 2120548) zur Verdünnung von Plasmid-DNA und 1 mg/ml PEI (Plasmid-DNA:PEI = 1:2), vorsichtiges Invertieren des Komplexes 2–3 Mal und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Das verdünnte PEI wurde zu verdünnter Plasmid-DNA hinzugefügt, die Mischung 20 Minuten lang auf Raumtemperatur gebracht und dann die Lösung in die Zellkultur überführt. Nach 5-tägiger Inkubation wurde die Kultur 10 Minuten lang bei 8000 g zentrifugiert und der Überstand mit einem 0,5-μm-Filter (Cobetter, OES0423) filtriert.

AKTA avant 25(GE) eingeschaltet, 10 ml Mab SelctSure (GE)-Säule an das System angeschlossen, die Flussrate auf 3 ml/min eingestellt, die Säule nacheinander mit 0,5 M NaOH und 1×PBS gewaschen, bis die Grundlinien erreicht waren flach, dann ließ man die Probe durch die Säule laufen. Als der Probenüberstand durch das Säulensystem lief, wurde die Säule mit 1×PBS gewaschen, bis die Grundlinien flach waren, 0,1 M Gly-HCl, pH 3,0 zum Eluieren des Proteins verwendet und mit 1 M Tris-HCl neutralisiert. Eine 50-ml-G-25-Entsalzungssäule wurde an das System angeschlossen, die Flussrate auf 8 ml/min eingestellt und die Säule nacheinander mit 0,2 M NaOH und 1xPBS gewaschen, bis die Grundlinien flach waren. Gesammeltes Protein, Filtrierung der Sammlung durch einen 0,22-μm-Filter (Pall, FG1375), Bestimmung der Konzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo, UJ292598).

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Agilent Technologies 1200-Serie) eingeschaltet, zunächst MilliQ-Reinwasser mit einer Durchflussrate von 2 ml/min verwendet, um die Luft in der Systemleitung zu entfernen, das SET-C SEC-300 (Sepax, 2F36102) angeschlossen ) auf das Instrument auftragen, nachdem es 30 Minuten lang gewaschen wurde. Anschließend wurde die Säule 1 Stunde lang mit reinem MilliQ-Wasser bei einer Flussrate von 0,5 ml/min gereinigt und eine weitere Stunde lang mit PBS bei einer Flussrate von 1 ml/min verwendet. Bei verdünnten Antikörpern auf 1 mg/ml jeweils 100 μl des Markers und der verdünnten Antikörper in das Probenröhrchen geben. Stellen Sie das Markierungsladevolumen auf 6 μl, die Flussrate 1 ml/min ein und lassen Sie es 20 Minuten lang laufen. Stellen Sie dann das Antikörperladevolumen auf 10 μl, die Flussrate 1 ml/min ein und lassen Sie es 20 Minuten lang laufen.

Nach der Verdauung und Zentrifugation von humanen TIGIT-exprimierenden 293 T-Zellen und humanen PD-L1-exprimierenden 293 T-Zellen wurden diese in PBS mit 0,1 % BSA resuspendiert und 4E4-Zellen wurden zu einer 96-Well-Platte hinzugefügt, 30 μl pro Well. Die entsprechenden Antikörper wurden auf 200 nM verdünnt und dann in 11 Gradienten um das Dreifache verdünnt, wobei dem letzten Gradienten kein Antikörper hinzugefügt wurde. 30 μl Antikörperlösung mit der Zellsuspension mischen und 1 Stunde bei 4 °C inkubieren. Die Zellen wurden zweimal mit PBS mit 0,1 % BSA gewaschen und jeweils 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Der Anti-Human-IgG-Fc-650-Sekundärantikörper (abcam, Katalognummer: ab98593) wurde mit 0,1 % BSA-haltigem PBS in einer 1:200-fachen Verdünnung verdünnt, 30 μl in jede Vertiefung gegeben und 30 Minuten bei 4 °C inkubiert Mindest. Die Zellen wurden dreimal mit PBS mit 0,1 % BSA gewaschen. Schließlich wurden die Zellen mit 30 μl PBS mit 0,1 % BSA resuspendiert, die Daten mit dem iQue-Gerät gelesen und mit Graphpad eine Vier-Parameter-Anpassungskurve zur Berechnung von EC50 erstellt.

BiPT-22, BiPT-23, BiPT-24, BiPT-25, YN035 und hTIGI7.11E in 100 nM mit PBS verdünnt und dann bei 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C inkubiert °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C für 1 Stunde, Durchflusszytometrie bei einer Konzentration von 25 nM durchgeführt, um die Bindungsfähigkeit aller Antikörper festzustellen.

Die Dual-Target-Bindung von BiPT-23 wurde mit BLI auf dem OCTET RED384-Instrument (Sartorius) gemessen. 100 nM BiPT-23 wurde 200 s lang mit dem Anti-Human Fc Capture (AHC)-Biosensor (Sartorius AG) eingefangen. Die Bindungskonzentrationen von PD-L1 und TIGIT betrugen 100 nM, mit 400 s Assoziationsphase und 800 s Dissoziationsphase, gefolgt von 5 s Regeneration in Glycinlösung (pH = 1,5).

293 T-Zelllinien, die sowohl humanes TIGIT oder PD-L1 als auch Luciferase stabil exprimieren, wurden konstruiert, und die Zielzellen wurden gezählt, zentrifugiert und in einem „DMEM + 10 % FBS“-Medium resuspendiert, 5000 Zellen pro Vertiefung Zielzellen. Gespülte PBMC 3-mal mit PBS, 500-g-Zentrifugation für 5 Minuten, 400-g-Zentrifugation für 5 Minuten, 300-g-Zentrifugation für 5 Minuten, alle Zentrifugationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Effektorzellen wurden in einem „DMEM + 10 % FBS“-Medium resuspendiert, 1,75E5-Zellen pro Vertiefung, und das Verhältnis von effektiven und Zielzellen betrug 35:1. Verdünnte Antikörper auf die anfängliche Arbeitskonzentration: 100 nM, achtfache Verdünnung, 7 Konzentrationsgradienten, 50 μl/Well. Mischen Sie Zielzellen, Effektorzellen und Antikörper in einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen und undurchsichtigem weißem Hintergrund. Gleichzeitig wurde eine separate Vertiefung der Zielzelle als Kontrolle eingesetzt. Nach 48-stündiger Inkubation in einem Inkubator bei 37 °C wurde der Luciferase-Gehalt in der Platte mit einem Tecan-Lesegerät erfasst. Lyseprozentsatz (%) = (Zielzellvertiefung n-Antikörpervertiefung m)/Zielvertiefung n × 100.

5 × 105 in PBS resuspendierte MC38-Zellen wurden subkutan in die rechte Flanke weiblicher TIGIT-humanisierter C57BL/6-Mäuse implantiert. Als das mittlere Tumorvolumen 100 ± 50 mm3 erreichte, wurden die Mäuse anhand des Tumorvolumens und des Körpergewichts ausgewählt. Qualifizierte Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip 5 Versuchsgruppen mit 6 Mäusen in jeder Gruppe zugeordnet. Mäuse wurden insgesamt sechsmal alle drei Tage mit den angegebenen Proteinen oder menschlichem IgG1-Fc in einer Menge von 10 mg/kg behandelt. Die Tumorvolumina wurden mit dem Messschieber erfasst und die Volumina wurden unter Verwendung der modifizierten Ellipsoidformel ½ m Länge n Breite berechnet. Nach dem Experiment wurde das Tumorgewebe der Maus gesammelt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, die mit LD-eF506 und den folgenden Antikörpern gefärbt wurde: Anti-mCD16/32, Anti-mCD45-APC/Cy7, Anti-mCD3ε-PerCP/Cy5.5 , Anti-mCD4-PE, Anti-mCD8a-BV605, Anti-mNK1.1-BV421, Anti-m/hCD11b-APC, Anti-mF4/80-FITC, Anti-m/rFoxp3-PE/Cy7. TGITV(%) = [1 − (Ti − T0)/(Vi − V0)] × 100 % (Ti: das mittlere Tumorvolumen der Behandlungsgruppe am i. Tag der Verabreichung, T0: das mittlere Tumorvolumen der Behandlung Gruppe am 0. Tag der Verabreichung; Vi: das mittlere Tumorvolumen der IgG1-Fc-Kontrollgruppe am i. Tag der Verabreichung, V0: das mittlere Tumorvolumen der IgG1-Fc-Kontrollgruppe am 0. Tag der Verabreichung). Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt und unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA nach dem Tukey-Test im Vergleich zu jeder Gruppe (*p < 0,05, ***p < 0,001) analysiert.

Alle Daten sind im Artikel enthalten.

Bispezifische Antikörper

Gesamtrücklaufquote

Gesamtüberleben

Variable Domäne der schweren Kette eines Nur-schwere-Kette-Antikörpers

Programmierter Todesligand 1

T-Zell-Immunrezeptor mit Ig- und ITIM-Domänen

Monoklonaler Antikörper

Zytotoxische T-Lymphozyten

Natürlicher Mörder

Antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität

Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose

Schwere Kette

Lichterkette

Antigenpräsentierende Zelle

Dendritische Zelle

Tumor-Mikroumgebung

Tumorinfiltrierende Lymphozyten

Regulatorische T-Zellen

Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu von IgG1-Fc

Halbmaximale wirksame Konzentration

Immunglobulin G

Wirkmechanismus

US-amerikanische Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde

Mononukleäre Zelle des menschlichen peripheren Blutes

Poliovirus-Rezeptor

Zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4

Isoelektrischer Punkt

Variabler Bereich der schweren Kette

Variabler Bereich der leichten Kette

Einkettiges variables Fragment

Dendritische Zellen

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Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Zhenwei Zhong, Mengyao Zhang, Yanan Ning und Guanchao Mao.

Abteilung für Forschung und Entwicklung, Oricell Therapeutics, Origincell Industrial Park, No. 1227 Zhangheng Road, Pudong New District, Shanghai, 201203, China

Zhenwei Zhong, Yanan Ning, Xiaopei Li, Qi Deng, Xiaorui Chen, Dongliang Zuo, Xiangyu Zhao, Ermin Xie, Huajing Wang, Lina Guo und Xiaowen He

Graduiertenschule der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Medicine and Health Science, Shanghai, 201203, China

Mengyao Zhang & Bohua Li

Abteilung für Schutzmedizin gegen chemische Arbeitsstoffe, Fakultät für Marinemedizin, Naval Medical University, Shanghai, 200433, China

Guanchao Mao und Kai Xiao

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ZZ und XH konzipierten diese Studie, interpretierten die Ergebnisse und verfassten das Manuskript. ZZ, MZ, YN, GM, XL, QD, XC, DZ, XZ und EX führten Experimente durch. Von ZZ und HW vorbereitete Figuren. XH überwachte die Studie. Alle Autoren kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Zhenwei Zhong oder Xiaowen He.

Zhenwei Zhong, Yanan Ning, Qi Deng, Xiaorui Chen, Dongliang Zuo, Ermin Xie, Huajing Wang, Lina Guo und Xiaowen He sind aktuelle Mitarbeiter von Oricell Therapeutics, das Antikörper- und CAR-T-Therapeutika entwickelt und vermarktet.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhong, Z., Zhang, M., Ning, Y. et al. Entwicklung eines bispezifischen Antikörpers gegen PD-L1 und TIGIT mit optimaler Zytotoxizität. Sci Rep 12, 18011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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Eingegangen: 19. Juli 2022

Angenommen: 21. Oktober 2022

Veröffentlicht: 26. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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Entwicklung eines bispezifischen Antikörpers gegen PD