Metagenomik

Nature Microbiology Band 8, Seiten 1108–1122 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Morbilliviren gehören zu den ansteckendsten viralen Krankheitserregern von Säugetieren. Obwohl frühere metagenomische Untersuchungen Morbillivirus-Sequenzen in Fledermäusen identifiziert haben, sind Morbilliviren in voller Länge aus Fledermäusen begrenzt. Hier charakterisieren wir das Myotis bat morbillivirus (MBaMV) aus einem Fledermausüberwachungsprogramm in Brasilien, dessen vollständiges Genom kürzlich veröffentlicht wurde. Wir zeigen, dass das Fusions- und Rezeptorbindungsprotein von MBaMV Fledermaus-CD150 und nicht menschliches CD150 als Eintrittsrezeptor in einer Säugetierzelllinie nutzt. Mithilfe der umgekehrten Genetik produzierten wir einen Klon von MBaMV, der Vero-Zellen infizierte, die Fledermaus-CD150 exprimierten. Die Elektronenmikroskopie von MBaMV-infizierten Zellen zeigte die Knospung pleomorpher Virionen, ein charakteristisches Merkmal des Morbillivirus. Die MBaMV-Replikation erreichte in menschlichen Epithelzelllinien 103–105 Plaque-bildende Einheiten ml−1 und war von Nectin-4 abhängig. Es kam auch zu einer Infektion menschlicher Makrophagen, wenn auch zwei- bis zehnmal weniger effizient als beim Masernvirus. Wichtig ist, dass MBaMV durch kreuzneutralisierende menschliche Seren, die durch Masern-, Mumps- und Rötelnimpfungen hervorgerufen werden, eingeschränkt und durch oral bioverfügbare Polymeraseinhibitoren in vitro gehemmt wird. MBaMV-kodierte P/V-Gene wirkten der Induktion von menschlichem Interferon nicht entgegen. Schließlich zeigen wir, dass MBaMV bei jamaikanischen Flughunden keine Krankheiten verursacht. Wir kommen zu dem Schluss, dass ein Übergreifen von Zoonose auf den Menschen zwar theoretisch plausibel sein könnte, die MBaMV-Replikation jedoch wahrscheinlich durch das menschliche Immunsystem kontrolliert wird.

Fledermäuse sind wichtige Reservoirwirte für viele Viren mit zoonotischem Potenzial1. Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2, das Ebola-Virus und das Nipah-Virus sind Beispiele für solche Viren, die tödliche Epidemien und Pandemien verursacht haben, wenn sie von Fledermäusen auf menschliche und tierische Populationen übertragen wurden2,3. Eine sorgfältige Überwachung von Viren bei Fledermäusen ist für die Identifizierung potenzieller Zoonoseerreger von entscheidender Bedeutung. Allerdings führen metagenomische Untersuchungen bei Fledermäusen häufig nicht zu Virussequenzen voller Länge, die zur Regeneration solcher Viren für eine gezielte Charakterisierung verwendet werden können4, zumindest nicht ohne viel weiteren Aufwand wie die schnelle 3′- und 5′-Amplifikation komplementärer DNA-Enden. Verbesserungen in der Sequenzierungstechnologie und der Bioinformatik haben vollständigere Genomassemblierungen ermöglicht. Drei im vergangenen Jahr veröffentlichte metagenomische Untersuchungen bestätigen, dass Fledermäuse und in geringerem Maße Spitzmäuse und Nagetiere Wirte verschiedener Paramyxoviren5,6,7 sind, die mehrere Gattungen umfassen (Jeilongvirus, Morbillivirus und Henipavirus). Metagenomische Sequenzen, so vollständig sie auch sein mögen, können derzeit keine ausreichend genauen Informationen über virale Phänotypen in vitro und in vivo liefern. Um taxonomische Entdeckungen zu konkretisieren, sind noch detaillierte virologische Untersuchungen erforderlich.

Morbilliviren gehören zu den ansteckendsten viralen Krankheitserregern, die Säugetiere infizieren. Während bei Fledermäusen und Nagetieren4,5 in metagenomischen Untersuchungen zahlreiche Teilsequenzen von Morbilliviren identifiziert wurden, wurde kein authentisches Morbillivirus in voller Länge aus Chiropteren-Wirten isoliert oder charakterisiert. Zur Gattung der Morbilliviren gehören das Masernvirus (MeV), das Hundestaupevirus (CDV), das Rinderpestvirus, das Staupevirus, das Cetacean-Morbillivirus, das Peste-des-petis-Virus für Wiederkäuer und das Katzen-Morbillivirus8. Kürzlich wurde beschrieben, dass ein Schweine-Morbillivirus die mutmaßliche Ursache für den Tod des Fötus und für Enzephalitis bei Schweinen ist9. Alle Morbilliviren verursachen in ihren natürlichen Wirten schwere Erkrankungen10,11,12,13,14 und die Pathogenität wird weitgehend durch die artspezifische Expression kanonischer Morbillivirus-Rezeptoren bestimmt, die durch CD150/SLAMF1 (Ref. 15) und NECTIN4 (Ref. 16) kodiert werden. .

In diesem Artikel charakterisieren wir das Myotis-Fledermaus-Morbillivirus (MBaMV) einer Vespertilioniden-Fledermausart (Myotis riparius) in Brasilien, das bisher nur anhand von Sequenzinformationen identifiziert wurde. MBaMV verwendete Myotis spp. CD150 ist in Fusionstests viel besser als CD150 von Mensch und Hund. Wir haben dies anhand von lebendem MBaMV bestätigt, das durch umgekehrte Genetik gerettet wurde. Überraschenderweise replizierte MBaMV in primären menschlichen myeloischen, aber nicht in lymphoiden Zellen, und zwar auf CD150-unabhängige Weise. Dies steht im Gegensatz zu MeV, von dem bekannt ist, dass es CD150+ menschliche myeloische und lymphatische Zellen infiziert. Darüber hinaus replizierte MBaMV in menschlichen Epithelzellen und nutzte menschliches Nectin-4 fast genauso gut wie MeV. Dennoch scheint MBaMV P/V die Induktions- und Signalwege von menschlichem Interferon (IFN) nicht zu antagonisieren, und MBaMV wurde, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, durch Masern-, Mumps- und Röteln (MMR)-Impfseren kreuzneutralisiert. Unsere Ergebnisse belegen die Fähigkeit von MBaMV, einige menschliche Zellen zu infizieren und zu replizieren, die für die MeV-Pathogenese und -Übertragung von entscheidender Bedeutung sind. Eine umfassende Bewertung der Viruseigenschaften liefert jedoch Daten für die ordnungsgemäße Bewertung seines zoonotischen Potenzials.

Während einer metagenomischen genomischen Untersuchung von Viren in Fledermäusen identifizierten wir eine Morbillivirus-Sequenz in voller Länge aus einer Uferfledermaus (M. riparius) in Brasilien7. Insgesamt wurden 46 Individuen der Art M. riparius beprobt. Davon stammten 9 aus dem Amazonasgebiet und 37 aus dem Atlantischen Regenwald im Süden Brasiliens. Der Rektalabstrich einer Person aus der Amazonasregion war positiv für das PDF-3137-Virus7. Dieses MBaMV hatte eine Genomlänge von 15.720 Nukleotiden, die der 6er-Regel entsprach, und bestand aus 6 Transkriptionseinheiten, die die kanonischen offenen Leserahmen (ORFs) von Nukleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrixprotein (M) kodierten. Fusionsprotein (F), Rezeptorbindungsprotein (RBP) und großes Protein (L) (Extended Data Abb. 1a). Die Größen dieser ORFs sind vergleichbar mit ihren Gegenstücken in den anderen Morbilliviren (erweiterte Datentabelle 1). Die phylogenetische Analyse unter Verwendung der L-Proteinsequenz voller Länge zeigte, dass MBaMV am engsten mit CDV und dem Staupevirus verwandt ist (Extended Data Abb. 1b und Extended Data Table 2).

Paramyxovirus-Proteine ​​mit den häufigsten und direktesten Wechselwirkungen mit Wirtsproteinen, wie P und seine akzessorischen Genprodukte (V und C) sowie das RBP, weisen tendenziell die größte Diversität auf17. Morbillivirus P, V und C antagonisieren wirtsspezifische angeborene Immunantworten, während sein RBP mit wirtsspezifischen Rezeptoren interagiert. Dass diese Proteine ​​unter evolutionärem Druck stehen, mit verschiedenen Wirtsproteinen zu interagieren, spiegelt sich in der geringeren Konservierung von MBaMV P/V/C (31–43 %) und RBP (27–32 %) im Vergleich zu anderen Morbillivirus-Homologen wider. Dies steht im Gegensatz zur relativ hohen Konservierung (52–76 %) der N-, M-, F- und L-Proteine ​​von MBaMV mit ihren jeweiligen Morbillivirus-Gegenstücken (Extended Data Abb. 2).

Die Verwendung von CD150/SLAMF1 zum Eindringen in myeloische und lymphatische Zellen ist ein Kennzeichen von Morbilliviren und auch ein wichtiger Faktor für die Pathogenität. CD150 variiert stark zwischen den Arten und ist für den artenbeschränkten Tropismus der meisten Morbilliviren verantwortlich18. Daher haben wir zunächst den artspezifischen Rezeptortropismus von MBaMV charakterisiert. Wir führten einen quantitativen bildbasierten Fusionstest durch, indem wir Expressionsvektoren, die für MBaMV-F und MBaMV-RBP kodieren, zusammen mit CD150 der angegebenen Spezies in rezeptornegative Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) co-transfizierten. MeV-RBP und F bildeten bei der Kotransfektion von menschlichem CD150 (hCD150) mehr Synzytien in CHO-Zellen als Hunde-CD150 (dCD150) oder Fledermaus-CD150 (bCD150) (Abb. 1a, obere Reihe). Im Gegensatz dazu bildeten MBaMV-RBP und F bei bCD150-Überexpression größere und zahlreichere Synzytien als hCD150 oder dCD150 (Abb. 1a, mittlere Reihe). CDV-RBP und F bildeten umfangreiche Synzytien mit dCD150 und bCD150 und mäßige Synzytien mit hCD150 und sogar scheintransfizierten Zellen (Abb. 1a, untere Reihe), was auf ein gewisses Maß an Promiskuität hindeutet. Wir haben diese Ergebnisse der Bildung unterschiedlicher Synzytien auf einem Bildzytometer wie beschrieben quantifiziert19 (Abb. 1b).

a, Syncytia-Bildung in CHO-Zellen, die mit den angegebenen Morbillivirus-Hüllglycoproteinen, artspezifischem CD150 und Life-act-GFP co-transfiziert wurden. Die Bilder wurden mit dem Celigo Imaging Cytometer (Nexcelom) 48 Stunden nach der Transfektion (hpt) aufgenommen und sind rechnerische Zusammenstellungen aus einer identischen Anzahl von Feldern in jeder Vertiefung. Maßstabsbalken, 200 µm. Helligkeits- und Kontrasteinstellungen waren identisch. b, Quantifizierung der Synzytienbildung in a. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten. Die angegebenen angepassten P-Werte stammen aus einer gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. c: Der VSV-Pseudopartikel-Eintrittstest (pp) zeigte ähnliche Trends. Angepasste P-Werte, die wie in b erhalten wurden, jedoch nur für den Vergleich von Gruppen mit dem höchsten verwendeten viralen Inokulum (10−1 reziproke Verdünnung) in drei biologisch unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± Standardabweichung).

Quelldaten

Wir haben auch die Rezeptorverwendung von MBaMV in einem Pseudotyp-Eintrittstest für das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) untersucht. VSV-DG[Rluc] mit MeV-RBP und F gelangte wie erwartet besser in hCD150-transfizierte CHO-Zellen als dCD150-, bCD150- oder scheintransfizierte Zellen (Abb. 1c). MBaMV-Pseudotypen gelangten nur in bCD150-transfizierte CHO-Zellen. CDV-Pseudotypen zeigten einen guten Eintritt in dCD150- und bCD150-transfizierte, jedoch nicht in hCD150-transfizierte CHO-Zellen. Diese Ergebnisse stimmen im Allgemeinen mit den Ergebnissen unseres Fusionstests überein und unterstützen die Speziesspezifität von Morbilliviren. CDV hat eine hohe Neigung, Artengrenzen zu überwinden und kann bei mehreren Fleischfresserfamilien wie großen Raubkatzen (z. B. Löwen und Tiger), Hyänen (z. B. Tüpfelhyänen), Ailuriden (z. B. Roten Pandas) und Ursiden Krankheiten verursachen. (z. B. Schwarzbären), Procyoniden (z. B. Waschbären), Marder (z. B. Frettchen), Viverriden (z. B. Zibetkatzen) und sogar nicht-fleischfressende Arten wie Javalinas (Pekaris) und Nagetiere (asiatische Murmeltiere)20. CDV war auch an mehreren Ausbrüchen bei nichtmenschlichen Primaten (verschiedene Macaca-Arten)21,22,23 beteiligt. Die Fähigkeit von CDV, bCD150 und dCD150 mit gleicher Effizienz zu nutzen, deutet auf die Möglichkeit einer effizienten Übertragung von Fleischfressern auf einige Chiropterenarten hin, wenn andere Faktoren nach dem Eintritt keine zusätzlichen Einschränkungen darstellen.

Als nächstes versuchten wir, einen genomischen cDNA-Klon von MBaMV zu erzeugen, den wir durch umgekehrte Genetik retten konnten. Wir haben das mutmaßliche MBaMV-Genom in immer größeren Fragmenten synthetisiert und zusammengesetzt. Zwei stille Mutationen wurden in die N-terminalen 1,5 kb des L-Gens eingeführt, um einen kryptischen ORF im Minusstrang zu zerstören (Extended Data Abb. 3), der zunächst die Klonierung des gesamten MBaMV-Genoms verhinderte. Wir führten eine zusätzliche EGFP-Transkriptionseinheit am 3'-Terminus ein und retteten dieses MBaMV-GFP-Genom mithilfe des N-, P- und L-Akzessorplasmids von MeV (Extended Data Abb. 1a). MBaMV-GFP wurde ursprünglich in BSR-T7-Zellen gerettet, aber auf Vero-bCD150-Zellen passagiert, amplifiziert und titriert (Extended Data, Abb. 4a). MBaMV bildete 3 Tage nach der Infektion (dpi) GFP-positive Synzytien mit Hunderten von Kernen (Abb. 2a) und relativ homogene Plaques mit einer Größe von 7 dpi (Abb. 2b). Durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Abb. 2c) wurden zahlreiche pleiomorphe Virionen (~ 100–200 nm) erfasst, die mit Vero-bCD150-Zellen assoziiert sind oder aus diesen hervorgehen. Einige scheinen fadenförmige Partikel zu sein, die aus einer Zelle austreten. Bei starker Vergrößerung waren die Virionen durch Vorsprünge zu erkennen, die auf Oberflächenglykoproteine ​​hindeuteten. Im Inneren des gezeigten Virions finden sich Ribonukleoprotein-ähnliche Strukturen. Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Erkenntnissen von MeV24 überein.

a, Synzytienbildung in Vero-bCD150-Zellen, induziert durch MBaMV 3 dpi. Zellen bildeten bei der Infektion Synzytien mit mehr als 100 Zellkernen (helles Feld), was durch virusexprimiertes GFP (rechts) deutlich erkennbar ist. Maßstabsbalken, 500 µm. Dieses Experiment wurde dreimal durchgeführt und repräsentative Bilder sind abgebildet. b: MBaMV-Plaquebildung in Vero-bCD150-Zellen. Die Zellen wurden mit zehnfach seriell verdünntem Virusstamm infiziert, mit methylcellulosehaltigem DMEM inkubiert und mit Kristallviolett und Neutralrot 7 dpi gefärbt. Der Durchmesser der Vertiefung beträgt 22 mm. Eine Vertiefung wird vergrößert, um die Plaquemorphologie im Detail darzustellen. c, TEM-Bilder des MBaMV-Virions auf der Oberfläche von Vero-bCD150-Zellen bei 3 dpi. Zahlreiche umhüllte Virionen sprießen aus der Plasmamembran oder sind mit dieser assoziiert (links). Es sind auch fadenförmige Partikel zu sehen (Sternchen). Das vergrößerte Bild (rechts) zeigt den Virion- und Ribonukleoproteinkomplex (RNP). Diese Bilder stammen aus einem unabhängigen Experiment.

Um zu verstehen, wie gut CD150 von verschiedenen Wirten die MBaMV-Replikation unterstützt, haben wir das MBaMV-Wachstum in parentalen Vero-CCL81-Zellen und isogenen Derivaten getestet, die konstitutiv CD150 von Menschen, Hunden oder Fledermäusen exprimieren. MBaMV bildete bei 2 dpi in Vero-bCD150-Zellen riesige Synzytien (Abb. 3a) und erreichte Spitzentiter von ~105 PFU ml−1 bei 3 dpi (Abb. 3b). MBaMV zeigte eine mäßige Synzytienausbreitung und ein moderates Wachstum in Vero-dCD150-Zellen, die Spitzentiter bei 5 dpi waren jedoch etwa 100-fach niedriger. In Vero- oder Vero-hCD150-Zellen wurde kein nennenswertes Viruswachstum festgestellt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass MBaMV bCD150, jedoch nicht hCD150 für einen effizienten Zelleintritt und eine effiziente Zellreplikation verwenden kann. MBaMV scheint dCD150 zu verwenden, wenn auch in viel geringerem Maße als bCD150.

a,b, Vero-hCD150-, Vero-dCD150-, Vero-bCD150- und Vero-Zellen wurden mit rMBaMV-EGFP (MOI 0,01) infiziert. Die Virusreplikation und -ausbreitung wurde durch bildgebende Zytometrie (a) und Virustiter im Überstand (b) überwacht. In a waren große Synzytien in Vero-bCD150-Zellen bei 2 dpi erkennbar. In b wurde der Überstand jeden Tag gesammelt und der Virustiter durch einen GFP-Plaque-Assay bestimmt (Methoden). Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus dreifachen Experimenten. c–e, H441- und A549-Zellen wurden mit rMBaMV-EGFP bei einer niedrigen (0,01) oder hohen (0,5) MOI infiziert, wobei die Virusreplikation und -ausbreitung wie in a und b überwacht wurde: infizierte H441- und A549-Zellen bei 1, 2 und 5 dpi (D1, D2 und D5) (c); Viruswachstumskurven, dargestellt durch tägliche Titer unter den angegebenen Bedingungen, wobei die angezeigten Daten mittlere Titer ± Standardabweichung aus dreifachen Infektionen sind (d); Die empirische Fläche unter der Kurve (eAUC) wurde aus jeder Wachstumskurve ermittelt und als Balkendiagramm aus drei unabhängigen Experimenten aufgetragen (Mittelwert ± Standardabweichung) (PRISM v 9.0) (e). Die gepunkteten Balken stellen die Wachstumskurven dar, die bei einem MOI von 0,1 erstellt wurden, und die gefüllten Balken bei einem MOI von 0,5. Angepasste P-Werte sind angegeben (einseitiger ANOVA-T3-Mehrfachvergleichstest nach Dunnett). f,g, Vero-humane Nectin-4-Zellen (Vero-hN4) wurden mit MBaMV und MeV (MOI 0,01) infiziert: MBaMV infizierte Vero-hN4 bei D1, D2 und D4 (f); replikative Virustiter für MBaMV und MeV auf Vero-hN4-Zellen über 5 Tage (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3) (g). Maßstabsbalken in a, c und f entsprechen 1 mm. Alle gezeigten Bilder wurden mit einem Celigo Imaging Cytometer (Nexcelom) aufgenommen. Bilder sind rechnerische Zusammenstellungen aus einer identischen Anzahl von Feldern in jedem Well. Die Nachweisgrenze für die Virustiterbestimmung liegt bei 20 PFU ml−1 und ist durch die gepunktete Linie in b, d und g angegeben.

Quelldaten

MeV verwendet menschliches Nectin-4 als Epithelzellrezeptor25,26, der eine effiziente Virusausscheidung aus dem betroffenen Wirt vermittelt16,27. CDV nutzt auch menschliches Nectin-4 effizient für den Eintritt und das Wachstum23. Um zu testen, ob MBaMV menschliches Nectin-4 in einem Epithelzellkontext verwenden kann, haben wir die Replikationskinetik von MBaMV in menschlichen Lungenepithelzellen untersucht, die hohe (H441) oder niedrige (A549) Konzentrationen von Nectin-4 exprimieren (Ref. 16,28). ) (Erweiterte Daten Abb. 4b). Überraschenderweise zeigte MBaMV eine effiziente Virusausbreitung (Abb. 3c) in H441-Zellen und erreichte 104 PFU ml−1 bei 6 dpi (Abb. 3d). Im Gegensatz dazu zeigte MBaMV kleine GFP-Herde und einen zehnmal niedrigeren Titer in A549-Zellen. Der Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) ergab signifikante Unterschiede in dieser Wachstumskurvenmetrik (Abb. 3e). Allerdings replizierte MeV in H441-Zellen immer noch höhere Titer als MBaMV (Abb. 3d-e). Dies könnte auf artspezifische Wirtsfaktoren oder Unterschiede im IFN-Antagonismus zwischen menschlichen und Fledermaus-Morbilliviren zurückzuführen sein. Daher haben wir das Wachstum von MBaMV im Vergleich zu MeV in IFN-defekten Vero-humanen Nectin-4-Zellen (Vero-hN4) getestet. MBaMV und MeV replizierten und verbreiteten sich gleichermaßen gut auf Vero-hN4-Zellen (Abb. 3f, g), was die Fähigkeit von MBaMV bestätigt, menschliches Nectin-4 zu verwenden, und darauf hindeutet, dass MBaMV möglicherweise nicht in der Lage ist, den angeborenen Immunantworten des Menschen entgegenzuwirken.

Um das Transkriptionsprofil von MBaMV besser zu verstehen, verwendeten wir die Long-Read-Direkt-RNA-Sequenzierung von Nanopore, um die Messenger-RNAs von MBaMV-infizierten Vero-bCD150-Zellen bei 2 dpi (Infektionsmultiplizität (MOI) 0,01) zu sequenzieren. Wir fanden einen charakteristischen 3′–5′-Transkriptionsgradienten, bei dem GFP > N > P > M > F > RBP > L (Extended Data Abb. 5a). Morbilliviren haben ein konserviertes intergenisches Motiv (CUU) zwischen dem Genende und dem Genanfang benachbarter Gene „AAAA-CUU-AGG“. Dieses intergenische Motiv war in der langen komplexen intergenen MF-Region des zusammengesetzten MBaMV-Genoms nicht sofort erkennbar. Die hohe Abdeckung dieser intergenen MF-Region (M-Read-Through-Transkripte) identifizierte das intergenische MF-Motiv jedoch als „CGU“ statt als „CUU“ (Extended Data Abb. 5b).

Es ist bekannt, dass das P-Gen von Morbilliviren die V- oder W-Gene durch die Insertion von einem bzw. zwei Guaninen am konservierten Editierungsmotiv (AAAAGGG)29 erzeugt, das in MBaMV vorhanden ist. Die Amplikon-Sequenzierung des P-Gen-Editierungsmotivs – aus demselben mRNA-Pool, der oben verwendet wurde – ergab, dass die Häufigkeit von P-, V- und W-mRNA 42,1 %, 51,2 % bzw. 2,6 % beträgt (Extended Data Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass der Hauptanteil der P-, V- und W-mRNA liegt Es entsteht der IFN-Antagonist (V). Dieses P-Editing-Verhältnis ähnelt dem, was in früheren Studien gefunden wurde30.

Als nächstes untersuchten wir die Expression und Spaltung von zwei Oberflächenglykoproteinen (RBP und F). Das C-terminale AU-1-markierte F-Konstrukt zeigte ungespaltenes F0 und gespaltenes F1 (Erweiterte Daten, Abb. 5d). Das am C-Terminus mit HA markierte RBP-Konstrukt zeigte neben Oligomeren auch Monomer (Extended Data, Abb. 5e). MBaMV-RBP zeigte einen Schmierfilm über 110 kDa, was auf eine Oligomerisierung hindeutet. Diese Oligomerisierung wurde auch bei MeV-RBP beobachtet, jedoch nicht bei CDV-RBP, was auf eine unterschiedliche Stabilität unter den verwendeten subreduzierenden Bedingungen schließen lässt.

Die beiden Unterordnungen der Chiropteren (Fledermäuse), Pteropodiformes (Yinpterochioptera) und Vespertilioniformes (Yangochiroptera), umfassen mehr als 1.400 Arten, die in 6 bzw. 14 Familien eingeteilt sind31. Myotis-Fledermäuse gehören zur prototypischen Familie der Vespertilionidae, die der Namensgeberin ihrer Unterordnung ist. Jamaika-Flughunde (Artibeus jamaicensis) gehören zur gleichen Unterordnung wie Myotis-Fledermäuse, allerdings aus einer anderen Familie (Phyllostomidae). Wir inokulierten sechs jamaikanische Flughunde, die in einer Kolonie in Gefangenschaft verfügbar waren, über zwei verschiedene Wege mit MBaMV, um deren Pathogenität in vivo zu beurteilen. Alle Fledermäuse blieben asymptomatisch und zeigten bis zu drei Wochen nach der Infektion keine Anzeichen einer systemischen Erkrankung. Wir konnten auch keine molekularen oder serologischen Hinweise auf eine produktive Infektion feststellen (Extended Data Abb. 6). Die Untersuchung der CD150-Sequenzen von jamaikanischen Flughunden und Myotis-Flughunden ergab wesentliche Unterschiede in den vorhergesagten Kontaktflächen mit RBP (siehe unten), die unserer Vermutung nach für die artspezifische Einschränkung verantwortlich sind, die wir bei unserer experimentellen Herausforderung von jamaikanischen Flughunden mit MBaMV beobachtet haben.

Um RBP-CD150-Wechselwirkungen zu identifizieren, die wahrscheinlich an der Bestimmung des Tropismus der Wirtsspezies beteiligt sind, verglichen wir die Aminosäuresequenzen an den mutmaßlichen Kontaktflächen von Morbillivirus-RBPs und ihren verwandten CD150-Rezeptoren. Mithilfe von PDBePISA32 identifizierten wir drei Schlüsselregionen in MeV-RBP (Reste 188–198, 498–507 und 524–556, Erweiterte Daten, Abb. 7a–c), die zwei Regionen in CD150 (Reste 60–92 und 119–131 des Menschen) verschließen CD150, Extended Data Abb. 8) in der Kristallstruktur von MeV-RBP, gebunden an CD150 (Protein Data Bank (PDB) ID: 3ALW)33. Die Ausrichtung von Schlüsselregionen in Morbillivirus-RBPs, die an CD150-Interaktionen beteiligt sind, zeigt virusspezifische Unterschiede, die auf eine Anpassung von Morbillivirus-RBPs an die CD150-Rezeptoren ihres natürlichen Wirts schließen lassen. Insbesondere fehlt MBaMV das DxD-Motiv an den Resten 501–503 (505–507 in MeV), das in allen Morbilliviren außer FeMV vorhanden ist (Extended Data Abb. 7). Diese Reste bilden mehrere Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungen, die MeV-RBP- und hCD150-Wechselwirkungen stabilisieren. Ihre Erhaltung legt nahe, dass sie ähnliche Rollen wie bei anderen Morbilliviren spielen. Auf der CD150-Seite (Extended Data Abb. 8) sind die Reste 70–76 und 119–126 zwischen den Wirtsspezies am variabelsten. Interessanterweise unterscheiden sich Jamaika-Flughund und Myotis CD150 in diesen Regionen erheblich, was eine Begründung für die unproduktive Infektion liefert, die wir in unseren Jamaika-Flughund-Challenge-Experimenten gesehen haben.

Alveolarmakrophagen und aktivierte T- und B-Zellen, die CD150 exprimieren, sind die ersten Ziele für den MeV-Eintritt und die systemische Ausbreitung. Um das zoonotische Potenzial von MBaMV besser einschätzen zu können, haben wir verglichen, wie gut menschliche Morbilliviren und Fledermaus-Morbilliviren menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDMs) und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) infizieren können. Sowohl MeV- als auch MBaMV-infizierte MDMs waren 24 Stunden nach der Infektion eindeutig GFP+ (hpi) (Abb. 4a), aber die Infektion war zwischen den Spendern und sogar zwischen verschiedenen Virusbeständen desselben Spenders unterschiedlich (Abb. 4b, d). Die MeV-Infektion von MDMs wurde jedoch durch sCD150 gehemmt, die MBaMV-Infektion dagegen nicht (Abb. 4c). MDMs hatten eine variable Expression von CD150 (10–30 % CD150+) und keine Expression von Nectin-4 (Extended Data Abb. 4c), aber eine Morbillivirus-Infektion schien nicht mit der CD150-Expression zu korrelieren (Abb. 4d). Wenn PBMCs dagegen mit Concanavalin-A und IL-2 stimuliert wurden, infizierte nur MeV diese Zellen robust (Abb. 4e).

a,b, MDMs wurden mit MV323-EGFP oder MBaMV (1 × 105 IE pro Probe) infiziert und entweder mit 2 % PFA bei 24 hpi fixiert, DAPI-gefärbt und abgebildet (Maßstabsbalken, 200 µm) (a) oder quantifiziert durch Durchflusszytometrie (b). Dargestellt ist der Prozentsatz der CD68+ GFP+ MDMs von sechs Spendern. Offene und durchgestrichene Symbole kennzeichnen Experimente mit Viren der Charge 1 bzw. Charge 2. Die angepassten P-Werte stammen aus einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. c: Lösliches menschliches CD150 (sCD150) oder ein CD150-Avi-Tag hemmten die MeV-Infektion von Makrophagen, nicht jedoch die MBaMV-Infektion. GFP+-Ereignisse in unbehandelten Kontrollen wurden auf 100 % gesetzt und die Einträge unter sCD150/CD150 Avi-Tag wurden auf unbehandelte Kontrollen normalisiert. Die angepassten P-Werte stammen aus einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Šídák. In b und c sind die angezeigten Daten Mittelwerte ± Standardabweichung aus mehreren Experimenten (n = 7 bzw. n = 5), wobei auch einzelne Werte angezeigt werden. d, Beispiel-FACS-Diagramme aus den in b gezeigten Zusammenfassungsdaten für die CD150-Färbung. e, ConA/IL-2-stimulierte PBMCs wurden mit MeV oder MBaMV (MOI von 0,1) infiziert und mittels Durchflusszytometrie bei 24 hpi auf GFP-Expression analysiert

Quelldaten

Durch die Impfung entstehende MeV-spezifische Antikörper können einen Kreuzschutz gegen eine CDV-Infektion bieten34. Um zu beurteilen, ob menschliche Seren von MeV-geimpften Personen kreuzneutralisierende Antikörper gegen MBaMV enthalten könnten, haben wir MMR-reaktive menschliche Seren gepoolt und ihre Fähigkeit gemessen, MeV, MBaMV und CDV in hCD150-, bCD150- und dCD150-exprimierenden Vero-Zellen zu neutralisieren. Menschliche Seren neutralisierten wirksam die MeV- und MBaMV-Infektion und in geringerem Maße die CDV-Infektion (Abb. 5a, links und Mitte). Im Gegensatz dazu neutralisierten Seren von CDV-infizierten Frettchen die CDV-Infektion viel besser als MeV oder MBaMV (Abb. 5a, rechts). Seren aus den MMR-Gruppen 1 und 2 hatten eine um 50 % höhere Hemmkonzentration (IC50) für MeV und MBaMV als für CDV, während CDV-spezifische Seren eine signifikant höhere IC50 für CDV als für MeV oder MBaMV aufwiesen (Abb. 5b). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass menschliche Seren kreuzneutralisierende Antikörper gegen MBaMV enthalten.

a, MeV, MBaMV und CDV wurden mit Reihenverdünnungen gepoolter menschlicher Seren von MMR-geimpften Personen (MMR-Gruppe 1 und Gruppe 2) und Seren von mit CDV infizierten Frettchen inkubiert. Die Fähigkeit des mit Seren behandelten Virus, Vero-Zellen zu infizieren, die den entsprechenden Rezeptor exprimieren, wurde durch Bildgebung infizierter Zellen bei 20 hpi, Messung der Fläche der GFP+-Zellen und Berechnung der Verringerung der Infektion im Vergleich zu Kontrollen ohne Serum gemessen. Für jedes Virus und die entsprechende Serengruppe wurden Neutralisationskurven aufgezeichnet. b: Die IC50 aus den in a gezeigten Neutralisationskurven wurden für jedes Replikat unter Verwendung eines robusten Anpassungsmodells generiert und grafisch dargestellt. Zwei unabhängige Experimente wurden mit der Neutralisierung gepoolter Humanseren durchgeführt, und ein Experiment mit technischen Duplikaten wurde unter Verwendung der CDV-Seren (Mittelwert ± Standardabweichung) durchgeführt. Die P-Werte wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA unter Verwendung eines Tukey-Mehrfachvergleichstests berechnet. NS, nicht signifikant.

Quelldaten

Die MeV-Proteine ​​P und V stören das angeborene Immunsystem, indem sie den IFN-Weg stören. Unsere Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass eine MBaMV-Infektion die P- und V-Transkripte produzierte (Extended Data Abb. 5c), daher versuchten wir herauszufinden, ob die MBaMV-P- und V-Proteine ​​den menschlichen IFN-Signalweg antagonisieren könnten. Wir fanden heraus, dass mit MBaMV P oder V transfizierte und mit IFN behandelte Zellen die Induktion des Interferon Stimulatory Response Element (ISRE) nicht blockierten, im Gegensatz zu ZIKV NS5, das dem ISRE effektiv entgegenwirkt (Extended Data Abb. 9a). Darüber hinaus blockierten mit MBaMV P oder V transfizierte Zellen die Induktion von IFN nicht, wenn sie mit RIG-I, MDA5 oder MAVS behandelt wurden (Extended Data Abb. 9b – d). Diese Daten zeigen, dass die MBaMV-P- und -V-Proteine ​​den menschlichen IFN-Signalweg nicht antagonisieren können.

Mögliche medikamentöse Behandlungen sind ein kritisches Thema für neu auftretende Viren. Daher haben wir getestet, ob MBaMV anfällig für derzeit verfügbare Medikamente ist. Wir haben zwei oral bioverfügbare kleine Verbindungen entwickelt, die auf das L-Protein von Morbilliviren abzielen: GHP-88309 (Ref. 35) und ERDRP-0519 (Ref. 36). Die Unterschiede zwischen MeV und MBaMV über die fünf funktionellen Domänen des L-Proteins sind schematisch in Abb. 6a37 dargestellt. Die In-silico-Modellierung (Abb. 6b) sagt voraus, dass beide Arzneimittel auf ähnliche Weise an MeV- und MBaMV-L-Protein binden sollten. Eine genauere Untersuchung der ERDRP-0519-Bindungstasche (Abb. 6c) zeigt, dass 1155–1158 YGLE- und H1288-Reste mit ERDRP-0519 interagieren. Diese Reste interagieren direkt mit ERDRP-0519 in MeV L38. Die Modellierung der GHP-88309-Bindungstasche (Abb. 6d) zeigt die Beteiligung der Reste E863, S869, Y942, I1009 und Y1105, die zuvor als Escape-Mutanten von GHP-88309 in MeV35 gemeldet wurden. Wie vorhergesagt, hemmten beide Medikamente dosisabhängig das MBaMV-Wachstum (Abb. 6e, f). Obwohl die halbmaximale wirksame Konzentration (EC50) von GHP-88309 für MeV niedriger ist als für MBaMV (0,6 µM bzw. 3,0 µM), erreicht GHP-88309 in Tiermodellen eine Plasmakonzentration von >30 µM, was darauf hindeutet, dass dies bei diesem Arzneimittel der Fall sein könnte ein wirksamer Inhibitor von MBaMV in vivo.

a, 2D-Schema des MBaMV-L-Proteins, das den Aufbau jeder Domäne zeigt. Die Konservierung zwischen dem MeV- und dem MBaMV-L-Protein wird gezeigt. Unterschiede zwischen den MeV- und MBaMV-L-Proteinen werden als graue Linien dargestellt. b: Ein 3D-Homologiemodell des MBaMV-L-Proteins wurde unter Verwendung der Strukturkoordinaten des PIV5-L-Proteins (PDB-ID: 6V86) erstellt. Die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP), Capping, Connector, Methyltransferase (Mtase) und C-terminale Domäne (CTD) sind jeweils blau, grün, gelb, orange und rosa gefärbt. Die Positionen der in silico am besten bewerteten Docking-Posen für ERDRP-0519 und GHP-88309 sind eingerahmt, und die Verbindungen werden als rote Stäbchen angezeigt. c, Die am besten bewertete Andockposition von ERDRP-0519 im Homologiemodell des MBaMV-L-Proteins (rote Stäbchen). Dargestellt ist eine Überlagerung der zuvor identifizierten Andockposition von ERDRP-0519 in einem Homologiemodell des MeV-L-Proteins (gelbe Stäbchen)38. Reste, die in früheren Photoaffinitätsvernetzungsexperimenten (Y1155, G1156, L1157 und E1158) und H1288 des HR-Motivs identifiziert wurden, sind als magentafarbene Stäbchen dargestellt. d, Die am besten bewertete Andockposition von GHP-88309 im Homologiemodell des MBaMV-L-Proteins (rote Stäbchen). Dargestellt ist eine Überlagerung der zuvor identifizierten Andockposition von GHP-88309 in einem Homologiemodell des MeV-L-Proteins (gelbe Stäbchen)35. Rückstände, die in MeV-Resistenzprofilierungsstudien identifiziert wurden, werden als magentafarbene Stäbchen angezeigt. e, Die Dosis-Wirkungs-Hemmungs-Wachstumskurven von ERDRP-0519 gegen MBaMV. Vero-bCD150-Zellen wurden 1 Stunde lang mit MBaMV bei einer MOI von 0,01 infiziert, dann wurde das Inokulum durch frisches Medium ersetzt, das Inhibitor in den angegebenen Konzentrationen (0–50 µM) enthielt. 2 dpi, virale Überstände wurden gesammelt und auf Vero-bCD150-Zellen titriert, wie in „Methoden“ beschrieben. Punkte stellen die Werte aus drei unabhängigen Experimenten dar. Die Regressionskurve (durchgezogene Linie) und das 95 %-Konfidenzintervall (KI) (gepunktete Linie) wurden in PRISM (Version 8.0) erstellt. f, Die Arzneimittelreaktion von GHP-88309 gegen das MBaMV-Wachstum. Die Virushemmung wurde identisch wie bei ERDRP0519 durchgeführt.

Quelldaten

Studien zur metagenomischen Virusüberwachung mithilfe von Next-Generation-Sequencing (NGS) haben es Wissenschaftlern ermöglicht, in Tierarten zirkulierende Viren zu überwachen und potenzielle zoonotische Bedrohungen zu identifizieren5,6,7,39. Besonders wichtig war die Überwachung von Fledermausarten. Beispielsweise wurden in einer Fledermausüberwachungsstudie aus dem Jahr 2012 über 60 neue Paramyxovirus-Sequenzen identifiziert, von denen mehrere der Gattung Morbillivirus zugeordnet wurden4. Aktuelle metagenomische Untersuchungen bestätigen, dass Fledermäuse verschiedene Orthoparamyxoviren beherbergen5,6,7. Während der Vergleich neuer Virussequenzen mit bekannten Krankheitserregern Aufschluss über die mit künftigen Spillover-Ereignissen verbundenen Risiken geben kann, sollte diese Art der In-silico-Modellierung auf der Grundlage viraler Sequenzen auch durch eine funktionelle Charakterisierung solcher Viren ergänzt werden. In einer früheren Studie haben wir eine Morbillivirus-Genomsequenz in voller Länge aus M. riparius-Fledermäusen in Brasilien identifiziert7. Hier haben wir mithilfe der Reverse-Genetik einen infektiösen Klon dieses Virus erzeugt. Darüber hinaus wurde während der Sequenzierungsexperimente kein rekombinantes Virus nachgewiesen. Mit diesem Ansatz haben wir den mühsamen Prozess der Isolierung und Kultivierung lebender Viren direkt aus Tieren umgangen und stattdessen MBaMV im Labor produziert.

Vor dieser Studie gab es nur sieben vom International Committee on Taxonomy of Viruses anerkannte Morbilliviren-Arten, von denen keine aus Fledermäusen isoliert wurde. Während das annotierte MBaMV-Genom mit der klassischen Morbillivirus-Genomorganisation (N, P/V/C, M, F, RBP und L) übereinstimmte, war es wichtig zu überprüfen, dass das durch umgekehrte Genetik erzeugte Virus die Morbillivirus-Biologie erfolgreich rekapitulierte. Fusionstests und Eintrittsexperimente bestätigten, dass MBaMV bevorzugt Myotis-CD150 gegenüber CD150 von Menschen oder Hunden verwendete, um in transgene Vero-Zellen einzudringen (Abb. 3), was dem Paradigma entspricht, dass CD150 der Hauptdeterminant der Wirtsspezifität für Morbilliviren ist. Wir untersuchten auch P-Editing – ein Kennzeichen von Paramyxoviren – und fanden RNA-Editing von P-mRNA, wodurch V-mRNA (einfache G-Insertion) oder W-mRNA (doppelte G-Insertion) von MBaMV entsteht. Interessanterweise ist der Anteil der V-mRNA mit 51,2 % der gesamten P-Transkripte ungewöhnlich hoch für Orthoparamyxoviren und ähnelt eher dem inzwischen ausgestorbenen Rinderpestvirus als noch existierenden Morbilliviren40.

In ihren natürlichen Wirten sind Morbilliviren hochpathogen und können tödliche akute Infektionen verursachen41. Eine vernünftige Vorhersage ist daher, dass MBaMV beim Fledermauswirt sichtbare Krankheiten verursachen würde. Als wir jedoch jamaikanische Flughunde mit MBaMV infizierten, stellten wir fest, dass das Virus keine systemischen Erkrankungen bei den Fledermäusen hervorrufen konnte (Extended Data Abb. 6) und es gab keine Hinweise darauf, dass MBaMV diese Fledermäuse produktiv infizierte. Dieses Fehlen einer Infektion könnte auf die CD150-Unterschiede zwischen den Arten zurückzuführen sein – CD150 von jamaikanischen Flughunden und Myotis-Arten ist auf Aminosäureebene nur zu 70 % konserviert (Extended Data Abb. 8). Wir gehen davon aus, dass eine MBaMV-Infektion bei der Art M. riparius eher zu schweren Erkrankungen führt. Alternativ ist es auch möglich, dass Fledermaus-Morbilliviren bei ihren Wirten keine schweren Erkrankungen verursachen, da Fledermäuse über ein einzigartiges Immunsystem verfügen, das es ihnen ermöglicht, tödliche Viren wie Nipah, Ebola und schweres akutes Atemwegssyndrom zu beherbergen, ohne Krankheiten zu zeigen42.

Bei der Beurteilung des zoonotischen Potenzials eines neuartigen Virus müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden, darunter die Rezeptornutzung, das Vorhandensein kreuzneutralisierender Antikörper in menschlichen Seren und Wechselwirkungen mit dem angeborenen Immunsystem. Während nicht-humane Morbilliviren derzeit nicht dafür bekannt sind, die Artenbarriere zu überwinden und Menschen zu infizieren, haben wir festgestellt, dass MBaMV in gewissem Umfang in der Lage war, menschliche Rezeptoren in vitro zu nutzen. Traditionell nutzen Morbilliviren CD150, um in myeloische und lymphatische Zellen einzudringen. Im Gegensatz zu MeV, das menschliche Makrophagen über CD150 infiziert, infiziert MBaMV menschliche Makrophagen jedoch auf CD150-unabhängige Weise (Abb. 4c)43. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass auf menschlichen Makrophagen ein Nicht-CD150/Nectin-4-Eintrittsrezeptor für MBaMV existiert. Darüber hinaus replizierte MBaMV gut in H441-Zellen und in Vero-Zellen, die menschliches Nectin-4 exprimierten (Abb. 3). Es wird auch berichtet, dass CDV menschliches Nectin-423 verwendet und sich in H358-Zellen replizieren kann44. Besorgniserregend ist, dass es bei nichtmenschlichen Primaten zu mehreren CDV-Ausbrüchen kam, die bei den Tieren zu akuten Erkrankungen oder zum Tod führten34. Bei einem Ausbruch wurden Mutationen im RBP gefunden, die CDV-RBP in die Lage versetzten, Primaten-CD150 effizient zu nutzen (Lit. 23). Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass sich CDV bei Vorliegen einer kreuzreaktiven MeV-Immunität an den Menschen anpasst. Menschliche Seren von MMR-geimpften Personen konnten die MBaMV-Infektion in vitro kreuzneutralisieren (Abb. 5) – dies würde die MBaMV-Infektion wahrscheinlich einschränken, wenn MMR-geimpfte Menschen dem Virus ausgesetzt wären. Während MeV-P- und -V-Proteine ​​die angeborene Immunantwort antagonisieren, konnten MBaMV-P und -V die IFN-Induktion oder -Signalisierung nicht blockieren (Erweiterte Daten, Abb. 9). Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das zoonotische Potenzial für MBaMV aufgrund kreuzneutralisierender Anti-MeV-Antikörper und einer angeborenen Immunrestriktion gering ist. Ersteres unterstreicht die Notwendigkeit, eine breite und hohe Durchimpfungsrate gegen Masern aufrechtzuerhalten, selbst wenn das Virus in der menschlichen Bevölkerung eliminiert wurde.

Die Tierstudie wurde gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Tierversuche wurden vorab vom Institutional Animal Care and Use Committee der Colorado State University (Protokollnummer 1090) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care und den Vorschriften des National Institutes of Health der Colorado State University durchgeführt Politik und lokale, staatliche und bundesstaatliche Gesetze. Archivierte CDV-Hyperimmunfrettchenseren wurden aus früheren Tierversuchen gewonnen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Georgia State University (IACUC-Nummer A22035) genehmigt wurden.

Alle Forschungsarbeiten wurden mit Genehmigung des Institutional Biosafety Committee (Protokollnummer SPROTO202100000065 und frühere Genehmigungen) auf der Biosicherheitsstufe 2+ (BSL2+) durchgeführt. Morbilliviren werden als BSL2-Erreger klassifiziert. Die vorliegende Arbeit fällt nicht unter die Dual-Use-Research-of-Concern-Vorschriften, da MBaMV nicht als einer der 15 offiziell als Dual-Use-Research-of-Concern-Agenten anerkannten Agenten aufgeführt ist. Es wurden keine mutagenen Experimente zur Verstärkung des Tropismus von MBaMV durchgeführt. Zur Risikobewertung wurden die Experimente nacheinander durchgeführt, um etwaige Risiken zu minimieren.

Zunächst untersuchten wir mithilfe eines Fusionsassays (Abb. 1b) und eines pseudotypisierten Virusassays (Abb. 1c), ob das RBP von MBaMV den kanonischen menschlichen Lymphoidrezeptor (CD150) verwendet, der für die Übertragung verantwortlich ist. Erst nachdem bestätigt wurde, dass MBaMV in beiden Tests kein menschliches CD150 verwendete, was darauf hindeutet, dass das Risiko einer Zoonose gering war, versuchten wir eine Virusrettung in voller Länge bei BSL2+. Darüber hinaus wurden unsere Experimente gemäß unserer Standardarbeitsanweisung durchgeführt, die erfordert, dass Experimente abgebrochen werden, wenn unerwartete virulente Phänotypen beobachtet werden, und diese dann dem IBC gemeldet werden. Zu den weiteren Risikominderungsfaktoren gehört die Anforderung, dass alle Mitarbeiter positive MMR-Titer haben müssen.

MBaMV wurde im Rahmen einer früheren metagenomischen Untersuchung von Fledermäusen in Brasilien und Malaysia identifiziert. Alle mit dieser Studie verbundenen Metadaten, einschließlich der Anzahl und Art der untersuchten Fledermäuse, sind in Wells et al.7 zu finden. Die Virusprobe wurde per Rektalabstrich einer Fledermaus entnommen, die ein subadultes Männchen (unreif, aber unabhängig) und offenbar gesund war. Mitochondriale DNA-Profile (MW554523 und MW557650) identifizierten die Fledermaus als Ufermyotis (M. riparius). Die RNA wurde einer NGS-Analyse unterzogen und das virale Genom (MW557651) wurde aus Fastq-Lesedateien (GSE166170) zusammengestellt. Die Fledermaus wurde mit einem Nebelnetz gefangen, anschließend wurden Mund-, Rektal- und Urogenitalabstriche zur RNA-Extraktion gesammelt. Die gesamte Nukleinsäure wurde unter Verwendung der Roche MagNA Pure 96-Plattform gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert, dann wurde die gesamte Nukleinsäure mit DNase behandelt (DNase I; Ambion, Life Technologies) und unter Verwendung von SuperScript III (Invitrogen, Life Technologies) mit zufälligen Hexamer-Primern revers transkribiert. Die cDNA wurde vor der Zweitstrangsynthese durch Klenow-Fragment (3‘- bis 5‘-Exonuklease) (New England Biolabs) mit RNase H behandelt, dann wurde die doppelsträngige cDNA mit einem fokussierten Ultraschallgerät E210 von Covaris in durchschnittlich 200 bp-Fragmente zerschnitten. Gescherte cDNA wurde mit der Illumina HiSeq 2500-Plattform tief sequenziert und die Lesevorgänge wurden mit MEGAHIT v1.2.8 bioinformatisch de novo zusammengesetzt, nach Qualitätskontrollschritten und dem Ausschluss von Host-Lesevorgängen mit Bowtie2 v2.3.5 (Ref. 45). Diese Methode war die gleiche wie eine zuvor veröffentlichte7.

Aminosäuresequenzen von L-Proteinen wurden von ClustalW abgeglichen, dann wurde die Evolutionsgeschichte von L-Proteinen durch die Maximum-Likelihood-Methode mit Bootstrap-Test von 1.000 Replikaten abgeleitet. Alle Prozesse wurden in MEGA X durchgeführt (Ref. 46). Für die Konservierungsmatrixtabelle wurden die Aminosäuresequenzen jedes Gens von ClustalW abgeglichen und anschließend die Konservierungen bewertet. Die für die Ausrichtung verwendeten Zugangsnummern sind in der erweiterten Datentabelle 2 zusammengefasst.

293T-Zellen (ATCC-Kat.-Nr. CRL-3216), A549-Zellen (ATCC-Kat.-Nr. CCL-185), Vero-Zellen (ATCC-Kat.-Nr. CCL-81, RRID:CVCL_0059) und BSR T7/5-Zellen (RRID :CVCL_RW96) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Atlanta Biologicals), bei 37 °C gezüchtet. NCI-H441-Zellen (ATCC-Kat.-Nr. HTB-174) wurden in RPMI 1640-Medium (Thermo Fisher Scientific) mit 10 % FBS gezüchtet. 293T-Zellen, A549-Zellen und H441-Zellen wurden alle mithilfe des ATCC-Zellauthentifizierungstestdienstes zertifiziert. Vero-hCD150-Zellen (Vero-humanes SLAM) sind Vero-Zellderivate, die hCD150 konstitutiv exprimieren. Vero-dCD150-Zellen sind Vero-Zellderivate, die HA-dCD150 konstitutiv exprimieren. Vero-hCD150-Zellen47 und Vero-dCD150-Zellen48 wurden von Dr. Yanagi an der Kyushu-Universität bereitgestellt und in DMEM mit 10 % FBS gehalten. Vero-bCD150-Zellen und Vero-hN4-Zellen wurden wie unten beschrieben erzeugt und in DMEM mit 10 % FBS gehalten. CHO-Zellen wurden in DMEM/F12-Medium (1:1) (Gibco) mit 10 % FBS gezüchtet.

Wir haben den ORF von hCD150, dCD150 und bCD150 (von Myostis brandtii, da die CD150-Sequenz von M. riparius unbekannt ist) in den von EcoRI (NEB) und NheI-HF (NEB) geschnittenen pCAGGS-Vektor kloniert. Wie bereits berichtet, haben wir HA-Tag-Linker-Igk-Signalpeptide (Aminosäuren entsprechend MVLQTQVFISLLLWISGAYG-YPYDVPDYA-GAQPARSP) am N-Terminus von CD150 eingeführt49. Die Sequenz von hCD150, dCD150 und bCD150 stammte von NP_003028.1, NP_001003084.1 bzw. XP_014402801.1. Wir synthetisierten Codon-optimierte Gensequenzen bei GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen) und erzeugten pCAGGS-Igk-HA-hCD150, pCAGGS-Igk-HA-dCD150 und pCAGGS-Igk-HA-bCD150. Wir haben auch pCAGGS-Igk-HA-bCD150-P2A-Puro generiert, das zusätzlich das Puromycin-resistente Gen exprimiert. Für pCAGGS-humanes Nectin-4-P2A-puro wurde von GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen) synthetisierte DNA in pCAGGS kloniert.

Die Sequenz von MBaMV RBP und F ORF wurde von GenScript synthetisiert. Diese wurden in den von EcoRI und NheI-HF geschnittenen pCAGGS-Vektor kloniert, wobei am C-Terminus ein HA-Tag (RBP-Gen) oder ein AU1-Tag (F-Gen) hinzugefügt wurde, wodurch pCAGGS-MBaMV-RBP-HA und pCAGGS-MBaMV-F-AU1 erzeugt wurden.

Für MeV-RBP und F-exprimierendes Plasmid amplifizierten wir die RBP- und F-Sequenz von p(+) MV323-AcGFP unter Hinzufügung von HA-Tag und AU1-Tag wie bei MBaMV-RBP und MBaMV-F, wodurch pCAGGS-MeV-RBP entstand -HA und pCAGGS-MeV-F-AU1. Für die CDV-RBP- und F-Klonierung amplifizierten wir die RBP- und F-Sequenz aus dem Plasmid pCDV-5804P unter Hinzufügung von HA-Tag und AU1-Tag und erzeugten pCAGGS-CDV-RBP-HA und pCAGGS-CDV-F-AU1.

Genomkodierende Plasmide für MeV; (p(+) MV323-AcGFP) und CDV; pCDV-5804P wurden freundlicherweise von Dr. Makoto Takeda50 bzw. Dr. Veronica von Messling51 zur Verfügung gestellt. Wir übertrugen die MeV-Genomsequenz in den pEMC-Vektor, fügten einen optimalen T7-Promotor, ein Hammerkopf-Ribozym, hinzu und führten eine eGFP-Transkriptionseinheit am Kopf des Genoms ein (pEMC-IC323-eGFP), worüber in der vorherigen Studie berichtet wurde19.

Für die Erzeugung des für das MBaMV-Genom kodierenden Plasmids synthetisierten wir DNA-Stücke mit 2.000–6.000 bp bei GenScript unter Hinzufügung der eGFP-Transkriptionseinheit am Kopf des Genoms (eGFP-MBaMV). DNA-Fragmente wurden einzeln mit dem In-Fusion-HD-Klonierungskit (Takara) zum pEMC-Vektor zusammengesetzt, wodurch pEMC-eGFP-MBaMV entstand. Die N-terminalen 1,5 kb des L-Gens waren zunächst nicht klonierbar. Die Sequenzanalyse ergab einen mutmaßlichen ORF (ORF-X) mit 86 Aminosäuren (aa) im komplementären Strang. Die Einführung von zwei Punktmutationen in dieser Region, um ORF-X zu zerstören, ohne die L-Aminosäuresequenz zu beeinträchtigen (Extended Data Abb. 4), ermöglichte schließlich die Klonierung des Genoms in voller Länge, was darauf hindeutet, dass ORF-X in Bakterien wahrscheinlich toxisch war.

Zur Gewinnung von rekombinantem MBaMV wurden 4 × 105 BSR-T7-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät. Am nächsten Tag wurden die angegebenen Mengen (unten geschrieben) an antigenomischem Konstrukt, Helferplasmiden (-N, -P und -L von MeV), T7-Konstrukt und LipofectamineLTX/PLUS-Reagenz (Invitrogen) in 200 ml Opti-MEM (Invitrogen) kombiniert ). Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Mischung tropfenweise auf die Zellen gegeben. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die P0-Viren enthaltenden Zellen wurden trypsinisiert und auf Vero-bCD150-Zellen übertragen (2,0 × 106 Zellen pro Kolben in einem 75-cm2-Kolben). Wir haben den Überstand 2 Tage nach der Überlagerung (P1-Virus) gesammelt und MBaMV in frischen Vero-bCD150-Zellen (>2× T1 75 cm2-Flaschen) erneut amplifiziert. Diese Passage 2 (P2)-Stammlösungen wurden titriert, in Aliquots eingefroren und für alle Experimente verwendet.

Die Menge der zur Rettung verwendeten Masernplasmide ist in unserer vorherigen Studie52 angegeben: 5 mg antigenomisches Konstrukt, 1,2 mg T7-MeV-N, 1,2 mg T7-MeV-P, 0,4 mg T7-MeV-L, 3 mg eines kodierenden Plasmids eine Codon-optimierte T7-Polymerase, 5,8 ml PLUS-Reagenz und 9,3 ml Lipofectamine LTX.

Die Rettung von MeV erfolgte genauso wie die Rettung von MBaMV, mit der Ausnahme, dass 5 mg pEMC-IC323eGFP für die Transfektion und Vero-hCD150-Zellen für die Co-Kultivierung verwendet wurden.

Für MBaMV wurde eine Monoschicht aus Vero-bCD150-Zellen in 12 Vertiefungen 1 Stunde lang mit 500 ml seriell verdünnten Proben infiziert, gefolgt von einem Mediumaustausch durch DMEM-haltige Methylcellulose. Anschließend wurde bei 5 dpi die Anzahl der GFP-positiven Plaques gezählt, um den Titer zu bestimmen. Für den Plaque-Assay wurden infizierte Vero-bCD150-Zellen 7 Tage lang unter Methylcellulose-haltigem DMEM inkubiert. Die Zellen wurden dann nacheinander mit 1 % Kristallviolett und 1 % Neutralrot gefärbt. Für MeV verwendeten wir Vero-hCD150-Zellen und fixierten die Platten bei 4 dpi

Insgesamt wurden 2,0 × 105 Zellen pro Vertiefung in eine Platte mit 12 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit dem angegebenen Virustiter (MOI 0,01 oder 0,5) infiziert, gefolgt von einem Austausch durch frisches Medium. Die Viren wurden 5 Tage lang gezüchtet, wobei das Medium jeden Tag gewechselt wurde. Die gesammelten Überstände wurden zur Titration verwendet.

Insgesamt 4,0 × 105 VeroCCL81-Zellen wurden mit 2 mg pCAGGS-Igk-HA-bCD150-P2A-Puro mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfiziert; Die Zellen wurden unter 5 mg ml-1 Puromycin (Gibco) selektiert, bis Kolonien sichtbar waren. Die Kolonien wurden unabhängig voneinander isoliert und mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) auf HA-Expression überprüft. Vero-hN4-Zellen wurden durch Transfektion von pCAGGS-humanem Nectin-4-P2A-Puro in VeroCCL81-Zellen, gefolgt von 5 mg ml-1 Puromycin-Selektion und Klonisolierung erzeugt. Der Oberflächenausdruck wurde durch FACS überprüft.

Einen Tag vor der Transfektion wurden insgesamt 6 × 106 Zellen von 293T in eine 10-cm-Schale (vorbeschichtet mit Poly-L-Lysin (Sigma)) ausgesät. Zwölf Milligramm RBP plus 12 mg F-kodierendes Plasmid von MeV, CDV oder MBaMV wurden mit PEI MAX (Polysciences) in Zellen transfiziert. VSV-deltaG-Gluc, ergänzt durch G-Protein (VSVDG-G*), wurde 8 Stunden nach der Plasmidtransfektion 1 Stunde lang mit einer MOI von 10 infiziert. Die Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und das Medium wurde 48 Stunden lang mit Opti-MEM gehalten. Der Überstand wurde gesammelt und 2 Stunden lang bei 30.000 g ultrazentrifugiert, und das Pellet wurde mit 100 µl PBS53 resuspendiert. Zur Quantifizierung des pseudotypisierten Viruseintritts wurden CHO-Zellen in einer 10-cm-Schale mit 24 mg hCD150-, dCD150- oder bCD150-exprimierenden Plasmiden mit PEI MAX transfiziert. CHO-Zellen wurden 8 Stunden nach der Transfektion auf 96-Well-Platten passagiert. Das pseudotypisierte VSV von MeV, CDV oder MBaMV wurde verwendet, um die CHO-Zellen zu infizieren. Renilla-Luciferase-Einheiten (RLUs) wurden mit dem Renilla-Luciferase-Assay-System (Promega) gemessen, um den Eintritt des Pseudotyp-Virus in Zellen zu quantifizieren.

CHO-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion zu 50.000 Zellen in einer 48-Well-Schale ausgesät. Die Zellen wurden mit 200 mg pCAGSS-RBP-HA (von MeV/CDV/MBaMV), 200 mg pCAGGS-F-AU1 (von MeV/CDV/MBaMV), pCAGGS-Igk-HA-CD150 (20 ng Mensch, 5 ng Hund oder 20 ng Fledermaus) und 50 mg pEGFP-C1 Lifeact-EGFP (gekauft von Addgene) mit 2,5 ml Polyethylenimin max (Polysciences). 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit einem Celigo-Bildgebungszytometer (Nexcelom) mit dem GFP-Kanal abgebildet und die Bilder mit einer Auflösung von 5 µm pro Pixel exportiert. Die GFP-positiven Herde (einzelne Zelle oder Synzytien) wurden von ImageJ (entwickelt von NIH) analysiert und das Profil einzelner GFP-positiver Herde mit Größeninformationen erstellt.

Zur Bewertung der Synzytiengröße haben wir zunächst die GFP-positiven Herde mit einer Größe von ≥ 10 Pixel2 gefiltert, was der mittleren Größe der GFP-Fläche in der Vertiefung der MeV-F-plus-LifeactGFP-Transfektion entspricht, um unspezifisches Hintergrundrauschen auszuschließen. Dann haben wir die Häufigkeit von Synzytien berechnet, die als GFP-Anzahl von ≥100 Pixel2 (das Zehnfache der mittleren Größe einzelner Zellen)/Gesamt-GFP-Anzahl von ≥10 Pixel2 definiert ist.

Insgesamt 50.000 Zellen in einer 96-Well-Platte wurden mit 10 µM EDTA in Dulbecco's PBS dissoziiert, gefolgt von einem 2 % FBS in Dulbecco's PBS Block. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4 °C mit primärem Antikörper behandelt, dann gewaschen und 1 Stunde lang bei 4 °C mit sekundärem Antikörper behandelt. Vero-bCD150-Zellen wurden mit einem Guava easyCyte-Durchflusszytometer (Luminex) zur Signalerkennung untersucht. Vero-hN4-Zellen wurden einem Attune NxT-Durchflusszytometer (ThermoFisher Scientific) unterzogen. Als Primärantikörper wurden jeweils ein monoklonaler Maus-Nectin-4-Antikörper (Klon N4.61, Millipore Sigma) und ein polyklonaler Kaninchen-HA-Tag-Antikörper (Novus Biologicals) in einer Verdünnung von 1:1.000 verwendet. Als Sekundärantikörper wurden Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 647 (Abcam) und Ziegen-Anti-Maus-IgG H&L Alexa Fluor 647 (Abcam) entsprechend verwendet. FlowJo wurde zur Analyse von FACS-Daten und -Präsentationen verwendet.

Die Produktion und Reinigung von löslichem CD150 erfolgt wie zuvor berichtet54. Lösliches CD150 ist eine Chimäre, die die menschlichen V- (T25 bis Y138) und Maus-C2-Domänen (E140 bis E239) + His6-Tag umfasst und in den pCA7-Vektor kloniert wurde. Das Expressionsplasmid wurde unter Verwendung von Polyethylenimin zusammen mit dem Plasmid, das das große SV40-T-Antigen kodiert, in zu 90 % konfluente HEK293S-Zellen ohne N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)-Aktivität transfiziert. Die Zellen wurden in DMEM (MP Biomedicals) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) (Invitrogen), L-Glutamin und nicht-essentiellen Aminosäuren (Gibco). Die FCS-Konzentration wurde nach der Transfektion auf 2 % gesenkt. Das His6-markierte Protein wurde 4 Tage nach der Transfektion aus dem Kulturmedium unter Verwendung der Ni2+-NTA-Affinitätssäule und der Superdex 200 GL 10/300-Gelfiltrationschromatographie (Amersham Biosciences) gereinigt. Der pH-Wert aller Puffer wurde auf 8,0 eingestellt. Löslicher CD150-Fc-Fusions-Avitag wurde von BPS Bioscience erworben und mit PBS rekonstituiert.

CD14+-Monozyten wurden aus Leukopaks isoliert, die von der New York Blood Bank unter Verwendung des EasySep Human CD14-Positivselektionskits (StemCell #17858) gekauft wurden. Zur Makrophagendifferenzierung wurden CD14+-Monozyten in einer Menge von 106 Zellen ml–1 ausgesät und in R10-Medium (RPMI, ergänzt mit FBS, HEPES, L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin) mit 50 ng ml–1 Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor ( Sigma Aldrich G5035) in einem 37 °C-Inkubator. Medien und Zytokine wurden 3 Tage nach der Aussaat ausgetauscht. Sechs Tage nach der Aussaat wurden Makrophagen entweder mit MeV oder MBaMV mit 100.000 infektiösen Einheiten (IE) pro 500.000 Zellen infiziert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 300 g spinokuliert. Das Virusinokulum wurde entfernt und die Zellen wurden in R10-Medium mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor bei 37 ° C inkubiert. Für Bildgebungsexperimente wurden Makrophagen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 30 hpi fixiert und mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) angefärbt, und Fluoreszenz- und Hellfeldbilder wurden auf dem Cytation 3-Plattenlesegerät aufgenommen. Für Durchflusszytometrie-Experimente wurden infizierte Makrophagen auf ihre Lebensfähigkeit bei 24 hpi (LIVE/DEAD fixierbarer Färbekit von Invitrogen L34976) gefärbt, mit humanem Fc-Block (BD Biosciences) behandelt und mit Antikörpern gegen CD14 (eBioscience-Klon 61d3; 1:100-Verdünnung) gefärbt ) und HLA-DR (eBioscience-Klon LN3; 1:75-Verdünnung), fixiert in 2 % PFA, permeabilisiert mit Saponin und gefärbt auf intrazelluläres CD68 (eBioscience-Klon Y1/82A; 1:100-Verdünnung) und CD150 (eBioscience; 1:75). Verdünnung). Lösliches CD150 (1 mg ml−1) oder CD150 Avi-tag (BPS Bioscience) wurden vor der Infektion für Hemmexperimente 15 Minuten lang mit MeV oder MBaMV inkubiert. Gefärbte Makrophagen wurden durch ein Attune NxT-Durchflusszytometer laufen gelassen und die Daten wurden mit der FlowJo-Software (v10) analysiert.

PBMCs wurden aus frischen Blutspenden des New York Blood Center mittels Dichtezentrifugation und einem Ficoll-Gradienten isoliert. Isolierte PBMCs wurden dann in RPMI-Medium (10 % FBS, 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin) resuspendiert und mit Concanavalin-A (ConA) bei 5 µg ml-1 72 Stunden lang zur T-Zell-Aktivierung stimuliert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und 48 Stunden lang mit 10 ng ml−1 IL2 stimuliert. Anschließend wurden die Zellen bei einer MOI von 0,2 mit MeV oder BaMV infiziert oder in Platten mit 12 Vertiefungen bei 106 Zellen ml-1 scheininfiziert. Die Zellen wurden mit 24 hpi gesammelt, mit dem LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Far-Red-Farbstoff von Invitrogen gemäß dem Protokoll des Herstellers gefärbt und mittels Durchflusszytometrie mit einem Attune NxT-Durchflusszytometer auf eGFP-Expression analysiert. Die Analyse wurde mit FCSExpress-7 durchgeführt. Für diese Analyse wurden insgesamt zwei Spender herangezogen, wobei die Daten von Spender 1 in Abb. 4 dargestellt sind.

Insgesamt wurden 1 × 106 293T-Zellen auf eine mit Kollagen beschichtete Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät. 293T-Zellen wurden mit 2 mg pCAGGS, pCAGGS-MBaMV-RBP-HA oder pCAGGS-MBaMV-F-AU1 unter Verwendung von Polyethylenimin max (Polysciences) transfiziert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mit RIPA-Puffer lysiert. Die gesammelten zytosolischen Proteine ​​wurden auf einem 4–15 %igen Polypolyacrylamidgel (Bio-Rad, Nr. 4561086) laufen gelassen und auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (Fisher Scientific, Nr. 45-004-113) übertragen, gefolgt von einer primären Antikörperreaktion und einer sekundären Antikörperreaktion. Polyklonaler Kaninchen-HA-Tag-Antikörper (Novus Biologicals, Nr. NB600-363; 1:1.000-Verdünnung) und polyklonaler Kaninchen-AU1-Epitop-Antikörper (Novus Biologicals, Nr. NB600-453; 1:1.000-Verdünnung) wurden als Primärantikörper für den HA- und AU1-Tag-Nachweis verwendet , jeweils. Als primärer Antikörper zum Nachweis von GAPDH wurde ein monoklonaler Kaninchen-Antikörper (Cell Signaling Technology, Nr. 2118; 1:1.000-Verdünnung) ausgewählt. Der mit Alexa Fluor 647 konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper (Invitrogen, Nr. A-21245; 1:2.000-Verdünnung) wurde entsprechend als Sekundärantikörper verwendet. Die Bildaufnahme erfolgte durch Chemidoc MP (Bio-Rad).

Insgesamt wurden 4,0 × 105 Vero-bCD150-Zellen mit MBaMV bei einer MOI von 0,01 infiziert. Zytosolische RNA wurde mit 500 ml TRIzol (Ambion) bei 2 dpi gesammelt. Die gesammelte zytosolische RNA wurde durch direkte RNA-Sequenz von MinION (Oxford Nanopore Technologies) mit einigen Änderungen im Protokoll sequenziert. Zuerst begannen wir mit der Bibliotheksvorbereitung aus 3 mg RNA. Zweitens haben wir SuperScript IV (Invitrogen) anstelle von SuperScript III verwendet. Die Sequenzierung wurde 48 Stunden lang unter Verwendung von R9.4-Durchflusszellen durchgeführt. Die Fastq-Datei wurde von minimap2 an der MBaMV-Genomsequenz ausgerichtet und Abdeckungsinformationen wurden von IGVtools extrahiert.

Infektion und RNA-Extraktion waren die gleichen wie oben (Transkriptomanalyse). Ein Mikrogramm RNA wurde durch TetroRT (Bioline) mit Poly-A-Primer revers transkribiert, gefolgt von einer PCR mit dem Primersatz Pedit-f (Sequenz GGGACCTGTTGCCCGTTTTA) und Pedit-r (Sequenz TGTCGGACCTCTTACTACTAGACT). Die Amplikons wurden mit dem NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Illumina) verarbeitet und mit Illumina MiSeq in einer 2 × 250 Paired-End-Konfiguration bei GENEWIZ sequenziert. Der Base Call wurde von der Illumina Control Software (HCS) auf dem Illumina-Instrument durchgeführt. Die Paired-End-Fastq-Dateien wurden von BBTools zusammengeführt. Diese zusammengeführten Fastq-Dateien wurden mit Bowtie2 an der Referenzsequenz ausgerichtet, wodurch eine SAM-Datei erstellt wurde, und wir haben die Anzahl der P-Editing-Einfügungen gezählt.

Vero-hCD150-, Vero-dCD150- und Vero-bCD150-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Zwei Gruppen gepoolter menschlicher Seren von Personen, die zuvor den MMR-Impfstoff erhalten hatten (drei Personen pro Pool), und Seren von mit CDV geimpften Frettchen (mit freundlicher Genehmigung von Richard Plemper) wurden 30 Minuten lang bei 56 °C hitzeinaktiviert. Gleiche Mengen an CDV, MeV und MBaMV (20.000 IU ml−1) wurden mit Reihenverdünnungen der hitzeinaktivierten Seren 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden den Vero-Zellen mit dem richtigen Rezeptor Virus und Seren zugesetzt und auf 37 °C gebracht. Bei 20 hpi wurden die Zellen mit einem Celigo-Bildgebungszytometer (Nexelcom) mit dem GFP-Kanal abgebildet. Exportierte Bilder wurden mit ImageJ analysiert, um das Ausmaß der Virusinfektion nach GFP+-Fläche (MeV und MBaMV) oder Gesamt-GPF+-Anzahl (CDV) zu messen. Der Prozentsatz der Infektionsreduzierung wurde berechnet, indem der Infektionsgrad in den Kontrollvertiefungen ohne Seren auf 100 % gesetzt wurde. Die normalisierten Daten wurden mit GraphPad Prism aufgezeichnet und Neutralisierungskurven wurden mithilfe einer nichtlinearen Regression mit Inhibitorkonzentration gegenüber normalisierter Reaktion erstellt. Die IC50-Werte wurden für jedes Replikat mithilfe eines robusten Anpassungsmodells berechnet. Fünf Wiederholungen wurden für die MeV- und MBaMV-Neutralisierung mit den gepoolten menschlichen Seren durchgeführt, und zwei Wiederholungen wurden mit CDV und den Frettchenseren wiederholt.

Frettchen wurden mit CDV geimpft und Serum von drei weiblichen Frettchen gesammelt und gepoolt. Dieses Serum wurde in Virusneutralisationstests verwendet. Obwohl diese Archivseren im Rahmen von IACUC-genehmigten Studien (IACUC-Protokoll A22035) gewonnen wurden, wurde die Arbeit nicht anderswo veröffentlicht. Frettchen wurden in Tierbiosicherheitsstufe 1 in einer offenen, gruppierten Käfighaltung bei 20 °C (40 % relative Luftfeuchtigkeit) mit wöchentlichem Käfigwechsel, Futter (Marshall Farms formulierte Diät) und Wasser nach Belieben sowie einer Photoperiode von 14 Stunden Licht gehalten und 10 Stunden Dunkelheit. Diese Frettchen kamen vom Lieferanten (Tripple F-Farmen) geimpft und wurden im Alter von 10 Wochen (subkutan) mit einem ribosomalen DNA-Kanarienpocken-Vektor-CDV-Impfstoff, Purevax Ferret Distemper, gemäß dem Protokoll des Herstellers geimpft (Prime plus zwei zusätzliche Dosen nach 3 Wochen). Intervalle). Den immunisierten Frettchen wurde im Alter von 8 Monaten Blut entnommen. Nachdem eine einzige Blutentnahme von 2 ml aus der Halsvene entnommen worden war, wurden die Frettchen ohne Nebenwirkungen ausgemustert.

Jamaikanische Flughunde stammen aus der Zuchtkolonie der Colorado State University, die 2006 aus gespendeten Zoofledermäusen gegründet wurde. Es handelt sich um eine Freiflugkolonie, und fortpflanzungsfähige Weibchen bringen alle etwa 5–6 Monate einen Nachwuchs zur Welt. Fledermäuse werden täglich mit frischem Obst (Melone, Wassermelone und Banane) gefüttert, ergänzt durch Affenkekse und eisenhaltiges Vogelfutter als zusätzliche Protein- und Kalorienquellen. Für die experimentelle Belastung mit dem Virus wurden Fledermäuse in einem Vogelkäfig (76 x 56 x 56 cm) gehalten, der eine vollständige Ausdehnung der Flügel und Bewegung ermöglichte. Landschaftsgewebe wird routinemäßig als Schlafsubstrat in Käfigen verwendet. Die Fledermäuse wurden einer Photoperiode von 12/12 Stunden ausgesetzt, wobei die Umgebungstemperatur bei 22 °C und die relative Luftfeuchtigkeit zwischen 35 % und 50 % gehalten wurde. Die Fledermäuse wurden durch Inhalation von 3 %igem Isofluran getötet, gefolgt von einer Thorakotomie.

Für Interferon-stimulierende Geninduktionstests wurden HEK 293T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die für ISG54-ISRE-FLuc, TK-RLuc und entweder einen leeren Vektor, MBaMV P, MVaMV V oder ZIKV MR766 NS5 kodieren. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 100 U menschlichem IFNb (bei 100 U ml−1) behandelt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der IFNb-Behandlung lysiert und die FLuc- und RLuc-Expression wurde mit dem Promega Dual-Luciferase-Assay gemessen. Die Daten wurden als Verhältnis von Fluc:RLuc berechnet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren. Es wurden zwei unabhängige Experimente mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Um den Antagonismus der IFN-Induktion (IFNb-Promotoraktivierung) zu messen, wurden HEK 293T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die für IFNb-FLuc, TK-RLuc, ein IFN-Promotor-Stimulans (entweder RIG-I, MDA5 oder MAVS), und den leeren Vektor MBaMV P kodieren , MBaMV V oder HCV NS3/4A (potenzielle IFN-Antagonisten). 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die FLuc- und RLuc-Expression wurde mit dem Promega Dual-Luciferase-Assay gemessen. Die Daten wurden als Verhältnis von Fluc:RLuc berechnet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren. Es wurden zwei unabhängige Experimente mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Zur statistischen Analyse wurde mit Prism eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnetts Mehrfachvergleichen durchgeführt.

Sechs erwachsene männliche jamaikanische Flughunde (Artibeus jamaicensis) wurden mit 2 × 105 PFU MBaMV-eGFP geimpft; Drei Fledermäuse wurden intranasal und drei Fledermäuse intraperitoneal geimpft. Eine Woche nach der Virusimpfung wurde den Fledermäusen Blut und Serum entnommen und in jeder Gruppe (intranasal und intraperitoneal) visuell auf GFP-Expression im Bereich der Nasenlöcher, der Mundhöhle und der Augen untersucht, während sie in Vogelkäfigen gehalten wurden. Zwei Wochen nach der Virusinfektion wurden Blut, Serum und Gewebe (Lunge, Milz und Leber) von einer Fledermaus in jeder Gruppe entnommen. Drei Wochen nach der Virusinfektion wurden Blut, Serum und Gewebe (Lunge, Milz und Leber) von einer Fledermaus in jeder Gruppe entnommen. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme wurden die Fledermäuse getötet und ihre Gewebe verarbeitet. Die Fledermäuse stammen aus der Brutkolonie der Colorado State University und wurden dort untergebracht.

Blut-RNA wurde mit TRIzol extrahiert. Die RNA wurde mit dem Tetro-cDNA-Synthese-Kit (Bioline) mit dem Primer „GAGCAAAGACCCCAACGAGA“, der auf das MBaMV-GFP-Genom abzielte, revers transkribiert. Anschließend wurde die Anzahl der Genome mit dem SensiFAST SYBR & Fluorescein Kit (Bioline) und dem CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System quantifiziert (Bio-Rad). Der Primersatz für qPCR ist „GGGGTGCTATCAGAGGCATC“ und „TAGGACCCTTGGTACCGGAG“.

Der Virusneutralisierungstest wurde wie folgt durchgeführt. Hitzeinaktiviertes (56 °C × 30 Min.) Fledermausserum wurde seriell dreimal verdünnt (beginnend mit einer fünffachen Verdünnung) und mit 2 × 104 PFU ml−1 MBaMV im Verhältnis 1:1 für 10 Min. bei Raumtemperatur gemischt . Einhundert Milliliter der Mischung wurden in 96 Vertiefungen auf Vero-batCD150-Zellen aufgetragen. GFP-Herde wurden mit einem Celigo-Bildgebungszytometer (Nexcelom) erkannt und gezählt. Die GFP-Zahlen der mit Serum behandelten Proben wurden durch nicht mit Serum behandelte Vertiefungen normalisiert.

Die Gewebe wurden mit 10 % gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet und dann in dünne Scheiben geschnitten. Die GFP-Immunhistochemie wurde mit VENTANA DISCOVERY ULTRA durchgeführt. Als primärer Antikörper wurde ein monoklonaler Kaninchen-Antikörper (Cell Signaling Technology, Nr. 2956) und als sekundärer Antikörper OMNIMap Anti-Kaninchen-HRP (Roche, Nr. 760-4310) verwendet. Das GFP-Signal wurde mit dem Discovery ChromoMap DAB Kit (Roche, Nr. 760-2513) sichtbar gemacht. Die Gewebe wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen wurden keine statistischen Methoden verwendet, aber unsere Stichprobengrößen ähneln den zuvor veröffentlichten. Die Datenerfassung und -analyse erfolgte nicht blind gegenüber den Versuchsbedingungen.

Das In-silico-Docking wurde mit MOE 2018.1001 (Chemical Computing Group) durchgeführt, wie zuvor beschrieben38. Ein Homologiemodell von MBaMV L wurde auf Basis der Strukturkoordinaten von PIV5-L (PDB-ID: 6V86) unter Verwendung des SWISS-MODEL-Homologiemodellierungsservers55 erstellt. Vor dem Andocken wurde das Modell des MBaMV-L-Proteins protoniert und die Energie minimiert. Ein induziertes Anpassungsprotokoll unter Verwendung des Amber10-Kraftfelds wurde implementiert, um ERDRP-0519 und GHP-88309 an MBaMV L anzudocken. Für die Bindung von ERDRP-0519 wurden die Reste Y1155, G1156, L1157, E1158 und H1288 und für die Bindung von GHP-88309 verwendet Die Reste E858, D863, D997, I1009 und Y1106 wurden als Andockziele vorab ausgewählt, von denen vorhergesagt wird, dass sie die Andockstellen von ERDRP-0519 bzw. GHP-88309 in MeV L säumen. Es wurden die Andockpositionen mit der höchsten Punktzahl ausgewählt und in Pymol an den zuvor in silico charakterisierten Andockpositionen der Inhibitoren für das MeV-L-Protein ausgerichtet. Der Sequenzabgleich der MBaMV- und MeV-L-Proteine ​​wurde mit Clustal Omega56 durchgeführt. Die Erhaltung wurde mithilfe des AL2CO-Alignment-Erhaltungsservers57,58 bewertet.

Die routinemäßige TEM-Verarbeitung wurde wie beschrieben durchgeführt. Die 3 Tage lang mit MBaMV infizierten Vero-bCD150-Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann 1 Stunde lang mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) auf Eis fixiert. Die Zellen wurden von der mit Gewebekultur behandelten 100-mm-Petrischale abgekratzt und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (400 g für 5 Minuten) pelletiert. Das Pellet wurde 30 Minuten lang mit dem gleichen Fixiermittel fixiert, bevor es 1 Stunde lang mit 2 % Osmiumtetraoxid auf Eis sekundär fixiert wurde. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur en bloc mit 2 %iger wässriger Uranyllösung angefärbt, mit einer Reihe zunehmender Ethanolgradienten dehydriert, gefolgt von einer Propylenoxidbehandlung, und in eine Embed 812-Harzmischung (Electron Microscopy Sciences) eingebettet. Die Blöcke wurden 48 Stunden lang bei 65 °C ausgehärtet und dann mit einem Diamantmesser auf einem Leica Ultracut 6 in ultradünne 70-nm-Schnitte geschnitten und auf 200-Mesh-Kupfergitter übertragen. Die Schnitte wurden mit 2 % Uranylacetat in 70 % Ethanol für 3 Minuten bei Raumtemperatur und in Bleicitrat für 3 Minuten bei Raumtemperatur gegengefärbt und dann mit einem JEOL JSM 1400 Transmissionselektronenmikroskop untersucht, das mit zwei CCD-Kameras für die digitale Bildaufnahme ausgestattet war: Veleta 2K × 2K und Quemesa 11 Megapixel (EMSIS) wurden bei 100 kV betrieben.

Alle bei der Analyse verwendeten statistischen Methoden sind in den beigefügten Abbildungslegenden aufgeführt. Die Analysen wurden mit GraphPrad Prism (v10) berechnet. Es wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal sei, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet. In Bezug auf die Fledermaus-Challenge-Studie wurde keine statistische Methode zur Vorabbestimmung der Stichprobengröße verwendet und es wurden keine Daten aus der Analyse ausgeschlossen.

Normale primäre dendritische Zellen und Makrophagen, die in diesem Projekt verwendet wurden, stammten aus „menschlichem peripherem Blut Leukopack, frisch“, das vom kommerziellen Anbieter New York Blood Center bereitgestellt wird. Die Leukapherese wurde an normalen Spendern unter Verwendung der vom institutionellen Prüfgremium genehmigten Einwilligungsformulare und Protokolle des Anbieters durchgeführt. Der Anbieter verfügt über die Zustimmung des Spenders und die gesetzliche Genehmigung, die die Genehmigung für alle Forschungszwecke erteilen sollte. Der Anbieter ist nicht am Studiendesign beteiligt und spielt in diesem Projekt keine Rolle. Die Proben wurden vom Verkäufer anonymisiert und uns zur Verfügung gestellt. Um die Privatsphäre der Spender zu schützen, gibt der Anbieter keine Spenderdaten weiter. Bei ausschließlicher Verwendung zu Forschungszwecken gilt die Einwilligung des Spenders. Aliquote gepoolter Immunseren wurden aus einer früheren anonymen Serosurvey-Studie erhalten, die gemäß den NIH Exempt Human Subjects Research-Richtlinien (Icahn School of Medicine at Mount Sinai) als Ausnahme 4 eingestuft wurde. Serumproben wurden von Innovative Research als nicht identifizierte Forschungsreagenzien erworben. Serum wurde zwischen August und November 2014 in Michigan von Spendern im Alter von 18–64 Jahren gesammelt. Für das Humanserum wurden MuV-reaktive Titer zuvor mit einem enzymgebundenen Immunosorbens-Assay gegen rekombinantes MuV-F und MuV-HN zusätzlich zu den Neutralisationstitern unter Verwendung des rekombinanten Impfstamms von MuV (JL5) bestimmt. Die in dieser Studie verwendeten Serumproben stammten von Spendern, deren Neutralisationstiter über den zuvor ermittelten Mediantitern dieser Kohorte lagen59.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die rohen NGS-Ergebnisse der Fledermausüberwachung, der P-Gen-Bearbeitung und des Transkriptoms durch MinION werden bei NCBI GEO hochgeladen: GSE166170, GSE166158 bzw. GSE166172. Unverarbeitete Bilder unserer Experimente wurden auf Figshare hochgeladen und Links sind in den Quelldaten verfügbar. Zusammengesetzte MBaMV-Sequenz- und pEMC-MBaMVeGFP-Sequenzinformationen sind bei NCBI Genbank MW557651 bzw. MW553715 verfügbar. Die Cytochromoxidase-I-Wirtssequenz und die Cytochrom-b-Wirtssequenz virusinfizierter Fledermäuse sind unter MW554523 und MW557650 verfügbar. Die Sequenz des genomischen MeV-cDNA-kodierenden Plasmids (pEMC-IC323eGFP) ist unter MW401770 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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SI wurde von der Clinical Hematology and Oncology Study Group (CHOT-SG) der Universität Fukuoka unterstützt. Diese Studie wurde teilweise durch die NIH-Zuschüsse U19 AI171403 und AI071002 (RKP und BL), AI149033 (BL und JL), AI140442 (TS), AI134768 (TS) und USAID PREDICT (SJA, JHE, PD und ED) unterstützt. JCCJAA, KYO, AP und CSS bestätigen die Unterstützung von T32 AI07647. KYO wurde zusätzlich von F31 (AI154739) unterstützt. JAA wurde zusätzlich von F31 (HL149295) unterstützt. JCC wurde zusätzlich von F32 (HL158173) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch den Japan Agent for Medical Research and Development (AMED) Grant 20wm0325002h (TH), die JSPS KAKENHI Grant-Nummer 20H03497 (TH) und das Joint Usage/Research Center-Programm des Institute for Frontier Life and Medical Sciences der Kyoto University (SI) unterstützt ). T. Yanagi von der Universität Kyushu stellte freundlicherweise die Vero-hCD150- und Vero-dCD150-Zellen zur Verfügung. M. Takeda (Nationales Institut für Infektionskrankheiten, Tokio, Japan) und V. von Messling (Bundesministerium für Bildung und Forschung, Berlin, Deutschland) stellten freundlicherweise die genomkodierenden Plasmide für MeV bzw. CDV zur Verfügung. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Satoshi Ikegame, Jillian C. Carmichael.

Abteilung für Mikrobiologie, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Satoshi Ikegame, Jillian C. Carmichael, Joshua A. Acklin, Hsin-Ping Chiu, Kasopefoluwa Y. Oguntuyo, Aum R. Patel, Shreyas Kowdle, Christian S. Stevens, Jean K. Lim, Ethan C. Veit, Matthew J. Evans & Benhur Lee

Abteilung für Ökologie, Evolution und Umweltbiologie, Columbia University, New York, NY, USA

Heather Wells

Medizinische Abteilung, Abteilung für Infektionskrankheiten, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Robert L. Furler O'Brien

Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Georgia State University, Atlanta, GA, USA

Robert M. Cox und Richard K. Plemper

Zentrum für durch Vektoren übertragene Infektionskrankheiten, Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Pathologie, College für Veterinärmedizin, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA

Miles Eckley, Shijun Zhan und Tony Schountz

Labor für medizinische Virologie, Institut für Lebens- und Medizinwissenschaften, Universität Kyoto, Kyoto, Japan

Takao Hashiguchi

Abteilung für Mikrobiologie, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Universität São Paulo, São Paulo, Brasilien

Edison Durigon

EcoHealth Alliance, New York, NY, USA

Jonathan H. Epstein und Peter Daszak

Abteilung für Pathologie, Mikrobiologie und Immunologie, UC Davis School of Veterinary Medicine, Davis, CA, USA

Simon J. Anthony

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SI, SJA und BL haben diese Studie konzipiert. SI führte in der Studie Fusionstests, Virenrettung, Wachstumsanalysen, RNA-Sequenzierung, Transkriptomanalyse und Generierung von Zelllinien durch. RLFO führte eine TEM-Bildgebung durch. JCC, JAA, ARP und JKL führten die Makrophagen- und T-Zell-Experimente sowie die Datenanalyse durch. JCC führte die Serumneutralisierungstests durch. KYO führte einen VSV-Pseudotyp-Eintrittstest durch. RMC und RKP lieferten ERDRP-0519 und GHP-88309 zusätzlich zur In-silico-Modellierung der MBaMV-LH-PC-evaluierten Proteinproduktion durch Western Blot. TH lieferte strukturbasierte Einblicke in die Erhaltung der RBP- und CD150-Bindung sowie in lösliches menschliches CD150 für den Hemmungstest. KYO und SK untersuchten die Oberflächenexpression von Morbillivirus-Rezeptoren. CSS bewertete die P-mRNA-Bearbeitungshäufigkeit anhand von NGS-Daten. TS, ME und SZ führten ein Fledermaus-Challenge-Experiment durch. ED führte in Zusammenarbeit mit JHE und PDSJA eine Fledermausüberwachung durch und HW führte eine NGS-Analyse der Fledermausüberwachung durch und holte MBaMV-Sequenzen ab. MJE und ECV führten die IFN-Reaktions- und Induktionsexperimente durch. JHE, PD und SJA lieferten Einblicke in die virale Ökologie und zoonotische Bedrohungen. BL betreute diese Studie. SI, JCC, SJA und BL haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Benhur Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Roberto Cattaneo, Bert Rimaand und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Schematische Darstellung des MBaMV-Genoms und seiner kodierten Gene. Das in dieser Studie erzeugte rekombinante MBaMV-eGFP wird ebenfalls gezeigt. Die eGFP-Transkriptionseinheit wird als „G“ (grünes Kästchen) dargestellt. # gibt die Position in L an, an der stille Mutationen eingeführt wurden, um die Expression von mutmaßlichem ORF-X zu verhindern, das in Bakterien toxisch erschien (Extended Data Abb. 3). Die Nukleotid-Skalenleiste dient als Kontext. b: Die gesamte Aminosäuresequenz des L-Proteins wurde zur Konstruktion des phylogenetischen Baums repräsentativer Viren aus den drei Hauptunterfamilien der Paramyxoviridae verwendet. Die L-Proteinsequenzen wurden zuerst durch Clusteralw ausgerichtet, dann wurde der phylogenetische Baum durch die Maximum-Likelihood-Methode unter Verwendung von MEGA 10 (Version 10.1.8) erstellt. Die Zahlen an jedem Knoten geben die Genauigkeit beim Bootstrap-Test (1.000 Mal) an. MBaMV (rote Pfeilspitze) war bis zur kürzlichen Entdeckung des Schweinemorbillivirus (PoMV) am engsten mit dem Hundestaupevirus (CDV) und dem Phozinen Staupevirus (PDV) verwandt. Die Skala gibt die Substitutionen pro Standort an. Die Zugangsnummern für die in dieser phylogenetischen Analyse verwendeten Sequenzen sind in Tabelle S2 aufgeführt.

Die prozentuale Aminosäureähnlichkeit (% AA) der MBaMV-Proteine ​​im Vergleich zu den sieben etablierten Morbilliviren wird aufgetragen, um den Grad der Konservierung innerhalb der Gattung zu veranschaulichen. N, M, F und L zeigten eine relativ hohe Konservierung (50 – 80 %) gegenüber allen Morbilliviren mit Ausnahme von FeMV. P, V, C und RBP zeigten wiederum eine 30-50-prozentige Konservierung bei allen Morbilliviren mit Ausnahme von FeMV. ClustalW wurde verwendet, um die verwandten Aminosäuresequenzen jedes Morbillivirus abzugleichen, und die prozentuale AA-Ähnlichkeit wurde unter Verwendung von Standardeinstellungen berechnet. Die Zugangsnummern der verwendeten Sequenzen sind in Tabelle S1 angegeben.

Quelldaten

Die ersten 1.500 nt des L-Gens reagierten nicht auf das Klonen. Die Untersuchung der L-Gensequenz ergab einen mutmaßlichen ORF von 86 aa im komplementären (-) Strang der ersten 1.500 nt des L-Gens (a, Originalsequenz und b, ORF-X). Um festzustellen, ob dieser mutmaßliche ORF für die Bakterien, die zum Klonen des MBaMV-Genoms verwendet werden, toxisch sein könnte, haben wir zwei Mutationen vorgenommen, die im L-ORF still waren, aber die Initiatormethionine in diesem mutmaßlichen ORF-X abschafften. Rot schattierte Nukleotide entsprechen dem dritten Codon von Methionin in ORF-X (a, gelöschtes ORF-X). Dieser „ORF-X KO“-MBaMV-Genomklon war das letztendlich gerettete Konstrukt. Die Aminosäuresequenz von ORF-X ist in (b) dargestellt.

Vero-Zellen, die Myotis brandtii CD150 (bCD150) und menschliches Nectin-4 stabil exprimieren, wurden wie in den Methoden beschrieben hergestellt. a: FACS-Färbung zur Oberflächenexpression von HA-markiertem bCD150 auf Vero-bCD150-Zellen. Der HA-Tag wurde unmittelbar nach der Signalpeptidsequenz platziert. b, zeigt die menschliche Nectin-4-Oberflächenexpression durch FACS. Als Negativ- bzw. Positivkontrollen für menschliches Nectin-4 wurden parentale Vero-Zellen und H441-Zellen (menschliche Epithelzellen der unteren Atemwege) verwendet. Mehr als 50 % der Vero-Nectin-4-Zellen exprimieren höhere Mengen an menschlichem Nectin-4 als H441-Zellen. c: Von Monozyten abgeleitete Makrophagen wurden geerntet und auf menschliches Oberflächennektin-4 gefärbt, was bestätigt, dass Makrophagen kein Nektin-4 exprimieren. Als Positivkontrolle wurden Vero-Nectin-4-Zellen verwendet.

Vero-bCD150-Zellen wurden mit MBaMV (MOI = 0,01) infiziert und bei 2 dpi gesammelte zytosolische RNA wurde einer direkten RNA-Sequenzierung unterzogen, die auf mRNAs abzielte, unter Verwendung der MinION-Plattform (Oxford Nanopore Technology). 93.917 Lesevorgänge / insgesamt 797.133 Lesevorgänge sind auf MBaMV ausgerichtet. a: Die Leseberichterstattung zeigte, dass die MbaMV-Infektion und -Replikation den für Paramyxoviren typischen 3'-zu-5'-Transkriptionsgradienten aufwies. Die Grenze jeder Transkriptionseinheit kann auch durch den steilen Abfall der Lesevorgänge erkannt werden, die mit der intergenen Trinukleotidsequenz übereinstimmen. Die mittleren (IQR) Sequenzierungsabdeckungsbereiche sind 6509 (N, 5368–7465), 3640 (P, 3193–4047), 3018 (M, 2533–3656), 929 (F, 722–1096), 535 (RBP, 491– 633) und 10 (L, 5-33). b: Das Leseabdeckungsdiagramm um die intergenische MF-Region wird vergrößert, um das ungewöhnliche intergenische Motiv von „CGU“ zu zeigen. Das intergenische Motiv zwischen allen anderen Genen ist „CUU“. c: Die Amplikon-Sequenzierung rund um die P-Gen-Editierungsstelle zeigt die Häufigkeit der P-Gen-mRNA-Editierung. 51,2 % der P-Gen-mRNAs erhielten eine einzelne „G“-Insertion an der Bearbeitungsstelle, wodurch V-mRNA entstand. Die gezeigten Zahlen sind der Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten mit Fehlerbalken, die SD (de) darstellen und die Expression von Oberflächenglykoproteinen (RBP und F) von MBaMV, MeV und CDV durch Western Blot zeigen. 5 μg Expressionsplasmide (pCAGGS, pCAGGS-RBP-HA, pCAGGS-F-AU1) wurden in 293 T in einer 6-Well-Platte transfiziert. Zytosolische Proteine ​​wurden gesammelt und auf Acrylamidgel laufen gelassen. Die AU1-Färbung (d) zeigte F-Protein voller Länge (F0; blaue Pfeilspitze) und gespaltenes F1-Produkt (rotes Sternchen). Die HA-Färbung (e) zeigte zusätzlich zum Oligomer die Expression von RBP-Monomer (blaue Pfeilspitze) bei etwa 60–70 kDa. COXIV wurde als Ladekontrolle für den Blot verwendet. Die Experimente in d) und e) wurden zweimal durchgeführt, mit ähnlichen Ergebnissen.

Quelldaten

a: 6 jamaikanische Flughunde (Artibeus jamaicensis) wurden mit MBaMV (2×105 PFU/Körper) intranasal (IN) oder intraperitoneal (IP) inokuliert. Blut, Serum und Gewebe (Lunge, Leber und Milz) wurden wie angegeben entnommen. Die GFP-Expression in den Geweben wurde durch GFP-IHC überprüft. b, MeV-infiziertes Zellpellet (Positivkontrolle) zeigte ein starkes GFP-IHC-Signal. c: Von Fledermäusen stammendes Gewebe zeigte kein GFP-Signal. Das Fledermaus-Challenge-Experiment wurde einmal abgeschlossen. Alle Maßstabsbalken sind auf 50 µM eingestellt.

Die RBP von 8 Morbilliviren und anderen repräsentativen Paramyxoviren (Sendai-Virus (SeV), Nipah-Virus (NiV), Mumps-Virus (MuV)) wurden durch Clustering abgeglichen. Ausrichtungen um die CD150-Kontaktreste werden separat in (a) 180–200 aa, (b) 490–510 aa und (c) 520–560 aa gezeigt. Stark und mäßig konservierte Rückstände in diesen Regionen sind schwarz bzw. grau schattiert. Verschlossene Reste an der RBP-CD150-Schnittstelle der MeV-Klammer-CD150-Kristallstruktur wurden durch PDBePISA identifiziert und durch die pfirsichfarbene Schattierung über der Ausrichtung angezeigt. Wasserstoffbrückenbindungen (tiefblau), Salzbrücken (rot), Wasserstoffbrückenbindungen + Salzbrücken (lila) in diesen verschlossenen Regionen sind angezeigt.

CD150 von den 8 Säugetieren, die die natürlichen Wirte der angegebenen Morbilliviren sind, werden durch Clustering ausgerichtet. Ausrichtungen um die RBP-Kontaktreste (aa60-179) werden angezeigt. Stark und mäßig konservierte Rückstände in diesen Regionen sind schwarz bzw. grau schattiert. Verschlossene Reste an der RBP-CD150-Schnittstelle (PDB: 3ALZ) wurden durch PDBePISA identifiziert und durch die pfirsichfarbene Schattierung über dem Alignment angezeigt. Wasserstoffbrückenbindungen (tiefblau), Salzbrücken (rot), Wasserstoffbrückenbindungen + Salzbrücken (lila) in diesen verschlossenen Regionen sind angezeigt. Die Farbwiedergabe ist identisch mit Extended Data Figure 7.

a) HEK 293 T-Zellen wurden mit einem ISG54-ISRE-FLuc-Plasmid und entweder MBaMV P, MBaMV V, MeV V, MeV P oder ZIKV NS5 co-transfiziert. Die Zellen wurden mit menschlichem IFNb behandelt und die ISRE-Induktion wurde durch einen Luciferase-Assay gemessen. HEK 293 T-Zellen wurden mit einem IFNb-FLuc-Plasmid, einem IFN-Promotor-Stimulans b) RIG-I, c) MDA5 und d) MAVS sowie MeV P, MeV V, MBaMV P, MBaMV V oder HCV NS3 co-transfiziert /4 A. Die IFN-Induktion wurde durch einen Luciferase-Assay in 2 unabhängigen Experimenten mit 3 technischen Replikaten (Mittelwert +/- SD) gemessen. Die spezifischen p-Werte (* p < 0,5; **** p =< 0,0001) wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit einem Dunnett-Mehrfachvergleichstest berechnet.

Quelldaten

Durchflusszytometrie-Gating-Figur.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ikegame, S., Carmichael, JC, Wells, H. et al. Metagenomik-gestützte Reverse-Genetik-Assemblierung und Charakterisierung des Myotis-Fledermaus-Morbillivirus. Nat Microbiol 8, 1108–1122 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01380-4

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Eingegangen: 09. September 2022

Angenommen: 06. April 2023

Veröffentlicht: 04. Mai 2023

Ausgabedatum: Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01380-4

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