Der SIRPα-Antikörper in Kombination mit dem onkolytischen Virus OH2 schützt vor Tumoren, indem er die angeborene Immunität aktiviert und die Immunmikroumgebung des Tumors neu programmiert

BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 376 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Kombination onkolytischer Viren (OVs) mit Immun-Checkpoint-Blockaden ist ein Forschungsschwerpunkt und hat eine gute Wirksamkeit gezeigt. Hier präsentieren wir den ersten Versuch, das onkolytische Herpes-simplex-Virus 2 (OH2) mit einem Anti-SIRPα-Antikörper als Antitumorbehandlung zu kombinieren. Unsere Ergebnisse bieten einzigartige Einblicke in die Kombination von angeborener Immunität und OV.

Wir haben die Polarisation und Aktivierung von OH2 in RAW264.7-Zellen in vitro überprüft. Anschließend untersuchten wir die Antitumorfähigkeit der kombinierten Therapie mit OH2 und Anti-SIRPα in einem tumortragenden Mausmodell. RNA-seq und Einzelzell-RNA-seq wurden verwendet, um die Veränderungen in der Tumormikroumgebung zu charakterisieren.

Die OH2-Lysate stimulierten RAW264.7-Zellen effektiv zur Polarisierung in Richtung des M1-, aber nicht des M2-Phänotyps und aktivierten die Funktion des M1-Phänotyps in vitro. Im Makrophagen-Clearance-Experiment induzierte die OH2-Therapie die Polarisierung von M1-Makrophagen und beteiligte sich an der Antitumor-Immunantwort in einem tumortragenden Mausmodell. Die Behandlung mit einer Kombination aus OH2 und Anti-SIRPα hemmte wirksam das Tumorwachstum und verlängerte die Überlebenszeit der Mäuse deutlich. Dieses Ergebnis war im Mausmodell mit einem größeren Tumorvolumen zu Beginn der Behandlung deutlicher. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Kombinationstherapie die TME tiefgreifender umgestalten und stärkere angeborene und adaptive Immunantworten aktivieren kann.

Unsere Daten belegen die Machbarkeit einer onkolytischen Virustherapie in Kombination mit Anti-SIRPα-Antikörpern und legen eine neue Strategie für die onkolytische Virustherapie nahe.

Peer-Review-Berichte

Der Einsatz von Viren zur Krebstherapie begann vor mehr als einem Jahrhundert. Mit der Entwicklung der Gentechnik und Fortschritten beim Verständnis des Wirkmechanismus von Viren könnten onkolytische Viren (OVs) zu einer idealen therapeutischen Plattform werden. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass die abtötende Wirkung von OVs auf Tumorzellen nicht nur über die direkte zytolytische Aktivität erfolgt, sondern auch einen komplexen Regulierungsmodus beinhaltet, der mehrere Mechanismen kombiniert [1]. Zu diesen Mechanismen gehören die Regulierung von Veränderungen in der Mikro- und Makroumgebung des Tumors, spezifische, durch CD8+ T-Zellen vermittelte Immunantworten und angeborene zelluläre Immunantworten [2,3,4]. Trotz ihrer vielfältigen therapeutischen Wirkungsmechanismen haben viele präklinische und klinische Studien gezeigt, dass die meisten onkolytischen Viren, ob bewaffnet oder unbewaffnet, als Monotherapien eine begrenzte Wirksamkeit zeigen [5, 6]. Die Fähigkeit onkolytischer Viren, die Tumormikroumgebung (TME) zu modifizieren und immunologisch „kalte“ Tumore zu verändern, legt nahe, dass eine Kombination onkolytischer Viren mit anderen Therapien wie Immuntherapie oder Chemotherapie bessere Therapieergebnisse erzielen kann [7, 8].

Derzeit ist die Kombination von OVs und Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) ein Forschungsschwerpunkt und hat in einigen klinischen Studien eine gute Wirksamkeit gezeigt [9]. Die Kombination von OVs und Immuntherapie konzentriert sich jedoch hauptsächlich auf die Regulierung von T-Zellen, und es gibt nur wenige Studien zu deren Wirkung auf die angeborene Immunität. OVs fördern den immunogenen Zelltod (ICD) während der Zelllyse und rekrutieren und aktivieren dadurch angeborene Immunzellen wie Makrophagen und dendritische Zellen durch die Freisetzung von schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs) und pathogenassoziierten molekularen Mustern (PAMPs) und fördern den Aktivierung tumorspezifischer T-Zellen im TME [4, 10]. Daher wird erwartet, dass die Aktivierung myeloider Zellen zur Aktivierung der Tumorabtötung und zur Verbesserung der Antigenpräsentation zur Aktivierung der endogenen Immunfunktion einzigartige Erkenntnisse für die Antitumortherapie liefert.

Makrophagen sind eine Klasse hochplastischer Immunzellen mit vielfältigen Funktionen, die aufgrund ihres Polarisationszustands üblicherweise in klassisch aktivierte M1-Makrophagen und M2-Makrophagen unterteilt werden [11]. M1-Makrophagen fördern die entzündliche Th1-Reaktion durch die Freisetzung entzündlicher Zytokine und verstärken die T-Zell-Reaktion durch Hochregulierung der Antigenpräsentation und der Expression kostimulatorischer Moleküle weiter [11, 12]. Daher könnten M1-Makrophagen an der Antitumorimmunität in der Tumormikroumgebung beteiligt sein. M2-Makrophagen werden im Allgemeinen mit der Hemmung der endogenen Antitumorimmunität in Verbindung gebracht. Die Reduzierung der M2-Makrophagenzahl und die Erhöhung der M1-Makrophagenzahl sind wichtige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Tumortherapie. Darüber hinaus wird die phagozytische Funktion von Makrophagen durch die CD47-SIRPα-Antiphagozytose-Achse reguliert [13]. CD47 hemmt die Phagozytose von Makrophagen durch hohe Expression auf Tumorzellen [13, 14]. Die Anti-Phagozytose der CD47-SIRPα-Achse kann durch Antikörper blockiert werden, wodurch die Phagozytose von Makrophagen erhöht wird. Eine aktuelle Studie zeigte, dass die Blockierung von SIRPα auf Makrophagen die Antitumorfähigkeit von Makrophagen wirksam aktivieren kann [15].

In früheren Studien [16, 17] haben wir herausgefunden, dass die Behandlung mit dem onkolytischen Herpes-simplex-Virus 2 (OH2) die TME wirksam verändern und bei Mäusen eine Antitumor-Immunantwort auslösen kann. In dieser Studie behandelten wir ein Maustumormodell mit einer Kombination aus OH2 und einem Anti-SIRPα-Antikörper. Wir analysierten die therapeutische Wirkung und den Immunaktivierungsstatus der Kombinationstherapie. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass OH2 in Kombination mit der Aktivierung von Makrophagen eine vielversprechende Antitumortherapie ist.

Die Zelllinien CT26, MC38, 4T-1 und RAW264.7 wurden von der National Infrastructure of Cell Line Resource (Peking, China) erworben und von unserem Labor aufbewahrt. Die Zellen wurden in einem Inkubator mit konstanter Temperatur, der 5 % CO2 enthielt, bei 37 °C kultiviert.

OH2 wurde von Binhui Biopharmaceutical Co., Ltd. (Wuhan, China) bereitgestellt. Bei dem Virus handelte es sich um ein abgeschwächtes OH2, das vom Wildtyp-HSV-2-Stamm HG52 stammte, bei dem das ICP47-Gen und das ICP34.5-Gen deletiert waren [18, 19].

Die CT26-, MC38- und 4T-1-Zelllinien in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 10-cm2-Kulturschalen überführt, sobald die Zellen eine Konfluenz von 70–80 % erreichten, die Zellen mit PBS gespült und dann 5 ml serumfreies RPMI-1640-Medium hinzugefügt (HyClone, Waltham, MA) und infizieren Sie die Zellen mit OH2 gemäß MOI=1 und fügen Sie nach 1 Stunde 5 ml RPMI1640-Medium mit 10 % FBS (Gibco, Waltham, MA) hinzu. Nach 30 Stunden wurde der Zellüberstand gesammelt, 5 Minuten bei 4 °C und 400 g zentrifugiert und das Lysat gesammelt und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Als Kontrolle wurden der zellfreie Überstand (CFS) von CT26, 4T-1, MC38 und unbehandeltem RAW264.7 verwendet. Das CFS von CT26, 4T-1 und MC38 wurde aus dem Kulturüberstand von Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase erhalten und 5 Minuten lang bei 4 °C und 400 g zentrifugiert. Der durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen hergestellte Überstand von CT26-, MC38- und 4T1-Zelllysat wurde auch als Kontrollgruppe verwendet.

RAW264.7-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden auf einer 96-Well-Platte mit 2000 Zellen/Well verteilt und mehr als 6 Stunden lang kultiviert. Nachdem die Zellen angeklebt waren, wurden das Lysat und die Kontrollen zu den Zellen hinzugefügt und der Nachweis mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK8) wurde zu den entsprechenden Zeitpunkten (0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h) durchgeführt ( Dojindo, Kumamoto, Japan). Vor der Detektion wurden 100 μl Detektionsarbeitslösung (CCK8-Reagenz: RPMI1640-Medium = 1:10) in jede Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 im Dunkeln inkubiert. Schließlich wurde ein Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad, Japan) verwendet, um die Absorption der Zellen bei einer Wellenlänge von 450 nm zu erfassen.

RAW264.7-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden auf einer 6-Well-Platte mit 106 Zellen/Well verteilt. Nach mindestens 6 Stunden waren die Zellen vollständig an der Wand befestigt und Lysat und Kontrolle wurden getrennt zugegeben. Nach 24-stündiger Behandlung wurden RAW264.7-Zellen mit FITC-Anti-Maus-F4/80 (Klon: FJK-16s, Invitrogen, Waltham, Massachusetts) und APC-Anti-Maus-CD86 (Klon: GL-1, Biolegend, San Diego) gefärbt , CA) und PE-Anti-Maus-CD206 (Klon: MR6F3, Invitrogen, Waltham, Massachusetts) gemäß dem Protokoll der Antikörper (M1-Makrophagen: F4/80+CD86+, M2-Makrophagen: F4/80+CD206+) isoliert und einem Fluss ausgesetzt Zytometrie (LSR II, BD). Zum Nachweis von SIRPα auf Makrophagen in der Milz von Mäusen wurden FITC-Anti-Maus-F4/80, APC-Anti-Maus-CD11b (Klon: M1/70, Biolegend, San Diego, CA) und PE-Anti-Maus-SIRPα (Klon: P84, Biolegend) verwendet , San Diego, Kalifornien). Die gesamte in dieser Studie zum Nachweis der Makrophagentypisierung verwendete Durchflusszytometrie wurde mit einer Antikörper-Isotyp-Kontrollgruppe (PE Rat IgG2a, Klon: RTK2758, Biolegend, USA; APC Rat IgG2a, Klon: RTK2758, Biolegend, USA; FITC Rat IgG2a, Klon) durchgeführt : RTK2758, Biolegend, USA).

Die CT26-, MC38- und 4T-1-Zelllinien in der logarithmischen Wachstumsphase wurden verdaut und in einer Konzentration von 1 × 106/ml resuspendiert. Ein μL CFSE-Arbeitslösung (C34554, Life Technology, Waltham, MA) (0,5 mM) wurde zu jeweils 2 ml Tumorzellen mit einer Konzentration von 1 × 106/ml gegeben und 8 Jahre lang bei 37 °C (5 % CO2) inkubiert Mindest. Nach der Inkubation wurden 10 ml vorgekühltes RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS hinzugefügt, um die Färbung zu stoppen. Der Überstand wurde durch Zentrifugation verworfen und die Zellkonzentration wurde mit RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS auf 5 × 105/ml eingestellt. Die Konzentration von rohem 264.7, behandelt mit Lysat und Kontrolle, wurde auf 5 × 106/ml eingestellt. Mit einem Verhältnis von 25:1, 50:1 und 100:1 als Effektor-Ziel-Verhältnis paralleler Proben wurde die Co-Kultivierung in einer U-förmigen Wellplatte mit 96 Vertiefungen, 100 μl rohen 264,7-Zellen und 100 μl durchgeführt In jede Vertiefung wurden Tumorzellen gegeben und 3 parallele Proben angelegt. Anschließend wird die Kulturplatte für 4 Stunden auf 37 °C (5 % CO2) gestellt. Vor dem Test wurden 200 μl PI (P8080, Solarbio, Peking, China) Arbeitslösung (2,5 μg/ml) in jede Kulturvertiefung gegeben.

Die CT26-, MC38- und 4T-1-Zelllinien und Makrophagen in der Milz von Mäusen wurden mit APC-Anti-Maus-CD47 (Klon: miap301, Biolegend, San Diego, CA) und gereinigtem Anti-Maus-SIRPα (Klon: P84, Biolegend) gefärbt , San Diego, CA) und Anti-Maus-IgG-Alexa 488-Antikörper (ab150113, Abcam, Cambridge, UK) gemäß dem Protokoll der Antikörper. Die Expressionsniveaus von CD47 und SIRPα wurden mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen.

Die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte wurden mehr als 6 Stunden lang bei 60–65 °C gebacken und dann heiß zum Entparaffinieren in Xylol gegeben. Den Schritten folgten Gradienten-Ethanol-Hydratisierung, Citrat-Reparatur-Antigen (ZLI 9064, Zsjqbio, Peking, China), 3 % Wasserstoffperoxid, das die endogene Peroxidase-Aktivität blockiert, Blockierung (SP-KIT-B2, MXB, Fujian, China), primärer Antikörper F480 ( Klon: SP115, Verdünnung: 1:200, Abcam, Cambridge, UK), CD86 (Klon: E5 W6H, Verdünnung: 1:500, CST, Danvers, Massachusetts), CD206 (polyklonal, Verdünnung: 1:100, Abcam, Cambridge , UK), CD8 (polyklonal, Verdünnung: 1:200, Affinity Biosciences, Jiangsu, China), CD16 (polyklonal, Verdünnung: 1:200, Affinity Biosciences, Jiangsu, China) und Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter Sekundärantikörper ( Kit-5010, MXB, Fujian, China) Inkubation, sichtbar gemacht mit dem 3,30-Diaminobenzidin-DAB-Chromogen (DAB-1031, MXB, Fujian, China), Hämatoxylin-Färbung (Solarbio, Peking, China), Salzsäure-Ethanol-Differenzierung und Ammoniakwasser wird wieder blau. Schließlich wurden die Gewebeschnitte nach der Dehydrierung mit Gradienten-Ethanol in Xylol dehydriert und mit neutralem Gummi versiegelt. Nach dem Trocknen wurden die Gewebeschnitte unter einem Mikroskop (Nikon Eclip se 80i, Japan) auf ihre Färbung untersucht.

Die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte wurden mehr als 6 Stunden lang bei 60 °C bis 65 °C gebrannt und anschließend heiß zum Entparaffinieren in Xylol gegeben. Nach der Hydratation mit Gradienten-Ethanol und dem Eintauchen in neutrales Formalin wurde jeder gefärbte Antikörper nacheinander durch Citrat repariert, durch Ziegenserum blockiert und mit primären Antikörpern gegen F480 (Klon: SP115, Verdünnung: 1:500, Abcam, Cambridge, UK), CD86 ( Klon: E5 W6H, Verdünnung: 1:1000, CST, Danvers, Massachusetts), CD206 (polyklonal, Verdünnung: 1:200, Abcam, Cambridge, UK), CD8 (polyklonal, Verdünnung: 1:500, Affinity Biosciences, Jiangsu, China), CD16 (polyklonal, Verdünnung: 1:500, Affinity Biosciences, Jiangsu, China) und sekundärer Antikörper und fluoreszierend gefärbt, um das Signal zu verstärken. Nachdem die Färbung abgeschlossen war, wurde die DAPI-Arbeitslösung tropfenweise hinzugefügt und schließlich wurde die Super-Anti-Quenching-Montagetablette gemäß den Anweisungen im Kit (TSA-RM, PANOVUE, Peking, China) zur Halterung hinzugefügt. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden gescannt und mit der Software Plaris und Inform analysiert.

IHC-Bilder wurden mit der Software CaseViewer2.4 gescannt. Der Grad der Färbung wurde bewertet: Zellen mit einer Färbung <10 % wurden als negative Färbung bewertet (–, 1), Zellen mit einer Färbung von 10–49 % wurden als (+, 2) bewertet; Zellen mit einer Färberate von 50–74 % wurden mit (++,3) bewertet, 75–100 % gefärbte Zellen wurden mit (+++,4) bezeichnet. Die Ergebnisse im positiven Färbebereich lauten wie folgt: farblos (0); hellgelbe Partikel (1), braune Partikel (2) und braune Partikel (3). Der Endwert wurde als der Wert des Ausmaßes der Färbung multipliziert mit dem Wert des positiven Bereichs der Färbung definiert [20]. Negative Ausdruckswerte lagen zwischen 0 und 5, positive Ausdruckswerte über 5 [21].

Die Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) gekauft. Sechs bis acht Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 19–20 g wurden in unserem Tierraum unter spezifischen aseptischen Bedingungen etwa eine Woche lang in einem Laminar-Flow-Ultraclean-Rack gehalten. Jede Maus wurde subkutan (sc) mit 3 × 105 CT26-Zellen auf der rechten Seite des Rückenbereichs inokuliert. Der Tumor trat nach etwa 5–7 Tagen auf und die Behandlung erfolgte, wenn der Tumordurchmesser auf 3–5 mm oder 8–10 mm angewachsen war.

Alle Vorgänge wurden gemäß den Standardarbeitsanweisungen des vom Staat festgelegten spezifischen Managementsystems für die experimentelle Mäusezucht ohne Krankheitserreger (SPF) durchgeführt. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen des National Cancer Center/Cancer Hospital, der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS) und des Peking Union Medical College genehmigt.

Es wurde ein Tumormodell für die subkutane CT26-Zelltransplantation konstruiert. Als der Durchmesser des Tumors 3–5 mm erreichte (Tag 7), wurden die Mäuse im CL-Modell in drei Gruppen (OH2 [OH2 + Kontrollliposomen], OH2 + CL und PBS-Kontrollgruppe) mit einer gleichmäßigen Verteilung aufgeteilt Tumorvolumina. Jeder Gruppe wurden mehr als 10 Mäuse zugewiesen. OH2 (2×106 Plaque-bildende Einheiten [PFU]) wurde durch intratumorale Injektion (it) am Tag 0, Tag 2 und Tag 4 in einem Volumen von 100 μl verabreicht. Einhundert Mikroliter CL (7 mg/ml, F70101C-NC, FormuMax, Sunnyvale, CA) oder Kontrollliposomen (7 mg/ml, F70101-N, FormuMax, Sunnyvale, CA) pro Maus wurden durch intraperitoneale Injektion (ip) verabreicht. am Tag vor der OH2-Behandlung. Der PBS-Kontrollgruppe wurden 100 μL PBS pro Maus verabreicht. Das Tumorwachstum wurde für jede Mäusegruppe regelmäßig beobachtet und aufgezeichnet. Nach 14 Tagen Behandlung wurden die Tumorgewebe zur immunhistochemischen und mehrfarbigen immunhistochemischen Färbung reseziert. Die Mäuse in der Überlebensbeobachtungsgruppe waren am 40. Tag erneut tumortragend.

Es wurde ein Tumormodell für eine subkutane CT26-Zelltransplantation konstruiert. Wenn der Durchmesser des Tumors 3–5 mm erreichte (Tag 7), wurde davon ausgegangen, dass der Tumor zum Zeitpunkt der Erstbehandlung kleiner war. Die Mäuse im Anti-SIRPα-Modell mit kleineren Tumoren bei der Erstbehandlung wurden in sechs Gruppen eingeteilt (OH2 + Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, OH2+-Isotyp-Gruppe, OH2-Gruppe, Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, Isotyp-Gruppe und PBS-Kontrollgruppe). mit einer gleichmäßigen Verteilung des Tumorvolumens. Jeder Gruppe wurden mehr als 10 Mäuse zugewiesen. Die OH2-Behandlung oder PBS wurde an den Tagen 0, 2 und 4 injiziert und der Anti-SIRPα-Antikörper (Klon: P84, Bioxcell, Lebanon, New Hampshire) oder Isotyp (TNP6A7, Bioxcell, Lebanon, New Hampshire) verabreicht an den Tagen 1 und 3. Der Anti-SIRPα-Antikörper und der Isotyp wurden mit 100 μg intraperitoneal (ip) injiziert, mit PBS ohne Konservierungslösung auf 1 mg/ml verdünnt und jeder Maus 100 μl intraperitoneal injiziert. Der PBS-Kontrollgruppe wurden 100 μL PBS pro Maus verabreicht. Die Verabreichungsmethode und Dosierung des OH2 waren die gleichen wie im CL-Modell. Das Tumorwachstum der Mäuse wurde regelmäßig alle zwei Tage beobachtet und aufgezeichnet.

Wenn der Durchmesser des Tumors 8–10 mm erreichte (Tag 14), wurde er als zum Zeitpunkt der Erstbehandlung größerer Tumor definiert. Die Mäuse im Anti-SIRPα-Modell mit größeren Tumoren bei der Erstbehandlung wurden in vier Gruppen (OH2+-Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, OH2+-Isotyp-Gruppe, OH2-Gruppe, Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und PBS-Kontrollgruppe) mit gleichmäßiger Verteilung aufgeteilt von Tumorvolumina. Jeder Gruppe wurden mehr als 10 Mäuse zugewiesen. Die Art der Verabreichung und Behandlungsstrategie war die gleiche wie oben beschrieben. Das Tumorwachstum von Mäusen wurde regelmäßig beobachtet und aufgezeichnet. Nach 12 Tagen Behandlung wurden die Tumorgewebe zur immunhistochemischen, mehrfarbigen immunhistochemischen Färbung und RNA-Sequenzierung reseziert.

Wenn der experimentelle Endpunkt oder der humanitäre Endpunkt erreicht war, beispielsweise wenn die Größe der Maus 2500 mm3 erreichte oder Tumormetastasen oder schnelles Wachstum zu Geschwüren, Nekrosen oder Infektionen führten, die das Essen oder Gehen beeinträchtigten, wurden die Mäuse mit 5 % Chloralhydrat anästhesiert und dann durch Genickbruch geopfert. Die Berechnungsformel des Tumorvolumens lautete Volumen = (Länge×Breite2)/2.

Die in dieser Studie enthaltene Transkriptomsequenzierung wurde von Tianjin Nuohe Zhiyuan Bioinformation Technology Co., Ltd. durchgeführt und abgeschlossen. RNA-Proben mussten ein Gesamtvolumen von ≥30 μl, ein Gesamtvolumen von ≥1,5 μg und eine Konzentration von ≥50 erreichen ng/μL. Die Quantifizierungsmethode der Agarosegelelektrophorese, Nanodrop und Agilent 2100 wurden verwendet, um die Konzentration, Reinheit und Integrität der eingereichten RNA zu testen. Der Typ der Bibliothekskonstruktion war eine eukaryotische Ketten-spezifische Bibliothek. Die Sequenzierungsstrategie war Illumina Hiseq-PE150 (Zwei-Wege-Sequenzierung).

Die Tumorgewebe der Kontrollgruppe, der OH2-Gruppe und der kombinierten Behandlungsgruppe wurden einer Einzelzell-Sequenzierungsanalyse unterzogen, und die in dieser Studie verwendete Einzelzell-Sequenzierungstechnologie wurde von der Huada Company bereitgestellt. Das Gewebe wurde mit dem Tumor Dissociation Kit (Maus, MACS) dissoziiert, die toten Zellen entfernt und die Einzelzellsuspension lebender Zellen zur Sequenzierung belassen. Die erhaltenen Daten wurden mit dem Seurat-Paket analysiert und das Vulkandiagramm mit dem R-Softwarepaket EnhancedVolcano erstellt. Zu den für die GO-Analyse und KEGG-Analyse verwendeten R-Paketen gehörten Tidyverse, Patchwork, Monocle, ClusterProfiler und org.Mm.eg.db.

Zur Analyse der Transkriptomsequenzierungsdaten wurde die R-Softwareversion 4.0.2 verwendet, und für die Analyse der differentiellen Expression zwischen Gruppen wurde das R-Softwarepaket „edgeR“ verwendet. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) wurde verwendet, um die unterschiedlichen Signalwege zwischen verschiedenen Gruppen zu untersuchen. Das R-Softwarepaket „clusterProfiler“ wurde für die Analyse von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verwendet. Die Gen-Set-Variationsanalyse (GSVA) ​​wurde für die Analyse der Immunzellinfiltration verwendet. Der Student-T-Test wurde verwendet, um die unterschiedlich exprimierten Gene zu vergleichen, und der P-Wert wurde mit der Benjamini-Hochberg-Methode angepasst und korrigiert. Die log2-fache Änderung war größer als 1 und der korrigierte P-Wert war kleiner als 0,01 als Schwellenwert zur Beurteilung der Signifikanz des Unterschieds. Als Referenzgene wurden insgesamt 770 immunologiebezogene Mausgene verwendet, die aus dem nCounter Mouse PanCancer Immune Profiling Panel (NanoString) erstellt wurden und in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 und der Zusatzdatei 2: Tabelle S2 aufgeführt sind.

Für die statistische Analyse wurde die GraphPad Prism-Software Version 8 verwendet und statistisch signifikante Unterschiede wurden als ap-Wert <0,05 definiert. Zum Vergleich zweier Gruppen wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) wurde an den experimentellen Daten für Tumorvolumina für mehr als zwei Gruppen durchgeführt. Für die Überlebenskurvendaten wurden die Kaplan-Meier-Methode und der Log-Rank-Test verwendet; Die Überlebenszeit wurde als die Zeit vom Beginn der Behandlung bis zum Ende der Beobachtung definiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. In dieser Studie wurden alle Experimente mindestens dreimal wiederholt, mit Ausnahme der anders angegebenen Teile.

Wir haben die Rolle von Makrophagen im Prozess der OH2-Behandlung von Dickdarmkrebs bestätigt, wie in Abb. 1A dargestellt. Wie in Abb. 1B gezeigt, wiesen die mit den Lysaten behandelten RAW264.7-Zellen laut CCK8-Assay eine deutlich verbesserte Lebensfähigkeit und Proliferationsfähigkeit auf (p<0,0001 für CT26- und MC38-Zellen, p=0,001 und p<0,0001 im Vergleich zum zellfreien Überstand). (CFS) und unbehandelte RAW264.7- bzw. 4T-1-Zellen). Die Lysate stimulierten die Aktivierung von Makrophagen. Wir inkubierten OH2 auch bei verschiedenen MOIs (MOI=1, MOI=0,5) mit RAW264.7-Zellen, um zu bestimmen, ob OH Makrophagen über CCK8 direkt aktivieren kann. Wie erwartet konnte die Zugabe von OH2 (Zusatzdatei 3: Abb. S1) oder gefrorenem Zelllysat (Zusatzdatei 3: Abb. S2) Makrophagen nicht innerhalb von 24 Stunden direkt aktivieren.

OH2-Lysate induzieren in vitro die Polarisation und Phagozytose von RAW264.7. Ein Schema der Lysatvorbereitung und ein Flussdiagramm des in der Studie durchgeführten Experiments. B Zellproliferations-Assay-Ergebnisse der mit Lysat (rot), CFS (blau) und unbehandelten (schwarz) behandelten Zelllinien CT26 (links), MC38 (Mitte) und 4T-1 (rechts) mittels CCK8-Assay in 24 Stunden. C Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse einer repräsentativen Probe aus jeder Zelllinie mit Lysat- oder CFS-Behandlung. D Der Prozentsatz des M1-Subtyps (F4/80+CD86+) in den Lysat-, CFS- und unbehandelten Gruppen von CT26-, MC38- und 4T-1-Zellen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie. Bei den Daten handelt es sich um Durchschnittswerte aus drei Proben pro Behandlungsgruppe. Ein ungepaarter Student-t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz des Unterschieds zwischen den beiden Gruppen zu analysieren, und ANOVA wurde verwendet, um die Signifikanz des Unterschieds zwischen den Gruppen zu analysieren (>2). E Das Verhältnis des M2-Subtyps (F4/80+CD206+) in den Lysat-, CFS- und unbehandelten Gruppen von CT26-, MC38- und 4T-1-Zellen, ermittelt durch Durchflusszytometrie. Bei den Daten handelt es sich um Durchschnittswerte aus drei Proben pro Behandlungsgruppe. Zur Analyse der Signifikanz des Unterschieds zwischen den Gruppen wurde ein ungepaarter Student-t-Test verwendet. F. Die phagozytischen und abtötenden Funktionen von Makrophagen, die mit verschiedenen Krebszelllysaten behandelt wurden, die durch CFSE/PI nachgewiesen wurden. Für jede Zelllinie wurden drei Effektor-Ziel-Verhältnisse festgelegt (RAW264.7: Tumorzellen = 25:1, 50:1 und 100:1). Bei den Daten handelt es sich um Durchschnittswerte aus drei Proben pro Behandlungsgruppe. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001

Anschließend verwendeten wir Durchflusszytometrie, um das Verhältnis von M1- (F4/80+CD86+) und M2-Makrophagen (F4/80+CD206+) nach der Lysatbehandlung zu ermitteln (Abb. 1C). Der Anteil der M1-Makrophagen nach Lysat- und CFS-Behandlung stieg signifikant an (p = 0,0015, p < 0,0001 und p < 0,0001 für CT26-, MC38- bzw. 4T-1-Lysat-Behandlung und p = 0,01, p = 0,0073 und p =). 0,023 für CT26-, MC38- bzw. 4T-1-CFS-Behandlung) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (Abb. 1D). Es gab auch signifikante Unterschiede zwischen den Lysaten und der CFS-Behandlung (p=0,01, p=0,0018 und p<0,0001 für CT26-, MC38- bzw. 4T-1-Lysatbehandlung). Interessanterweise gab es keinen Unterschied im Anteil der M2-Makrophagen zwischen der Lysat- und der unbehandelten Gruppe, aber der Anteil der M2-Makrophagen im CFS stieg im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen signifikant an (Abb. 1E, Zusatzdatei 3: Abb. S3). ). Das Verhältnis der Makrophagen M1 (F4/80+CD86+) und M2 (F4/80+CD206+) in mit Lysat behandelten RAW264.7-Zellen in der blockierten SIRPα-Gruppe und der nicht blockierten SIRPα-Gruppe war nicht signifikant unterschiedlich (p = 0,010, Zusatzdatei). 3: Abb. S4). Der durch gefrorenes Zelllysat und CFS induzierte Unterschied in der RAW264.7-Polarisation war statistisch nicht signifikant (Zusatzdatei 3: Abb. S5). Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei primären Milzmakrophagen der Maus beobachtet. CFS veränderte den Anteil von M1 oder M2 nicht signifikant, während der Anteil von M1 und M2 in primären Makrophagen nach der Lysatbehandlung signifikant anstieg (p < 0,0001). Obwohl gefrorenes Zelllysat auch den Anteil von M1 erhöhte, spiegelte sich dies eher im Anteil von M2 wider (Zusatzdatei 3: Abb. S6). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Lysate die Makrophagen effektiv dazu anregten, sich in Richtung des M1-Phänotyps, nicht aber des M2-Phänotyps zu polarisieren. Um den Zusammenhang zwischen Makrophagenpolarisierung und Phagozytose aufzudecken, wurde ein Zelltötungstest durchgeführt. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der CFS- und der unbehandelten Gruppe. Lysatpolarisierte M1-Makrophagen hatten im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen eine signifikante Abtötungswirkung, und die Wirkung wurde durch einen Anstieg des Verhältnisses von Effektorzellen zu Zielzellen (E:T) verstärkt (Abb. 1F).

Um die Veränderungen in Makrophagen mit der Polarisation zu untersuchen, wurde eine RNA-Sequenzierung an verschiedenen RAW264.7-Behandlungsgruppen durchgeführt. Unabhängig davon, ob CT26-Lysate mit überstehenden oder unbehandelten RAW264.7-Zellen verglichen wurden, zeigte die GO-Analyse, dass die Lysate die Aktivität antiviraler Signalwege in RAW264.7-Zellen aktivierten, einschließlich der Reaktion auf das Virus, der Regulierung des Virusprozesses, der Regulierung der angeborenen Immunantwort usw Reaktion auf Interferon-beta (Abb. 2A und B). Die KEGG-Analyse zeigte die gleichen Signalveränderungen wie die Lysatbehandlung (Abb. 2C und D). Darüber hinaus zeigte GSEA, dass Interferon-bezogene Signalwege nach der Lysatbehandlung hochreguliert und Zellproliferations-bezogene Signalwege herunterreguliert wurden (Abb. 2E). Verglichen mit der Überstandsgruppe ist die Expression von M1-Markern (Il23a, Il6, Nfkb1, Cd80, Il27, Ccl5, Cd86, Il21r, Il33, Ccl6, Cxcl10, Il7, Cxcl11, Il18, Ccl7, Tlr4 und Ccl2) im Lysat Die Behandlungsgruppe war hochreguliert und die Expression von M2-Markern (Stat3, Mr1 und Ncan) war herunterreguliert (Abb. 2F und G). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Lysatbehandlung wirksam die Polarisierung von M1-Makrophagen induzieren, die Funktion von M1-Makrophagen aktivieren und antivirale und antitumorale Immunantworten aktivieren könnte.

Die RNA-Sequenzierung von mit Lysat behandelten, CFS-behandelten und unbehandelten Gruppen charakterisierte die Funktion von Raw264.7. Eine GO-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene von RAW264.7-Zellen, die mit Lysat und CFS behandelt wurden. B GO-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene von mit Lysat behandelten RAW264.7-Zellen und unbehandelten RAW264.7-Zellen. C KEGG-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene von RAW264.7-Zellen, die mit Lysat und CFS behandelt wurden. D KEGG-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene von mit Lysat behandelten RAW264.7-Zellen und unbehandelten RAW264.7-Zellen. E GSEA von differentiell exprimierten Genen von RAW264.7-Zellen, die mit Lysat und CFS behandelt wurden. F Die Expression von M1-Makrophagen-Markern in RAW264.7-Zellen, die mit Lysat und CFS behandelt wurden. G Die Expression von M2-Makrophagen-Markern in RAW264.7-Zellen, die mit Lysat und CFS behandelt wurden. Die Farbe stellt den Wert des Expressionsniveaus des Gens bei der RNA-Sequenzierung dar

Wir untersuchten den Zusammenhang zwischen OH2-Behandlung und Makrophagenfunktion in vivo, wie in Abb. 3A dargestellt. Basierend auf früheren Untersuchungen [16] haben wir gezeigt, dass die OH2-Therapie die Infiltration von adaptiven Immunzellen (T-Zellen) und angeborenen Immunzellen (Makrophagen, DCs und NK-Zellen) fördert (Abb. 3B).

Die OH2-Behandlung polarisierte Makrophagen auf den M1-Phänotyp für die Tumorabtötung in vivo. A Der Behandlungsprozess und der Experimentzeitplan des CL-Tiermodells. B Die Ergebnisse der Immunzellinfiltrationsanalyse der OH2-Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe durch GSVA. C Die Tumorwachstumskurve der OH2-kombinierten CL-Gruppe (rot), der OH2-Gruppe (OH2 mit Kontrollliposomen) (blau) und der Kontrollgruppe (schwarz). Das rote Kästchen wurde vergrößert (rechts), um die OH2-kombinierte CL-Gruppe und die OH2-Gruppe anzuzeigen. An den experimentellen Daten wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. n=10 Mäuse/Gruppe, ****, P<0,0001. D Die Überlebenskurve der OH2-kombinierten CL-Gruppe (rot), der OH2-Gruppe (blau) und der Kontrollgruppe (schwarz). Für die Überlebenskurvendaten wurden die Kaplan-Meier-Methode und der Log-Rank-Test verwendet. ns, keine signifikanten Unterschiede. E Repräsentative M-IHC-Ergebnisse der OH2-Gruppe (links) und der OH2-kombinierten CL-Gruppe (rechts). F4/80, grün, CD86, lila und CD206, gelb. Maßstabsbalken, 100 μm. F M-IHC-Quantifizierungsergebnisse für den M1-Subtyp. n=3 Proben/Gruppe. Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz des Unterschieds zwischen den beiden Gruppen zu analysieren. ***, p<0,001. G M-IHC-Quantifizierungsergebnisse für den M2-Subtyp. n=3 Proben/Gruppe. Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz des Unterschieds zwischen den beiden Gruppen zu analysieren. **, p<0,01. H Repräsentative IHC-Färbung für CD86 (links), CD206 (Mitte) und F4/80 (rechts) in der OH2- (oben) und OH2-kombinierten CL-Gruppe (unten). Originalvergrößerung, ×200. n=5 Proben/Gruppe. (Der Prozentsatz stellt den Anteil der M1/M2-Makrophagen an der Gesamtzahl der Zellen dar). I. Quantitative Ergebnisse der CD86-Färbung in der OH2-kombinierten CL- und OH2-Gruppe. J Quantitative Ergebnisse der CD206-Färbung in der OH2-kombinierten CL- und OH2-Gruppe. K Quantitative Ergebnisse der F4/80-Färbung in der OH2-kombinierten CL- und OH2-Gruppe. n=3 Proben/Gruppe. Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz des Unterschieds zwischen den beiden Gruppen zu analysieren. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001

Makrophagen in CT26-tragenden Mäusen wurden einen Tag vor der Behandlung mit Clodronat-Liposomen (CLs) beseitigt. Zuerst überprüften wir die Clearance-Effizienz und stellten fest, dass sie innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion mehr als 90 % erreichte, sich dann erholte und 72 Stunden später höher als der Wert vor der Injektion war (Zusatzdatei 3: Abb. S7). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Verwendung von CL allein vorhandene Makrophagen wirksam entfernen kann, ohne die Bildung neuer Makrophagen zu beeinträchtigen.

Wie in Abb. 3C gezeigt, zeigten sowohl die OH2-Therapie als auch die CL in Kombination mit der OH2-Therapie eine starke Tumorhemmung. Tatsächlich zeigte die Kombinationstherapie eine frühere Tumorsuppression und eine signifikantere therapeutische Wirkung (p<0,0001) (Abb. 3C). Es gab jedoch keinen Unterschied im Überleben zwischen den beiden Gruppen und alle Tumoren in der kombinierten Gruppe und der OH2-Gruppe bildeten sich letztendlich zurück (Abb. 3D). Das Rechallenge-Experiment zeigte, dass die Tumorbildungsrate der kombinierten Gruppe signifikant niedriger war als die der OV-Gruppe (p = 0,029), obwohl die Tumoren schließlich zurückkehrten (Zusatzdatei 3: Abb. S8). Dies impliziert, dass Makrophagen möglicherweise eine Rolle bei der Behandlungswirkung von OH2 spielen.

Die quantitative Analyse mittels Mehrfarben-Immunhistochemie (M-IHC) zeigte, dass die kombinierte Verwendung von CL und OH2 einen Anstieg der M1-Makrophagen (p=0,0004) in der Tumorimmunmikroumgebung förderte, begleitet von einem Rückgang der M2-Makrophagen (p=0,0011) im Vergleich zu OH2 allein (Abb. 3E – G, Zusatzdatei 3: Abb. S9). Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, dass der M1-Makrophagenmarker in Tumorgeweben stark exprimiert wurde und der M2-Makrophagenmarker in der Kombinationstherapiegruppe nur in geringen Mengen exprimiert wurde (Abb. 3H–K). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die OH2-Therapie die Polarisierung von M1-Makrophagen induzieren und in vivo an der Antitumor-Immunantwort beteiligt sein kann.

Um die Machbarkeit von OH2 in Kombination mit einer Makrophagentherapie weiter zu untersuchen, wurde ein Anti-SIRPα-Antikörper verwendet, der die CD47-SIRPα-Achse in Makrophagen blockiert. Zunächst haben wir die Expression von CD47 und SIRPα in Zelllinien nachgewiesen. Wie in Abb. 4A gezeigt, wurde CD47 in den meisten Zelllinien weit verbreitet exprimiert, während die SIRPα-Expression zelllinienspezifisch war. Das Expressionsniveau von SIRPα auf Makrophagen in der Milz von Mäusen wurde in der Zusatzdatei 3: Abb. S10 gezeigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass wir die blockierende Wirkung von CD47 auf die Makrophagen-Phagozytose mit einem Anti-SIRPα-Antikörper beseitigen könnten.

Die Kombination aus OH2- und Anti-SIRPα-Therapie verstärkt die Immunantwort gegen Krebs in vivo. A Die Expressionsniveaus von CD47 und SIRPα in CT26-, MC38- und 4T-1-Zelllinien wurden mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. B Der Behandlungsprozess und der experimentelle Zeitplan für eine angepasste kombinierte Behandlung. C Die Tumorwachstumskurve verschiedener Behandlungsgruppen tumortragender Mäuse mit größeren Tumorvolumina bei der Erstbehandlung. Das rote Kästchen wurde vergrößert, um die OH2-kombinierte Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, den OH2-kombinierten Isotyp und die OH2-Gruppe anzuzeigen. An den experimentellen Daten wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. n=10 Mäuse/Gruppe. *, p=0,019. D Die Überlebenskurve verschiedener Behandlungsgruppen tumortragender Mäuse mit größeren Tumorvolumina bei der Erstbehandlung. Für die Überlebenskurvendaten wurden die Kaplan-Meier-Methode und der Log-Rank-Test verwendet. *, p=0,041. E Die Tumorwachstumskurve der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. An den experimentellen Daten wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. n=6 Mäuse/Gruppe. *; **. F Die Überlebenskurve der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. Für die Überlebenskurvendaten wurden die Kaplan-Meier-Methode und der Log-Rank-Test verwendet. *, p=0,0183. G Der Behandlungsprozess und der experimentelle Zeitplan für die kombinierte Behandlung. H Die Tumorwachstumskurve der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, des OH2-kombinierten Isotyps und der Kontrollgruppe. An den experimentellen Daten wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. n=7 Mäuse/Gruppe. *, p=0,029; **, P=0,0041; ***, p=0,0003. I Die Überlebenskurve der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, des OH2-kombinierten Isotyps und der Kontrollgruppe. Für die Überlebenskurvendaten wurden die Kaplan-Meier-Methode und der Log-Rank-Test verwendet. *, p=0,03 und p=0,018; **, P=0,0014

Es wurde ein In-vivo-Test durchgeführt. Wenn das CT26-Tumorvolumen zu Beginn der Behandlung klein war (45,315 ± 4,403 mm3), unterschieden sich Tumorvolumen und Überleben zwischen der kombinierten Behandlungsgruppe und der OH2-Behandlungsgruppe nicht signifikant (p = 0,4712) (Zusatzdatei 3: Abb. S11). Ob als Einzel- oder Kombinationsbehandlung, OH2 könnte eine hervorragende Antitumorwirkung entfalten und der Tumor würde sich schließlich vollständig zurückbilden. Anschließend haben wir das In-vivo-Experiment angepasst (Abb. 4B). Wir begannen die Behandlung am 14. Tag, als der Tumor größer war (281,596 ± 31,469 mm3) und ein Unterschied in der Wirksamkeit zwischen der OV-Behandlungsgruppe und der kombinierten Behandlungsgruppe auftrat (Abb. 4C). Im Vergleich zu den anderen Gruppen bildeten sich die Tumoren in der kombinierten Behandlungsgruppe schneller zurück. Darüber hinaus hatten Mäuse in der Kombinationsgruppe eine höhere Überlebensrate (P = 0,041) als Mäuse in den Gruppen OH2 und OH2+iIsotyp (Abb. 4D). Auch die Zahl der Mäuse, die eine Tumorregression erreichten, war am größten. Im Vergleich zur Kontrollgruppe konnten beide Gruppen mit OH2 das Tumorwachstum wirksam hemmen und das Überleben der Mäuse verlängern (Abb. 4E, F). Der Anti-SIRPα-Antikörper allein hemmte jedoch weder das Tumorwachstum (P > 0,05, Abb. 4E) noch verlängerte er die Überlebenszeit tumortragender Mäuse (P > 0,05, Abb. 4F).

Wir haben auch den Immunausschluss in 4T-1-Mausmodellen überprüft (Abb. 4G). Wie in Abb. 4H gezeigt, zeigte die Kombinationsgruppe eine starke Antitumorwirkung, die sich deutlich von der OH2-Gruppe (p=0,0041) und der Kontrollgruppe (p=0,003) unterschied. Darüber hinaus hatten Mäuse in der Kombinationsgruppe eine bessere Überlebensrate als Mäuse in der OH2- (p = 0,03) und Kontrollgruppe (p = 0,0014) (Abb. 4I). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anti-SIRPα-Antikörper die Wirksamkeit der OH2-Therapie steigerten.

Anschließend führten wir eine pathologische Analyse des Tumorgewebes der Mäuse durch. Die pathologischen Ergebnisse zeigten, dass in der Tumormikroumgebung von Mäusen, die keine Behandlung erhielten, der Anteil der M2-Makrophagen viel höher war als der der M1-Makrophagen (Abb. 5A, Zusatzdatei 3: Abb. S12). Die Behandlung mit OH2 reduzierte die Infiltration von M2-Makrophagen (p<0,001) und erhöhte die Infiltration von NK-Zellen (p<0,05) in die Tumormikroumgebung bis zu einem gewissen Grad (Abb. 5B und C). Die kombinierte Verwendung von Anti-SIRPα-Antikörpern und OH2 führte zu einer erhöhten Infiltration von CD8-T-Zellen (p<0,01) und M1-Makrophagen (p<0,001) in die Tumormikroumgebung (Abb. 5D und E). Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, dass die Immunzellen der kombinierten Behandlungsgruppe im zentralen Teil des Tumors konzentriert waren (Abb. 5F, G und Zusatzdatei 3: Abb. S13). Dies implizierte, dass die Fähigkeit dieser tumorhemmenden Immunzellen, in das Zentrum des Tumors zu wandern, verbessert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Kombinationstherapie eine stärkere Antitumor-Immunantwort auslösen kann als eine alleinige Behandlung.

M-IHC- und IHC-Färbung des Anti-SIRPα-Antikörper-Behandlungsmodells. Repräsentative M-IHC-Ergebnisse der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, des OH2-kombinierten Isotyps, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe mit größerem Tumorvolumen während der Erstbehandlung. CD8, grün, CD16, himmelblau, F4/80, lila, CD86, orange und CD206, rot. Maßstabsbalken, 100 μm. B Quantitative Ergebnisse der NK-Zellfärbung (CD16) in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, dem OH2-kombinierten Isotyp, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. n=3 Proben/Gruppe. C Quantitatives Ergebnis der M2-Makrophagen-Färbung (F4/80+CD206+) in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, dem OH2-kombinierten Isotyp, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. n=3 Proben/Gruppe. D Quantitative Ergebnisse der M1-Makrophagen-Färbung (F4/80+CD86+) in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, dem OH2-kombinierten Isotyp, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. n=3 Proben/Gruppe. E Quantitative Ergebnisse der CD8-T-Zellfärbung in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, dem OH2-kombinierten Isotyp, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. n=3 Proben/Gruppe. F Repräsentative IHC-Färbung für CD8, CD16, F4/80, CD86 und CD206 der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der OH2-kombinierten Isotypgruppe, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe mit größeren Tumorvolumina bei der Erstbehandlung. Originalvergrößerung, ×200. n=5 Proben/Gruppe. G Quantitative Ergebnisse der CD8-, CD16-, F4/80-, CD86- und CD206-Färbung in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, dem OH2-kombinierten Isotyp, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe. n=5 Proben/Gruppe. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001 (Proportion stellt den Prozentsatz der Zelle an der Gesamtzahl der Zellen dar)

Wir verwendeten RNA-Sequenzierung und Einzel-RNA-Sequenzierung, um das TME detaillierter zu charakterisieren. Die OH2-Behandlung allein kann die Infiltration von adaptiven Immunzellen (T-Zellen und Th1-Zellen) und angeborenen Immunzellen (Makrophagen und DCs) in die Immunmikroumgebung des Tumors fördern (Abb. 6A). In der Kombinationstherapiegruppe waren die Makrophagenwerte viel höher. Obwohl es keinen signifikanten Unterschied gab, wurden DCs, CD8+ und Zytotoxizität durch die Kombination im Vergleich zur alleinigen OH2-Behandlung verbessert (Abb. 6B). Wenn Anti-SIRPα und OH2 kombiniert wurden, förderten sie die Infiltration von Immunzellen in Tumorgewebe, insbesondere Makrophagen, DCs, T-Zellen und NK-Zellen. Immunzellen wurden global aktiviert, wodurch eine Antitumor-Tumor-Mikroumgebung entstand (Abb. 6C). Durch die Infiltration von Immunzellen wurde das Antigenpräsentationssignal in den Tumoren der kombinierten Behandlungsgruppe verstärkt und die Abtötungsfunktion der Immunzellen verstärkt (Abb. 6D und Zusatzdatei 3: Abb. S14). Allerdings nahm die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen ab und die Apoptose nahm zu (Abb. 6C, Zusatzdatei 3: Abb. S15). Die GO-Analyse zeigte, dass die Leukozytenmigration und Chemotaxis in der kombinierten Behandlungsgruppe verstärkt waren, was mit den IHC-Ergebnissen übereinstimmt (Abb. 6E und F). Die verbesserte Migrationsfähigkeit und funktionelle Aktivierung von Immunzellen in Tumorgeweben sowie die vollständige Aktivierung von M1-bezogenen Zytokinen, T-Zell-bezogenen Zytokinen und NK-bezogenen Zytokinen förderten die Eliminierung von Tumorzellen (Abb. 6G – I). ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Kombinationstherapie die TME tiefgreifender umgestalten und stärkere angeborene und adaptive Immunantworten aktivieren kann.

Die Tumorimmun-Mikroumgebung wurde durch RNA-Sequenzierungsergebnisse von Tumorgeweben in verschiedenen Behandlungsgruppen aufgedeckt. A Die Ergebnisse der Immunzellinfiltrationsanalyse von Tumorgeweben aus der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe durch GSVA. B Die Bewertungsergebnisse von Immunzellen (Makrophagen, DCs, Th1-Zellen, Th2-Zellen, T-Zellen, CD8-T-Zellen, NK-CD56bright-Zellen und zytotoxischen Zellen) von Tumorgeweben aus der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der OH2-Gruppe und Kontrollgruppe durch GSVA. C Die immunbezogenen Signalwege von Tumorgeweben aus der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der OH2-Gruppe und der Kontrollgruppe nach GSVA. D Die Bewertungsergebnisse der immunbezogenen Signalwege (Interferon, NK-Zellaktivität, Zytotoxizität, T-Zell-Priming und -Aktivierung, Lokalisierung von Immunzellen in Tumoren, Zytokin- und Chemokinsignalisierung) von Tumorgeweben aus der Gruppe der kombinierten OH2-Anti-SIRPα-Antikörper , OH2-Gruppe und Kontrollgruppe nach GSVA. E GO-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene in der Kontrollgruppe und der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe. F GO-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene in der OH2-Gruppe und der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe. G Das Expressionsniveau von M1-bezogenen Zytokinen in der OH2-Gruppe, der OH2-Gruppe in Kombination mit Anti-SIRPα-Antikörpern und der Kontrollgruppe. H Die Expressionsniveaus von T-Zell-bezogenen Zytokinen in der OH2-Gruppe und OH2 kombiniert mit der Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und der Kontrollgruppe. I Das Expressionsniveau von NK-bezogenen Zytokinen in der OH2-Gruppe, der OH2-Gruppe in Kombination mit Anti-SIRPα-Antikörpern und der Kontrollgruppe. Zur Analyse der Signifikanz des Unterschieds zwischen den beiden Gruppen wurde ein ungepaarter Student-t-Test verwendet. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Die Farbe stellt den Wert des Expressionsniveaus des Gens bei der RNA-Sequenzierung dar. OH2 + SIRPα stellt die OH2-Gruppe in Kombination mit der Anti-SIRPα-Antikörpergruppe dar

Die Einzelzelldaten zeigten, dass Immunzellen in der Tumormikroumgebung in T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, myeloische Zellen, Mastzellen und DC-Zellen unterteilt werden können (Abb. 7A und Zusatzdatei 3: Abb. S16). Der Anteil jeder Immunzelluntergruppe ist in Abb. 7B dargestellt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe nahmen die T-Zellen, NK-Zellen und DC-Zellen in der OH2-Gruppe und der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe zu, während die myeloischen Zellen abnahmen. Im Vergleich zur Gruppe, die nur mit OH2 behandelt wurde, waren die NK- und DC-Zellen in der Kombinationsbehandlungsgruppe signifikant erhöht und die myeloischen Zellen waren signifikant verringert (Abb. 7B). Die Analyse der verschiedenen Makrophagentypen zeigte, dass (Abb. 7C) die Zahl der M1-Makrophagen in beiden mit OH2 behandelten Gruppen erhöht war, die Zunahme der M1-Makrophagen jedoch in der kombinierten Behandlungsgruppe signifikanter war (Abb. 7D). Die Gene, die zwischen der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und den beiden anderen Gruppen unterschiedlich exprimiert wurden, wurden identifiziert. Virus-Nukleinsäurefragmente, unverpackte intakte Kapsidproteine ​​oder Zellinhalte könnten als PAMPs/DAMPs an der Behandlung beteiligt sein. Die Ergebnisse der Einzelzellsequenzierungsdaten zeigten, dass Tlr2 und Tlr13 hochreguliert sind (Abb. 7E). Tlr2 und Tlr13 erkennen Viruskomponenten und aktivieren Toll-like-Rezeptor (TLR)-abhängige Signalwege [22, 23], und die Funktion von Immunzellen wurde stark aktiviert (Abb. 7F).

Die durch Einzel-RNA-Sequenzierung aufgedeckte Tumorimmun-Mikroumgebung führt zu Tumorgeweben in verschiedenen Behandlungsgruppen. Eine Clusterbildung von Immunzellen in Einzelzelldaten. B Anteile verschiedener Untergruppen von Immunzellen in Einzelzelldaten. C Clustering von Makrophagen in Einzelzelldaten. D Anteile verschiedener Untergruppen von Makrophagen in Einzelzelldaten. E Volcano-Diagramm, das Toll-like-Rezeptoren in unterschiedlich exprimierten Genen in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe zeigt. F GO-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe

Um die tumorspezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Reaktion auf die Behandlung zu verifizieren, wurden die aus verschiedenen Behandlungsgruppen (Kontrolle, Anti-SIRPα, OH2 und OH2+ Anti-SIRPα) isolierten Milzlymphozyten zusammen mit CT26-Zellen in vitro am Zielort kultiviert Zell/Effektorzelle (T:E)-Verhältnisse von 1:100, 1:50 und 1:25. Lymphozyten sowohl aus der OH2-Gruppe als auch aus der OH2+-Anti-SIRPα-Gruppe zeigten eine hochspezifische CTL-Reaktion gegen CT26-Zellen (p<0,001). Die CTL-Reaktion von OH2 in Kombination mit Anti-SIRPα-Antikörper war intensiver als die von OH2 allein (p<0,05). Mit dem Anti-SIRPα-Antikörper allein wurde jedoch keine CTL-Reaktion festgestellt (Zusatzdatei 3: Abb. S17A). ELISA wurde verwendet, um den Überstand kokultivierter Zellen nachzuweisen, und wir fanden heraus, dass die Expression von TNF-α, Granzyme B und IFN-γ in der OH2-Gruppe und der OH2+anti-SIRPα-Gruppe signifikant induziert werden konnte (p<0,0001). , Zusatzdatei 3: Abb. S17B). Insgesamt waren die T-Zell-Effektorzytokine in der OH2+anti-SIRPα-Gruppe etwas höher als in der OH2-Gruppe, obwohl es keinen statistischen Unterschied gab. Außerdem wurden mit dem Anti-SIRPα-Antikörper allein keine T-Zell-Effektorzytokine nachgewiesen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Kombinationstherapie auch die tumorspezifischen CTLs verbessern kann.

Wir berichten über die Wirksamkeit sowie die molekularen und immunologischen Wirkungen einer Kombinationstherapie mit onkolytischem Herpes-simplex-Virus und Anti-SIRPα in einem Mausmodell in vitro und in vivo (Abb. 8). Wir haben gezeigt, dass durch Tumorzelllysat induziertes OH2 die Differenzierung von Maus-RAW264.7-Makrophagen in Richtung des M1-Phänotyps effektiv aktivieren und induzieren kann, wodurch ihre Phagozytose verstärkt und die Wirkung auf Tumorzellen in vitro abgetötet wird. Wir haben beobachtet, dass die Kombination von OH2 und Anti-SIRPα, die die CD47-SIRPα-Achse blockiert, die therapeutische Wirkung wirksam verstärken kann, indem sie die angeborene Immunwirkung von Makrophagen verstärkt. Die Kombination von OH2 und Anti-SIRPα zeigte auch eine stärkere Regulierung der Tumorimmunmikroumgebung.

Die OH2-Behandlung polarisierte Makrophagen zu M1, um den Tumor in vivo abzutöten, und der SIRPα-Antikörper in Kombination mit der OH2-Therapie formt das TME um und aktiviert eine umfassendere Anti-Tumor-Immunantwort. Die Einführung des SIRPα-Antikörpers kann die zelluläre Rekonstitution von TME beschleunigen und durch eine frühere angeborene Immunantwort eine spezifische Antitumor-Immunantwort induzieren

In den letzten Jahren galten OVs als vielversprechende neue Strategie zur Krebsbehandlung. Im Vergleich zu chirurgischer Therapie, Radiochemotherapie und gezielter Therapie haben OVs eine hohe Abtötungsfähigkeit, präzise Zielfähigkeit und wenige Nebenwirkungen oder Arzneimittelresistenzen gezeigt [9, 24, 25]. OVs können genetisch verändert werden, um ihre Fähigkeit zur Tumorbekämpfung zu verbessern, ihre Sicherheit zu erhöhen und ihre Antitumorwirksamkeit zu erhöhen [26, 27]. Mehr als 40 OV-Typen werden derzeit in klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Tumoren evaluiert, die meisten davon befinden sich in Phase-I-Studien [24], aber nur T-VEC ist erfolgreich in klinische Phase-III-Studien eingetreten und hat die Marktzulassung erhalten [28] .

Das in der aktuellen Studie verwendete OH2 zeigte in einer aktuellen Studie eine gute intratumorale Injektionstoleranz und anhaltende Antitumoraktivität bei Patienten mit metastasiertem Speiseröhren- und Rektumkarzinom [29]. Obwohl zahlreiche klinische Studien positive Ergebnisse mit OVs gezeigt haben, ist ihre Wirksamkeit als Monotherapeutika begrenzt [6, 30, 31]. Daher ist die Kombinationstherapie eine der Strategien zur Verstärkung der therapeutischen Wirkung von OVs [32, 33].

Der Mechanismus, durch den OV Tumore abtötet, umfasst die Infektion und Replikation in Tumorzellen, was zur Lyse oder Apoptose der Tumorzellen führt. Ein wichtigerer Mechanismus besteht darin, dass die abgetöteten Tumorzellen tumorbezogene Antigene freisetzen, um eine verstärkte tumorspezifische Immunantwort zu erreichen [34]. Da eine OV-Therapie eine adaptive Antitumor-Immunantwort auslösen kann, könnte eine Kombination aus Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) und OVs potenziellen klinischen Wert haben. Einige Studien haben gezeigt, dass OV in Kombination mit CTLA-4-Inhibitoren oder PD-1-Inhibitoren die Antitumorreaktion verbessert und das Überleben der Patienten deutlich verbessert, sowohl in präklinischen Studien als auch in klinischen Studien [2, 35,36,37,38]. Derzeit laufen 19 klinische Studien zur ICI- und OV-Kombinationstherapie, was zeigt, dass die Kombinationstherapie zu einem der Hotspots der klinischen Behandlungsoptionen für OV geworden ist [39].

Die bestehende Kombinationstherapie konzentriert sich jedoch mehr auf die adaptive Immunantwort und weniger auf die angeborene Immunität. Wenn OVs Tumorzellen lysieren, setzen sie viele Zytokine, Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) und schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) frei, die angeborene Immunantworten aktivieren. Unsere Daten zeigten, dass das Lysat von OH2 nach der Infektion mit Tumorzellen die Aktivierung der Maus-Makrophagenlinie RAW264.7 und die M1-ähnliche Polarisation in vitro wirksam stimulieren kann. Obwohl die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung zeigten, dass RAW264.7-Zellen eine starke antivirale Immunantwort hatten, zeigten M1-ähnliche polarisierte RAW264.7-Zellen in nachfolgenden Experimenten auch eine signifikante tumorspezifische Abtötungsfähigkeit. Saha et al. [40] zeigten, dass ICI in Kombination mit OV das Überleben eines Mausgliommodells geringfügig verlängerte, was mit Makrophageneinstrom und M1-ähnlicher Polarisation verbunden war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass OV in Kombination mit angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen ebenfalls einen potenziellen Anwendungswert hat.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass die CD47-SIRPα-Achse ein phagozytischer Kontrollpunkt ist, der Makrophagen und andere angeborene Immunzellen reguliert, und dass sich eine Reihe von Molekülen, die die CD47-SIRPα-Achse blockieren, für die Tumortherapie in der klinischen Entwicklung befinden [13, 41]. Einige Forschungsgruppen haben oHSV1 entwickelt, das einen CD47-Antikörper voller Länge exprimiert, der in Mausmodellen für metastasierten Eierstockkrebs und Glioblastom eine gute therapeutische Wirksamkeit erzielt hat [42, 43]. Yao et al. [44] berichteten über die Antitumorwirkung eines neuartigen onkolytischen Adenovirus, das das SIRPα-IgG1-Fc-Fusionsgen enthält, bei CD47-positivem Krebs. Da CD47 in normalen Geweben häufig in hohen Konzentrationen exprimiert wird, ist eine spezifische Ansteuerung von Tumorzellen über CD47 fraglich [45]. SIRPα wird in Knochenmarkszellen wie Makrophagen und DCs stark exprimiert, in anderen Immunzellen jedoch in geringen Mengen. Daher könnte SIRPα ein idealeres Ziel für die CD47-SIRPα-Achse sein [45, 46]. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass eine onkolytische Virustherapie Makrophagen in vivo effektiv rekrutieren und aktivieren und eine M1-ähnliche Polarisation induzieren kann, was die Machbarkeit der Blockierung von OVs in Kombination mit der Blockierung der CD47-SIRPα-Achse demonstriert. Die Kombination von OH2- und Anti-SIRPα-Antikörpern hatte einen signifikanten Einfluss auf die Behandlung des Maus-Darmkrebs-CT-26-Modells. Interessanterweise stellten wir fest, dass die Kombinationstherapie bei Mäusen mit größeren anfänglichen Tumorvolumina wirksamer war. Dies kann auf die Anzahl infiltrierter Monozyten in der Tumormikroumgebung mit zunehmender Tumorgröße zurückzuführen sein, und die Behandlung mit dem onkolytischen Virus veränderte die Tumormikroumgebung von „kalt“ zu „heiß“, wodurch die Bildung häufiger vorkommender M1-ähnlicher Makrophagen induziert wurde. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass die therapeutische Wirkung durch die Optimierung unterschiedlicher Dosierungszeiten der Kombinationstherapie weiter verbessert werden kann.

Mit einem besseren Verständnis der Immunmikroumgebung des Tumors wird eine auf Makrophagen basierende Immuntherapie zur Realität [47]. Makrophagen sind wichtige Regulatoren vieler Aspekte des TME und können tumorspezifische Immunantworten direkt oder durch unspezifische Effekte auf T- und B-Zellfunktionen aktivieren [12, 48, 49]. Wir beobachteten auch, dass entweder die OV-Therapie allein oder in Kombination mit dem SIRPα-Antikörper eine große Anzahl von NK-Zellen und Monozyten rekrutierte, um angeborene Immunantworten auszulösen, was mit den Erkenntnissen von Ramelyte et al. übereinstimmt. [50]. Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Begrenzung der HSV-Infektion [51, 52], und die Ergebnisse der Einzelzellsequenzierung zeigten eine Aktivierung der TLR-Signalwege, die an der Kombinationstherapiegruppe beteiligt waren. Wir beobachteten, dass die Kombinationstherapie im Vergleich zur alleinigen Behandlung keine signifikante antivirale Reaktion hervorrief, allerdings ist es wahrscheinlicher, dass Makrophagen den gesamten Immunzustand aktivieren. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombinationstherapie eine spezifischere Abtötung von Tumorzellen induziert. Die Merkmale der Kombinationstherapie auf zellulärer und molekularer Ebene basieren auf der schnellen Rekonstruktion der Immunumgebung innerhalb des TME und der umfassenden und kontinuierlichen Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunität. Die Wirksamkeit der Kombinationstherapie beruht auf mehreren Immunsynergien und nicht nur auf einer Art von Immunzellen. Makrophagen können bei der frühen Antigenpräsentation und einer erweiterten Immunantwort eine Rolle spielen.

Zusammenfassend belegen unsere Daten die Machbarkeit einer onkolytischen Virustherapie in Kombination mit einem Anti-SIRPα-Antikörper. Die Einführung des Anti-SIRPα-Antikörpers kann die zelluläre Rekonstitution des TME beschleunigen und durch eine frühere angeborene Immunantwort eine spezifische Antitumor-Immunantwort induzieren. Unsere Studie schlägt eine neue Strategie für die onkolytische Virustherapie vor.

Die mit dieser Studie verbundenen Daten sind im Papier oder in den ergänzenden Materialien enthalten. Die RNA-seq-Daten sind auf begründete Anfrage auch bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Signalregulierendes Protein-Alpha

Onkolytisches Herpes-simplex-Virus 2

Onkolytisches Virus

RNA-Sequenzierung

Mikroumgebung des Tumors

Blockade des Immun-Checkpoints

Immunogener Zelltod

Schadensassoziierte molekulare Muster

Pathogen-assoziierte molekulare Muster

Zellfreier Überstand

Zellzählset-8

Gen-Ontologie

Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome

Analyse der Gen-Set-Anreicherung

Clodronat-Liposomen

Mehrfarbige immunhistochemische Untersuchung

Immunhistochemisch

Frei von spezifischen Krankheitserregern

Tollartiger Rezeptor

Zytotoxischer T-Lymphozyten

Martinez-Quintanilla J, Seah I, Chua M, Shah K. Onkolytische Viren: Überwindung translationaler Herausforderungen. J Clin Invest. 2019;129(4):1407–18.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ribas A, Dummer R, Puzanov I, VanderWalde A, Andtbacka RHI, Michielin O, et al. Die onkolytische Virotherapie fördert die intratumorale T-Zell-Infiltration und verbessert die Anti-PD-1-Immuntherapie. Zelle. 2017;170(6):1109–1119.e10.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, Bell JC. Mit Krebsimmuntherapie viral gehen. Nat Rev Krebs. 2014;14(8):559–67.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Kroemer G, Galluzzi L, Kepp O, Zitvogel L. Immunogener Zelltod in der Krebstherapie. Annu Rev Immunol. 2013;31:51–72.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Fukuhara H, Ino Y, Todo T. Onkolytische Virustherapie: Eine neue Ära der Krebsbehandlung im Morgengrauen. Krebswissenschaft. 2016;107(10):1373–9.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Harrington K, Freeman DJ, Kelly B, Harper J, Soria JC. Optimierung der onkolytischen Virotherapie in der Krebsbehandlung. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(9):689–706.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Gujar S, Pol JG, Kroemer G. Aufheizen: Onkolytische Viren machen Tumore „heiß“ und für Checkpoint-Blockade-Immuntherapien geeignet. Onkoimmunologie. 2018;7(8):e1442169.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi T, Song X, Wang Y, Liu F, Wei J. Kombination onkolytischer Viren mit Krebsimmuntherapie: Etablierung einer neuen Generation der Krebsbehandlung. Frontimmunol. 2020;11:683.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Cook M, Chauhan A. Klinische Anwendung onkolytischer Viren: Eine systematische Übersicht. Int J Mol Sci. 2020;21(20):7505.

Artikel PubMed Central CAS Google Scholar

van Vloten JP, Workenhe ST, Wootton SK, Mossman KL, Bridle BW. Kritische Wechselwirkungen zwischen dem Absterben immunogener Krebszellen, onkolytischen Viren und dem Immunsystem bestimmen das rationale Design kombinierter Immuntherapien. J Immunol. 2018;200(2):450–8.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Locati M, Curtale G, Mantovani A. Vielfalt, Mechanismen und Bedeutung der Makrophagenplastizität. Annu Rev Pathol. 2020;15:123–47.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Anderson NR, Minutolo NG, Gill S, Klichinsky M. Makrophagenbasierte Ansätze für die Krebsimmuntherapie. Krebs Res. 2021;81(5):1201–8.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Logtenberg MEW, Scheeren FA, Schumacher TN. Der CD47-SIRPα-Immun-Checkpoint. Immunität. 2020;52(5):742–52.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ni H, Cao L, Wu Z, Wang L, Zhou S, Guo X, et al. Kombinierte Strategien für eine wirksame Krebsimmuntherapie mit einem neuartigen monoklonalen Anti-CD47-Antikörper. Krebsimmunol Immunother. 2022;71(2):353–63.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Liu J, Xavy S, Mihardja S, Chen S, Sompalli K, Feng D, et al. Zielgerichteter Makrophagen-Checkpoint-Inhibitor SIRPα zur Krebstherapie. JCI Insight. 2020;5(12):e134728.

Artikel PubMed Central Google Scholar

Zhang W, Hu X, Liang J, Zhu Y, Zeng B, Feng L, et al. oHSV2 kann das murine Dickdarmkarzinom bekämpfen, indem es den Immunstatus der Tumormikroumgebung verändert und eine Antitumorimmunität induziert. Mol Ther Onkolytika. 2020;16:158–71.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zhang W, Zeng B, Hu X, Zou L, Liang J, Song Y, et al. Das onkolytische Herpes-simplex-Virus Typ 2 kann die Lebermetastasierung von Darmkrebs wirksam hemmen, indem es den Immunstatus in der Tumormikroumgebung moduliert und eine spezifische Antitumorimmunität induziert. Hum Gene Ther. 2021;32(3-4):203–15.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Zhao Q, Zhang W, Ning Z, Zhuang X, Lu H, Liang J, et al. Ein neuartiges onkolytisches Herpes-simplex-Virus Typ 2 weist eine starke Antitumoraktivität auf. Plus eins. 2014;9(3):e93103.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Wang Y, Zhou X, Wu Z, Hu H, Jin J, Hu Y, et al. Präklinische Sicherheitsbewertung des onkolytischen Herpes-simplex-Virus Typ 2. Hum Gene Ther. 2019;30(5):651–60.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Russell-Goldman E, Hornick JL, Qian X, Jo VY. NKX2.2-Immunhistochemie bei der Unterscheidung des Ewing-Sarkoms von zytomorphologischen Mimetika: Diagnostischer Nutzen und Fallstricke. Krebszytopathol. 2018;126(11):942–9.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Guo Z, Zhang X, Zhu H, Zhong N, Luo X, Zhang Y, et al. TELO2 induzierte das Fortschreiten von Darmkrebs durch Bindung an RICTOR über mTORC2. Oncol Rep. 2021;45(2):523–34.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Moresco EM, LaVine D, Beutler B. Toll-like-Rezeptoren. Curr Biol. 2011;21(13):R488–93.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Shi Z, Cai Z, Sanchez A, Zhang T, Wen S, Wang J, et al. Ein neuartiger Toll-like-Rezeptor, der das vesikuläre Stomatitis-Virus erkennt. J Biol. Chem. 2011;286(6):4517–24.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Macedo N, Miller DM, Haq R, Kaufman HL. Klinische Landschaft der onkolytischen Virusforschung im Jahr 2020. J Immunother Cancer. 2020;8(2):e001486.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bhatt DK, Wekema L, Carvalho Barros LR, Chammas R, Daemen T. Eine systematische Analyse der klinischen Sicherheit und Wirksamkeit der Onkovirotherapie. Mol Ther Onkolytika. 2021;23:239–53.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hemminki O, Dos Santos JM, Hemminki A. Onkolytische Viren für die Krebsimmuntherapie. J Hämatol Oncol. 2020;13(1):84.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lan Q, Xia S, Wang Q, Xu W, Huang H, Jiang S, et al. Entwicklung der onkolytischen Virotherapie: von der genetischen Veränderung zur Kombinationstherapie. Front Med. 2020;14(2):160–84.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Andtbacka RH, Kaufman HL, Collichio F, Amatruda T, Senzer N, Chesney J, et al. Talimogene Laherparepvec verbessert die dauerhafte Ansprechrate bei Patienten mit fortgeschrittenem Melanom. J Clin Oncol. 2015;33(25):2780–8.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Zhang B, Huang J, Tang J, Hu S, Luo S, Luo Z, et al. Intratumorales OH2, ein onkolytisches Herpes-simplex-Virus 2, bei Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren: eine multizentrische klinische Phase-I/II-Studie. J Immuner Krebs. 2021;9(4):e002224.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Aurelian L. Onkolytische Viren als Immuntherapie: Fortschritte und verbleibende Herausforderungen. Onco zielt auf Ther. 2016;9:2627–37.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ricca JM, Oseledchyk A, Walther T, Liu C, Mangarin L, Merghoub T, et al. Eine bereits bestehende Immunität gegen das onkolytische Virus verstärkt seine immuntherapeutische Wirksamkeit. Mol Ther. 2018;26(4):1008–19.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Phan M, Watson MF, Alain T, Diallo JS. Onkolytische Viren auf Medikamenten: Höhere therapeutische Wirksamkeit erreichen. ACS Infect Dis. 2018;4(10):1448–67.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Malfitano AM, Di Somma S, Iannuzzi CA, Pentimalli F, Portella G. Virotherapie: Von Einzelwirkstoffen zu kombinatorischen Behandlungen. Biochem Pharmacol. 2020;177:113986.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Kaufman HL, Kohlhapp FJ, Zloza A. Onkolytische Viren: eine neue Klasse von Immuntherapeutika. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(9):642–62.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Rajani K, Parrish C, Kottke T, Thompson J, Zaidi S, Ilett L, et al. Die Kombinationstherapie mit Reovirus und Anti-PD-1-Blockade kontrolliert das Tumorwachstum durch angeborene und adaptive Immunreaktionen. Mol Ther. 2016;24(1):166–74.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Mochizuki Y, Tazawa H, Demiya K, Kure M, Kondo H, Komatsubara T, et al. Telomerase-spezifische onkolytische Immuntherapie zur Förderung der Wirksamkeit der PD-1-Blockade bei Osteosarkomen. Krebsimmunol Immunother. 2021;70(5):1405–17.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Mahalingam D, Wilkinson GA, Eng KH, Fields P, Raber P, Moseley JL, et al. Pembrolizumab in Kombination mit dem onkolytischen Virus Pelareorep und Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Pankreas-Adenokarzinom: Eine Phase-Ib-Studie. Clin Cancer Res. 2020;26(1):71–81.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Zhu Y, Hu X, Feng L, Yang Z, Zhou L, Duan X, et al. Verbesserte therapeutische Wirksamkeit eines neuartigen onkolytischen Herpes-Simplex-Virus Typ 2, das einen Antikörper gegen den programmierten Zelltod kodiert 1. Mol Ther Onkolytika. 2019;15:201–13.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Meyers DE, Wang AA, Thirukkumaran CM, Morris DG. Aktuelle immuntherapeutische Strategien zur Verbesserung der onkolytischen Virotherapie. Front Oncol. 2017;7:114.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Makrophagenpolarisierung trägt zur Eliminierung von Glioblastomen durch kombinierte Immunvirotherapie und Immun-Checkpoint-Blockade bei. Krebszelle. 2017;32(2):253–267.e5.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Veillette A, Chen J. SIRPα-CD47 Immun-Checkpoint-Blockade in der Krebstherapie. Trends Immunol. 2018;39(3):173–84.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Tian L, Xu B, Teng KY, Song M, Zhu Z, Chen Y, et al. Bekämpfung von Fc-Rezeptor-vermittelten Effekten und dem „Don't Eat Me“-Signal mit einem onkolytischen Virus, das einen Anti-CD47-Antikörper exprimiert, zur Behandlung von metastasiertem Eierstockkrebs. Clin Cancer Res. 2022;28(1):201–14.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Xu B, Tian L, Chen J, Wang J, Ma R, Dong W, et al. Ein onkolytisches Virus, das einen Antikörper voller Länge exprimiert, verstärkt die angeborene Antitumor-Immunantwort auf Glioblastome. Nat Commun. 2021;12(1):5908.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Huang Y, Lv SQ, Liu PY, Ye ZL, Yang H, Li LF, et al. Ein SIRPα-Fc-Fusionsprotein verstärkt die Antitumorwirkung des onkolytischen Adenovirus gegen Eierstockkrebs. Mol Oncol. 2020;14(3):657–68.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zhao XW, Kuijpers TW, van den Berg TK. Reicht die gezielte Behandlung von CD47-SIRPα zur Behandlung von hämatopoetischen Malignomen aus? Blut. 2012;119(18):4333–4.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Yanagita T, Murata Y, Tanaka D, Motegi SI, Arai E, Daniwijaya EW, et al. Anti-SIRPα-Antikörper als potenzielles neues Instrument für die Krebsimmuntherapie. JCI Insight. 2017;2(1):e89140.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mills CD, Lenz LL, Harris RA. Ein Durchbruch: Makrophagen-gesteuerte Krebsimmuntherapie. Krebs Res. 2016;76(3):513–6.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Mitchem JB, Brennan DJ, Knolhoff BL, Belt BA, Zhu Y, Sanford DE, et al. Durch die gezielte Behandlung tumorinfiltrierender Makrophagen werden tumorinitiierende Zellen reduziert, die Immunsuppression gelindert und die chemotherapeutischen Reaktionen verbessert. Krebs Res. 2013;73(3):1128–41.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Ruffell B, Chang-Strachan D, Chan V, Rosenbusch A, Ho CM, Pryer N, et al. Makrophage IL-10 blockiert CD8+-T-Zell-abhängige Reaktionen auf eine Chemotherapie, indem es die IL-12-Expression in intratumoralen dendritischen Zellen unterdrückt. Krebszelle. 2014;26(5):623–37.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ramelyte E, Tastanova A, Balázs Z, Ignatova D, Turko P, Menzel U, et al. Onkolytische Virotherapie-vermittelte Antitumorreaktion: eine Einzelzellperspektive. Krebszelle. 2021;39(3):394–406.e4.

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Wu J, Dobbs N, Yang K, Yan N. Interferon-unabhängige Aktivitäten von STING bei Säugetieren vermitteln antivirale Reaktion und Tumorimmunumgehung. Immunität. 2020;53(1):115–126.e5.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Yamashiro LH, Wilson SC, Morrison HM, Karalis V, Chung JJ, Chen KJ, et al. Die Interferon-unabhängige STING-Signalübertragung fördert die Resistenz gegen HSV-1 in vivo. Nat Commun. 2020;11(1):3382.

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde von der National Science Foundation of China (Nr. 82001758) und dem Key Research and Development Program der Provinz Hubei (2020BCA062) unterstützt.

Staatliches Schlüssellabor für Molekulare Onkologie, Abteilung für Ätiologie und Karzinogenese, Nationales Krebszentrum/Nationales Klinisches Forschungszentrum für Krebs/Krebskrankenhaus, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College, Peking, 100021, China

Defeng Kong, Zhenrong Yang, Guoliang Li, Quanyou Wu, Zhaoru Gu, Duo Wan, Qi Zhang, Xiaoli Zhang, Shujun Cheng und Kaitai Zhang

Nationales „111“-Zentrum für Zellregulation und molekulare Pharmazeutik, Schlüssellabor für Fermentationstechnik (Bildungsministerium), kooperatives Innovationszentrum für industrielle Fermentation der Provinz Hubei, Hochschule für Bioingenieurwesen, Technische Universität Hubei, Wuhan, 430068, China

Binlei Liu

Abteilung für Immunologie, Nationales Krebszentrum/Nationales Klinisches Forschungszentrum für Krebs/Krebskrankenhaus, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College, Peking, 100021, China

Wen Zhang

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WZ, KTZ und DFK konzipierten die Experimente. Das DFK führte die Experimente durch. DFK, WZ und QYW führten Datenverarbeitung und statistische Analysen durch. DFK, WZ, KTZ und BLL haben das Manuskript verfasst, überprüft und/oder überarbeitet. ZRY, GLL, ZRG, SW, QZ, ZLZ und SJC leisteten administrative, technische oder materielle Unterstützung (z. B. Vorbereitung chirurgischer Instrumente für Tierversuche, Berichterstattung oder Organisation von Daten und Aufbau von Datenbanken). WZ und KTZ betreuten die Studie. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Binlei Liu, Kaitai Zhang oder Wen Zhang.

Diese Studie wurde vom National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften und dem Peking Union Medical College (NCC2020A308) vollständig genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Gene lis für Heatmap.

GSVA-Genliste.

Ergebnisse des Zellproliferationstests. Zellproliferations-Assay-Ergebnisse der Raw264.7-Zelllinien, die mit OH2 MOI=1 (rot), OH2 MOI=0,5 (blau) und unbehandelter (schwarz) Gruppe behandelt wurden, mittels CCK8-Assay in 72 Stunden. Abbildung S2. OH2-Lysate induzieren in vitro die Polarisation und Phagozytose von RAW264.7. A. Demonstration der Analyse der Phagozytose mittels Durchflusszytometrie. B. Zellproliferations-Assay-Ergebnisse von CT26-, MC38- und 4T-1-Zelllinien, behandelt mit Lysat (rot), CFS (blau), zellgefrorenem Lysat (lila) und unbehandelter (schwarz) Gruppe durch CCK8-Assay in 24 Stunden. **, p<0,01. Abbildung S3. Das Verhältnis der Makrophagen M1 (F4/80+CD86+) und M2 (F4/80+CD206+) in RAW264.7 ohne Behandlung mittels Durchflusszytometrie. Abbildung S4. Das Verhältnis von M1- (F4/80+CD86+) und M2-Makrophagen (F4/80+CD206+) in RAW264.7, behandelt mit Lysat, in der blockierten SIRPα-Gruppe und der nicht blockierten SIRPα-Gruppe. A. Demonstration der Analyse der Polarisation von Makrophagen mittels Durchflusszytometrie. B. Anzeige der Ergebnisse der Isotypkontrolle für verschiedene Antikörper. C. Das Verhältnis der Makrophagen M1 (F4/80+CD86+) und M2 (F4/80+CD206+) in der blockierten SIRPα-Gruppe und der nicht blockierten SIRPα-Gruppe. D. Das Verhältnis der Makrophagen M1 (F4/80+CD86+) und M2 (F4/80+CD206+) in der blockierten SIRPα-Gruppe und der nicht blockierten SIRPα-Gruppe. Zur Analyse der Signifikanz des Unterschieds zwischen zwei Gruppen wurde ein ungepaarter Student-t-Test verwendet. Abbildung S5. Zellgefrorenes Lysat und CFS induzieren in vitro die Polarisation von RAW264.7. A. Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse einer repräsentativen Probe aus jeder Zelllinie. B. Das Verhältnis des M1-Subtyps (F4/80+CD86+) in den zellgefrorenen Lysat- und CFS-Gruppen von CT26-, MC38- und 4T-1-Zellen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie. Zur Analyse der Signifikanz des Unterschieds zwischen zwei Gruppen wurde ein ungepaarter Student-t-Test verwendet. Abbildung S6. OH2-Lysate induzieren in vitro die Polarisation primärer Makrophagen. A. Demonstration der Analyse der Polarisation von Makrophagen mittels Durchflusszytometrie. B. Der Prozentsatz des Subtyps M1 (F4/80+CD86+) und des Subtyps M2 (F4/80+CD206+) in den Lysat-, CFS-, unbehandelten und zellgefrorenen Lysatgruppen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie. Bei den Daten handelt es sich um Durchschnittswerte aus drei Proben pro Behandlungsgruppe. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Abbildung S7. Die klare Effizienz von CL wurde durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ***, p=0,0003; ****, p<0,0001. Abbildung S8. Tumor-Rechallenge mit CT26 der mit OH2 oder OH2+ CL geheilten Tiere. A. Die Tumorwachstumskurve von CT26-Zellen wird erneut belastet, nachdem sich die Tumoren des CL-Modells vollständig zurückgebildet hatten. B. Die tumorigene Rate von Tumor-Rechallenge-Mäusen in der OH2-kombinierten Kontrollliposomengruppe und der OH2-kombinierten CL-Gruppe. Statistische Unterschiede wurden mithilfe des Chi-Quadrat-Tests berechnet. p=0,0291. Abbildung S9. M-IHC-Färbung der OH2- (links) und OH2-kombinierten CL-Gruppe (rechts) einschließlich jedes einzelnen Färbemarkers. Abbildung S10. Expressionsniveau von SIRPα auf Makrophagen in der Milz von Mäusen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie. A. Demonstration des Expressionsniveaus von SIRPα auf Makrophagen in der Milz von Mäusen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie. B. Histogramm, das das Expressionsniveau von SIRPα auf Makrophagen in der Milz von Mäusen (n = 3) zeigt. Abbildung S11. Die kombinierte Anti-SIRPα-Therapie mit OH2 verstärkt die Immunantwort gegen Krebs in einem CT26-Krebsmodell. A. Der Behandlungsprozess und der experimentelle Zeitplan für die kombinierte Behandlung. B. Die Tumorwachstumskurve verschiedener Behandlungsgruppen tumortragender Mäuse mit kleineren Tumorvolumina bei der Erstbehandlung. Das rote Kästchen wurde vergrößert, um die OH2-kombinierte Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, den OH2-kombinierten Isotyp und die OH2-Gruppe anzuzeigen. An den experimentellen Daten wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. n=10 Mäuse/Gruppe. ns, keine signifikanten Unterschiede. C. Die Überlebenskurve verschiedener Behandlungsgruppen tumortragender Mäuse mit kleineren Tumorvolumina bei der Erstbehandlung. Für die Überlebenskurvendaten wurden die Kaplan-Meier-Methode und der Log-Rank-Test verwendet. ns, keine signifikanten Unterschiede. Abbildung S12. M-IHC-Färbungsergebnisse des Anti-SIRPα-Modells. M-IHC-Stanning der Kontrollgruppe (oben links), der OH2-Gruppe (oben rechts), der kombinierten OH2-Isotypgruppe (unten links) und der kombinierten OH2-Anti-SIRPα-Antikörpergruppe (unten rechts), einschließlich jedes einzelnen Färbemarkers. Abbildung S13. IHC-Färbung und quantitative Ergebnisse des Anti-SIRPα-Antikörper-Behandlungsmodells. A. Repräsentative IHC-Färbung für CD8, F4/80, CD86 und CD206 der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, Kontrollgruppe und Anti-SIRPα-Antikörpergruppe mit größeren Tumorvolumina bei der Erstbehandlung. B. Quantitative Ergebnisse der CD8-, F4/80-, CD86- und CD206-Färbung in der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe, der Kontrollgruppe und der Anti-SIRPα-Antikörpergruppe. Originalvergrößerung: 200-fach. n=5 Proben/Gruppe. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Abbildung S14. KEGG-Ergebnisse von Tumorgeweben aus dem Anti-SIRPα-Modell. A. KEGG-Ergebnisse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und der Kontrollgruppe. B. KEGG-Ergebnisse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und der OH2-kombinierten Isotyp-Antikörpergruppe. Abbildung S15. GSEA-Ergebnisse von Tumorgeweben aus dem Anti-SIRPα-Modell. A. GSEA-Ergebnisse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und der Kontrollgruppe. B. GSEA-Ergebnisse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen der OH2-kombinierten Anti-SIRPα-Antikörpergruppe und der oHSV-2-kombinierten Isotyp-Antikörpergruppe. Abbildung S16. scRNA-seq-Datenanalyse. A. UMAP-Diagramme stellen die Cluster (links) und Gruppen (rechts) von Tumorzellen dar. B. Eine Heatmap, die den skalierten durchschnittlichen Ausdruck jedes Zell-Subclusters zeigt. C. UMAP-Diagramme, die die Expressionswerte der kanonischen Markergene jedes Subclusters zeigen. D. Eine Heatmap, die die skalierte durchschnittliche Expression jedes Immunzell-Subclusters zeigt. C. UMAP-Diagramme, die die Expressionswerte kanonischer Markergene jedes Immunsubclusters zeigen. Abbildung S17. CTL-Assay. A. Die Abtötungsfunktionen von Lymphozyten, die zusammen mit verschiedenen Krebszelllysaten kultiviert wurden, wurden durch CFSE/PI nachgewiesen. Für jede Zelllinie wurden drei Effektor-Ziel-Verhältnisse festgelegt (Lymphozyten: Tumorzellen = 25:1, 50:1 und 100:1). Bei den Daten handelt es sich um Durchschnittswerte aus drei Proben pro Behandlungsgruppe. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ns, keine signifikanten Unterschiede, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. B. Der Überstand aus dem CTL-Assay wurde mittels ELISA auf TNF-α, Granzyme B und IFN-γ getestet. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. ns, keine signifikanten Unterschiede, ****, p<0,0001.

Ergänzende Methoden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kong, D., Yang, Z., Li, G. et al. Der SIRPα-Antikörper schützt in Kombination mit dem onkolytischen Virus OH2 vor Tumoren, indem er die angeborene Immunität aktiviert und die Mikroumgebung des Tumorimmunsystems neu programmiert. BMC Med 20, 376 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02574-z

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Eingegangen: 09. März 2022

Angenommen: 21. September 2022

Veröffentlicht: 31. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02574-z

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