Entdeckung zweier neuer Isoformen des menschlichen DUT-Gens

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7760 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In menschlichen Zellen wurden zwei dUTPase-Isoformen beschrieben: eine nukleare (DUT-N) und eine mitochondriale (DUT-M), mit verwandten Lokalisierungssignalen. Im Gegensatz dazu haben wir hier zwei zusätzliche Isoformen identifiziert; DUT-3 ohne Lokalisierungssignal und DUT-4 mit demselben Kernlokalisierungssignal wie DUT-N. Basierend auf einer RT-qPCR-Methode zur simultanen isoformspezifischen Quantifizierung analysierten wir die relativen Expressionsmuster in 20 menschlichen Zelllinien höchst unterschiedlicher Herkunft. Wir fanden heraus, dass die DUT-N-Isoform mit Abstand am höchsten exprimiert wird, gefolgt von der DUT-M- und der DUT-3-Isoform. Eine starke Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von DUT-M und DUT-3 legt nahe, dass diese beiden Isoformen möglicherweise denselben Promotor haben. Wir analysierten die Auswirkung von Serummangel auf die Expression von dUTPase-Isoformen im Vergleich zu unbehandelten Zellen und stellten fest, dass die mRNA-Spiegel von DUT-N in A-549- und MDA-MB-231-Zellen abnahmen, nicht jedoch in HeLa-Zellen. Überraschenderweise zeigten DUT-M und DUT-3 bei Serummangel einen signifikanten Anstieg der Expression, während das Expressionsniveau der DUT-4-Isoform keine Veränderungen zeigte. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die zelluläre dUTPase-Versorgung möglicherweise auch im Zytoplasma erfolgt und durch Hungerstress verursachte Expressionsänderungen von der Zelllinie abhängig sind.

Polymerasen können nicht zwischen dUTP und dTTP unterscheiden, da sie sich nur in einer Methylgruppe unterscheiden. Daher ist die Aufrechterhaltung des richtigen dUTP/dTTP-Verhältnisses von größter Bedeutung1. Das Enzym dUTPase ist für die Wahrung der Integrität des Genoms verantwortlich, indem es die Hydrolyse von dUTP zu dUMP und Pyrophosphat katalysiert und so dUTP aus dem dNTP-Pool eliminiert2,3. Wenn dUTP verfügbar ist, wird das eingebaute Uracil im Rahmen des Basenexzisionsreparaturmechanismus durch die Uracil-DNA-Glykosylasen gespalten4. Ein erhöhter dUTP-Spiegel kann über die Überaktivierung des DNA-Reparaturprozesses5 zum Zelltod ohne Thymin führen. Um dies zu verhindern, ist die Aktivität des dUTPase-Enzyms erforderlich. Die andere Rolle der durch dUTPase katalysierten Reaktion besteht darin, dUMP zu produzieren, das ein Substrat für die Thymidylatsynthase im De-novo-dTTP-Syntheseweg ist.

Bisher wurden in der Literatur zwei Isoformen der menschlichen dUTPase beschrieben, die sich im Zellkern bzw. im Mitochondrium lokalisieren, vermutlich um die Regulierung des dUTP-Pools in diesen beiden DNA-haltigen Organellen sicherzustellen6. Die beiden Isoformen werden vom DUT-Gen kodiert und durch alternative Promotornutzung in Verbindung mit alternativem Spleißen erzeugt7,8. Die beiden Isoformen unterscheiden sich nur im ersten Exon, da die mitochondriale Isoform (DUT-M) eine mitochondriale Targeting-Sequenz enthält, während die nukleare Isoform (DUT-N) ein nukleares Lokalisierungssignal enthält7,9,10. Die beiden Isoformen der dUTPase wurden von Ladner et al. beschrieben. mit Northern- und Western-Blot-Analyse auf mRNA- bzw. Proteinebene7. Die RNA-Expressionsniveaus der Isoformen in menschlichen 34Lu-Lungenfibroblastenzellen wurden auch unter Serummangel untersucht, der die Zellen dazu zwingt, den Zellzyklus zu verlassen und in einen Ruhezustand überzugehen. Laut Ladner et al. führt dieser Übergang zu einem drastischen Rückgang der Expression der DUT-N-dUTPase-Isoform, ohne dass sich der Spiegel der DUT-M-Isoform ändert.

Jüngste Hochdurchsatz-Sequenzierungsstudien sagten das mutmaßliche Vorhandensein zweier zusätzlicher Isoformen beim Menschen voraus, die als DUT-3 (UniProt-ID: A0A0C4DGL3, NCBI RefSeq-ID: NM_001025249.1) und DUT-4 (UniProt-ID: H0YNW5, NCBI-RefSeq-ID: NM_001330286.2) in der vorliegenden Arbeit. Sequenzdatenbanken legten nahe, dass die dritte vorgeschlagene Isoform (DUT-3) kein Lokalisierungssignal enthält und daher höchstwahrscheinlich im Zytosol zurückgehalten wird. Der stromaufwärts gelegene Teil der 5'-UTR-Region von DUT-3 ist identisch mit dem von DUT-M, jedoch fehlt die mitochondriale Leadersequenz – die im ersten Exon der DUT-M-Isoform vorhanden ist – in der DUT-3-Isoform. Es wurde vorhergesagt, dass die vierte vorgeschlagene Isoform (DUT-4) der DUT-N-Isoform sehr ähnelt und sich nur in einigen wenigen Aminosäuren am N-Terminus unterscheidet. Das erste Exon dieser Isoform befindet sich stromaufwärts von den anderen Isoformen im Genom, daher könnte seine Expression durch einen alternativen Promotor für eine möglicherweise veränderte Regulation dieser Isoform gesteuert werden. Es wurden noch keine Daten über die physiologischen Expressionsniveaus oder Rolle(n) dieser beiden neuen menschlichen dUTPase-Isoformen berichtet.

Hier präsentieren wir Genexpressionsdaten der vier Isoformen der menschlichen dUTPase in verschiedenen Krebs- und normalen menschlichen Zelllinien, um Einblick in die physiologische Rolle der neuen Isoformen zu gewinnen. RT-qPCR war unsere Methode der Wahl, um die beiden neuen Isoformen zu identifizieren und die mRNA-Expression aller vier Isoformen separat in verschiedenen Zelllinien zu quantifizieren. Zu den Vorteilen der RT-qPCR gehören die hervorragende Spezifität, der große lineare Dynamikbereich sowie die hervorragende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit11,12,13,14,15. Um eine zuverlässige RT-qPCR-Methode für die Genexpressionsanalyse zu entwickeln, sind eine gründliche Optimierung und die Verwendung geeigneter Referenzgene erforderlich16,17,18. In einem früheren Artikel haben wir neue Referenzgene in denselben menschlichen Normal- und Krebszelllinien identifiziert, die wir in dieser Studie verwenden19. Darüber hinaus verwendeten wir denselben Ansatz und führten dieselben Optimierungsschritte durch, um eine RT-qPCR-Methode zur Analyse der Genexpression der dUTPase-Isoformen zu entwickeln.

Unser Ziel war es, das mRNA-Expressionsniveau der dUTPase-Isoformen gezielt zu bestimmen. Zunächst untersuchten wir die Datenbanken Ensemble, UniProt und NCBI Reference Sequences (RefSeq) und berücksichtigten auch das Projekt Consensus CDS (CCDS). In der Ensemble-Datenbank sind 8 Protein-kodierende und 3 Nicht-Protein-kodierende Isoformen vorhanden, von denen 9 UniProt-Identifikatoren haben (P33316 [DUT-M], P33316-2 [DUT-N], A0A0C4DGL3 [DUT-3], H0YNW5 [DUT-4], H0YNJ9, H0YKC5, H0YMP1, H0YMM5, H0YKI0). Wir haben mit dem Online-Tool Clustal Omega unter Verwendung der Standardeinstellungen ein multiples Proteinsequenz-Alignment durchgeführt. Ergänzende Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Ausrichtung. Das Enzym dUTPase hat fünf konservierte Motive bei Eukaryoten, Prokaryoten, DNA-Viren und Retroviren2. Von den 9 in der UniProt-Datenbank beschriebenen Isoformen enthalten nur 4 alle konservierten Motive, einschließlich der bekannten Isoformen DUT-N und DUT-M sowie zwei neuer Isoformen, die im vorliegenden Artikel als DUT-3 und DUT-4 bezeichnet werden . Darüber hinaus sind nur diese 4 Isoformen in der NCBI RefSeq-Datenbank vorhanden (NM_001025248.2 [DUT-M], NM_001948.4 [DUT-N], NM_001025249.1 [DUT-3] und NM_001330286.2 [DUT-4]). und verfügen über CCDS-Kennungen (CCDS32231 [DUT-M], CCDS45255 [DUT-N], CCDS45256 [DUT-3] und CCDS81879 [DUT-4]). Die CCDS-Datenbank enthält Sequenzen, die konsistent annotiert und von hoher Qualität sind. Darüber hinaus untersuchten wir die menschlichen dUTPase-Isoformen in der PeptideAtlas-Datenbank20. Neben den kanonischen DUT-N- und DUT-M-Isoformen sind DUT-3 und DUT-4 die einzigen Proteine ​​mit 100 % Peptidabdeckung. Die Peptidabdeckung der anderen hypothetischen Isoformen ist unvollständig, was die zelluläre Existenz dieser Proteine ​​in Frage stellt. Zusammenfassend wollten wir nur vier funktionelle Isoformen untersuchen: DUT-M, DUT-N, DUT-3 und DUT-4.

Abbildung 1A zeigt die Promotorregion der Genomsequenz des DUT-Gens. Alle dUTPase-Isoformen werden durch alternative Promotornutzung und alternatives Spleißen erzeugt, alle Isoformen haben jedoch das gleiche 3'-Ende auf mRNA-Ebene und den entsprechenden C-Terminus auf Proteinebene. Neben der Bestimmung der Genexpressionsniveaus der vier dUTPase-Isoformen wollten wir auch die Expression aller Isoformen zusammen (DUT-all) bestimmen, indem wir Primerpaare entwarfen, die sich in der gemeinsamen Sequenz befinden. Eine ausführliche Erläuterung des für die isoformspezifische Bestimmung verwendeten Primerdesigns finden Sie unter Materialien und Methoden. Tabelle 1 enthält Schlüsselparameter der in dieser Studie verwendeten Primer. Abbildung 1B zeigt die.

Teilweise genomische Sequenz (A) und die Proteinsequenzen der dUTPase-Isoformen (B). Panel (A): Das erste Exon der DUT-4-Isoform ist in Orange dargestellt, das erste Exon der DUT-3-Isoform ist in Hellblau dargestellt. Das erste Exon der DUT-M-Isoform enthält das erste Exon der DUT-3-Isoform (hellblau) und außerdem das dunkelblaue Sequenzsegment, das nur für die DUT-M-Isoform gilt. Das erste Exon der DUT-N-Isoform wird in roten und grünen Sequenzsegmenten angezeigt, wobei die Sequenz in Rot für die DUT-N-Isoform einzigartig ist, während die Sequenz in Grün allen Isoformen gemeinsam ist. Die in der RT-qPCR verwendeten Primersequenzen sind unterstrichen. Der für die DUT-3-Isoform entwickelte intronübergreifende Vorwärtsprimer ist im grauen Hintergrund dargestellt. Der gemeinsame Reverse-Primer ist auf gelbem Hintergrund dargestellt. Die Übersetzungsinitiationsstellen (ATG) werden in kursivem Schattentext in der Farbe der entsprechenden Isoform angezeigt (DUT-M, dunkelblau; DUT-N, rot; DUT-3, hellblau; DUT-4, orange). (B) Proteinsequenz der dUTPase-Isoformen. Das dem ersten Exon entsprechende Peptidsegment ist entsprechend der Genomsequenz gefärbt, die anderen Exonsequenzen sind schwarz. Die dunkelgrün gefärbte Sequenz ist allen Isoformen außer DUT-3 gemeinsam. Die hellgrün gefärbte Sequenz ist allen Isoformen gemeinsam. Das Kernkernlokalisierungssignal (KRAR) ist unterstrichen. Abbildung wurde mit Microsoft Office 2013 erstellt.

In unserem vorherigen Artikel haben wir geeignete Referenzgene zur Normalisierung der mit RT-qPCR19 gemessenen relativen Genexpression identifiziert. In unserer aktuellen Studie verwenden wir dieselben zuvor vorbereiteten RNA-Proben. Wir haben drei biologische Replikat-RNA-Proben von 20 menschlichen Krebs- und normalen Zelllinien hergestellt. Kurz darauf wurden aus drei biologischen Replikaten normale Zelllinien und Krebszelllinien kultiviert und geerntet. Nach der Extraktion wurde die Integrität der RNA-Proben mittels Agarosegelelektrophorese untersucht. Auf dem Agarosegelbild waren zwei deutliche Banden sichtbar, die den 18S- und 28S-ribosomalen RNA-Untereinheiten entsprechen, was auf mangelnden Abbau und genomische DNA-Kontamination hinweist, also auf eine insgesamt gute Qualität der vorbereiteten RNA-Proben. Um die Konzentration und Reinheit der RNA-Proben zu bestimmen, wurden NanoDrop-Messungen durchgeführt. Die 260/280-Verhältnisse lagen im Bereich von 2,02 bis 2,11, was das Fehlen einer Proteinkontamination zeigt. Die Absorptionsverhältnisse 260/280 und 260/230 und die RNA-Ausbeuten sowie die Ergebnisse der Gelelektrophorese sind in unserem vorherigen Artikel als ergänzendes Material zusammengefasst19.

Die Leistung der Reverse-Transkription-Reaktion (RT) hängt stark vom Reverse-Transkriptase-Enzym, der Priming-Strategie und der Menge der RNA in der Reaktion ab21,22,23. Es ist von grundlegender Bedeutung, innerhalb des linearen dynamischen Bereichs der RT-Reaktion zu arbeiten, um mit qPCR zuverlässige Genexpressionsergebnisse zu erhalten. Die Untersuchung jeder Ziel-RNA ist von entscheidender Bedeutung, einschließlich der interessierenden Ziele und Referenzgene. Für die in dieser Studie verwendeten Referenzgene wurde der gleiche unten beschriebene Optimierungsprozess durchgeführt und die Ergebnisse wurden in unserem vorherigen Artikel veröffentlicht19. Wir verglichen zwei im Handel erhältliche Reverse-Transkriptions-Kits – das Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR und das High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. Nach der Herstellung einer Reihe von 6-Punkt-Vierfachverdünnungen aus einer RNA-Probe wurde die Reverse-Transkriptionsreaktion mit jedem Kit durchgeführt. Die Menge der Gesamt-RNA in der Reaktion lag zwischen 50 und 1600 ng. Die am stärksten und am wenigsten konzentrierten Punkte lagen außerhalb des linearen dynamischen Bereichs, die Linearität wurde jedoch im Bereich zwischen 100 und 800 ng RNA für alle Ziele einschließlich der Referenzgene bestätigt (Abb. 2). Wir führten eine lineare Regression der kleinsten Quadrate zum Durchschnitt der technischen Replikate im Bereich von 100–800 ng RNA durch. Das Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR führte zu niedrigeren Cq-Werten, was auf eine bessere Effizienz der reversen Transkription für alle Ziele einschließlich der Referenzgene hinweist. Im Fall der DUT-M-Isoform war die Steigung der linearen Anpassungslinie bei Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit definitiv flacher, während bei Verwendung des Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR die Steigung der linearen Anpassungslinie deutlich flacher war war ausreichend. Bei Verwendung des früheren Kits wäre die Empfindlichkeit der Bestimmung der DUT-M-Isoform deutlich beeinträchtigt. Dementsprechend wurde für weitere Experimente das Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR ausgewählt und 200 ng Gesamt-RNA verwendet.

Optimierung der Reverse-Transkriptions-Reaktion. Die aus qPCR-Messungen von RNA-Verdünnungsreihen resultierenden Cq-Werte werden im Vergleich des Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR (schwarze Linien) und des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (graue Linien) angezeigt. An jedem Konzentrationspunkt sind drei technische Replikate für beide Kits als hohle Kreise dargestellt. Die lineare Regression der kleinsten Quadrate wurde auf den Durchschnitt der technischen Replikate im Bereich der RNA-Menge von 100 bis 800 ng pro Reaktion durchgeführt. Einzelne Diagramme für (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 und für (E) DUT-alle wurden mit OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) erstellt Die Figur wurde mit CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) zusammengestellt.

Für die genaue Quantifizierung der Expression von Zielgenen ist die Bestimmung der qPCR-Effizienz für jedes Ziel von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus zeichnen sich präzise und robuste qPCR-Methoden durch eine hohe Effizienz aus24. Verdünnungsreihen von PCR-Produkten wurden erstellt und als Vorlage für die folgenden qPCR-Reaktionen unter Verwendung von drei technischen Replikaten verwendet. Mit diesem Ansatz kann ein breiter Konzentrationsbereich untersucht werden, allerdings würde die Verwendung serieller Verdünnungen der cDNA-Matrize zur Bestimmung der Effizienz den Matrixeffekt berücksichtigen25. Daher wurde die Effizienz auch mit cDNA-Template für die DUT-N-Isoform (97,7 %) und das DUT-all-Target (100 %) bestimmt. Beim Vergleich der beiden Ansätze konnten wir keinen wesentlichen Unterschied in den Effizienzwerten feststellen – 97 % für die DUT-N-Isoform und 96,1 % für das DUT-all-Target unter Verwendung von PCR-Produkten als Vorlage. Die resultierenden Cq-Werte wurden gegen die angewendete Verdünnung aufgetragen und eine lineare Regression der kleinsten Quadrate auf den Durchschnitt der technischen Replikate durchgeführt (ergänzende Abbildung S2). Die Effizienzwerte wurden aus der Steilheit der angepassten Linie26 berechnet. Die Effizienzwerte und die Regressionskoeffizientenwerte sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Um die Spezifität der PCR-Produkte in Bezug auf die vier Isoformen zu überprüfen, schickten wir PCR-Produkte zur Sanger-Sequenzierung. Da die Länge aller PCR-Produkte jedoch unter 90 Basenpaaren liegt, wurde ein verschachteltes PCR-Design angewendet27. Für jedes Ziel wurde mit einem anderen Rückwärtsprimer und dem entsprechenden Vorwärtsprimer ein längeres PCR-Produkt erzeugt und diese Produkte wurden gereinigt und mit Sanger-Sequenzierung analysiert. Die Sequenz der längeren PCR-Produkte war identisch mit der entsprechenden Sequenz in öffentlichen Datenbanken. Diese längeren PCR-Produkte enthalten die Sequenz der jeweiligen Single-Round-PCR-Produkte. Anschließend wurden die sequenzierten Produkte verdünnt und als Matrize in einer zweiten PCR-Runde verwendet – unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Primer – zusätzlich zu einer menschlichen cDNA-Matrize. Die Identität der beiden PCR-Produkte aus der verschachtelten und der Einzelrunden-PCR-Reaktion wurde durch Vergleich der Ergebnisse der Schmelzkurvenanalyse und der Agarosegelelektrophorese beurteilt. Da die Schmelzkurven identisch waren (Ergänzende Abbildung S3) und die Banden an der gleichen Position auf dem Agarosegel erschienen (Ergänzende Abbildung S4), kamen wir zu dem Schluss, dass jedes PCR-Produkt spezifisch für das beabsichtigte Ziel ist.

In unserer vorherigen Arbeit haben wir 12 Kandidaten-Referenzgene in denselben menschlichen Normal- und Krebszelllinien untersucht, die wir in der vorliegenden Studie verwenden19. Wir identifizierten SNW1 und CNOT4 als neue Kandidaten-Referenzgene auf der Grundlage der RNA-HPA-Zelllinien-Gendaten aus dem Human Protein Atlas28. Neben weit verbreiteten Referenzgenen (ACTB, GAPDH, IPO8, PPIA, PUM1, RPL30, TBP und UBC) haben wir auch HNRNPL und PCBP1 in unsere Studie einbezogen, wie von Jo et al.29 vorgeschlagen. Zur Auswertung der Ergebnisse wurden verschiedene Ansätze angewendet, z. B. GeNorm, NormFinder, BestKeeper und die vergleichenden ΔCt-Methoden. Für eine zuverlässige Normalisierung wird die Verwendung von mindestens zwei Referenzgenen empfohlen, um experimentelle Verzerrungen zu minimieren16,30,31. Basierend auf unseren Ergebnissen schlugen wir die Verwendung von IPO8, PUM1, HNRNPL, SNW1 und CNOT4 als stabile Referenzgene19 vor. Dementsprechend verwendeten wir diesen Gensatz als Referenz für die Genexpressionsanalyse der dUTPase-Isoformen. Zur Bewertung der Auswirkung von Serummangel wurden CNOT4, PUM1 und PCBP1 als Referenzgene verwendet. Proteinsequenzen für die dUTPase-Isoformen, die entsprechend der Genomsequenz gefärbt sind.

Nach der Herstellung von drei biologisch replizierten RNA-Proben aus unserem Satz menschlicher Krebs- und normaler Zelllinien wurde die Expression der dUTPase-Isoformen sowie des DUT-all-Ziels untersucht. Zu diesem Zweck wurden die in der Reverse-Transkription-Reaktion eingesetzte Gesamt-RNA-Menge und das in der qPCR-Reaktion amplifizierte cDNA-Volumen konstant gehalten. Wir verwendeten die ΔΔCq-Methode zur Berechnung der Genexpressionswerte unter Verwendung von IPO8, PUM1, HNRNPL, SNW1 und CNOT4 als Referenzgene. Die Amplifikationskurven für die Zelllinien mit der höchsten und niedrigsten relativen normalisierten Expression der dUTPase-Isoformen und des DUT-all-Ziels sind in der ergänzenden Abbildung S5 dargestellt. Basierend auf den Cq-Werten weist die DUT-N-Isoform die höchste Expression der dUTPase-Isoformen in allen untersuchten Zelllinien auf, gefolgt von der DUT-M-Isoform und der DUT-3-Isoform. Die DUT-4-Isoform hat die geringste Expression der dUTPase-Isoformen, jedoch werden die DUT-3- und die DUT-4-Isoformen in einigen der untersuchten Zelllinien in ähnlichem Ausmaß exprimiert.

Die relativen normalisierten Expressionswerte für jede dUTPase-Isoform und das DUT-all-Ziel für die zwanzig untersuchten Zelllinien sind in Abb. 3A dargestellt. Die relativen normalisierten Ausdruckswerte zusammen mit der Standardabweichung sind in der Ergänzungstabelle S1 zusammengefasst. Die relative normalisierte Expression der DUT-M- und DUT-3-Isoformen war in den Zelllinien U-937, RPMI-8226 und U-251MG am höchsten und in der Zelllinie MDA-MB-231 am niedrigsten. Im Fall des DUT-N-, des DUT-4- und des DUT-all-Ziels war die relative normalisierte Expression in den Zellen HL-60(TB), U-937, MOLT-4, RPMI-8226 und U-251MG beträchtlich hoch Linien. Beim Vergleich der humanen pluripotenten Stammzelllinie HUES-9 und der induzierten pluripotenten Stammzelllinie XCL-1 unterscheidet sich die relative normalisierte Expression jeder Isoform und des DUT-all-Ziels nicht signifikant, da die p-Werte größer oder gleich 0,4 waren auf alle Fälle. Die Expressionsniveaus der DUT-4-Isoform zeigten die größten Unterschiede zwischen den Zelllinien, mit einem 50-fachen Unterschied zwischen dem höchsten (U-937) und dem niedrigsten (HCT-116) Expressionsniveau.

Relativ normalisierte Genexpressionsdaten für die dUTPase-Ziele und Korrelationsanalyse der Cq-Werte. (A) In jedem Panel wurde der Ausdruckswert der Zelllinie mit dem niedrigsten Ausdruck auf 1 gesetzt. Die Skala der y-Achse ist logarithmisch mit der Basis 10 und wird in jedem Panel einheitlich von 1 bis 100 angezeigt. Der Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) für jede Zelllinie. Die einzelnen Farben entsprechen den in Tabelle 2 verwendeten Farben. Einzelne Diagramme wurden mit CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) erstellt. (B) Korrelationsanalyse der Cq-Werte des DUT-N mit dem DUT-all-Ziel und (C) des DUT-M mit dem DUT-3-Ziel. Der auf den Achsen angezeigte Bereich ist zur Vergleichbarkeit in beiden Diagrammen konstant. Die Werte der Regressionskoeffizienten wurden mit der linearen Regression der kleinsten Quadrate für alle Datenpunkte ermittelt. Einzelne Diagramme wurden mit OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) erstellt und die Figur wurde mit CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) zusammengestellt.

Um mögliche gemeinsame regulatorische Elemente zwischen den relativen Expressionsniveaus der verschiedenen Isoformen aufzudecken, haben wir die Korrelation der Cq-Werte jeder Kombination von zwei Zielen der dUTPase-Isoformen und des DUT-all-Ziels analysiert (ergänzende Abbildung S6). Wir fanden eine Korrelation zwischen den Cq-Werten der DUT-N-Isoform und dem DUT-all-Ziel (Abb. 3B) sowie zwischen den DUT-M- und DUT-3-Isoformen (Abb. 3C). Beide Korrelationen wurden mit Regressionskoeffizientenwerten über 0,85 charakterisiert, die mit der linearen Regression der kleinsten Quadrate für alle Datenpunkte ermittelt wurden. Im Gegensatz dazu wiesen alle anderen Kombinationen Regressionskoeffizientenwerte unter 0,62 auf, was auf mangelnde Korrelation hindeutet. Die Korrelationsanalyse lieferte drei wichtige Beobachtungen. Da DUT-N erstens die höchste Expression der dUTPase-Isoformen basierend auf den Amplifikationskurven aufweist, dominiert diese Isoform die Gesamtexpression von dUTPase, was sich in der starken Korrelation zwischen den DUT-N- und den DUT-all-Expressionsmustern widerspiegelt. Zweitens war angesichts der Tatsache, dass sowohl die DUT-M- als auch die DUT-3-Isoform vom selben Promotor transkribiert werden, eine Korrelation zwischen diesen beiden Zielen zu erwarten, und dieser Befund untermauert den Vorschlag für einen gemeinsamen Promotor für DUT-M und DUT-3 weiter. Drittens spricht das Fehlen einer Korrelation für alle Kombinationen, an denen die DUT-4-Isoform beteiligt ist, für das Vorhandensein eines alternativen Promotors, der eine unabhängige und unterschiedliche Regulierung der Expression von DUT-4 ermöglicht.

Da das Verhältnis verschiedener exprimierter Isoformen für das ordnungsgemäße Funktionieren einer Zelle wichtig sein kann, untersuchten wir das Muster der exprimierten dUTPase-Isoformen im Vergleich zur Gesamtexpression in normalen und Krebszelllinien. Wir setzen die relative normalisierte Expression einer biologischen Replikatprobe der MDA-MB-231-Zelllinie auf 1. Wir dividieren die relativen normalisierten Expressionswerte jeder Isoform durch die DUT-all relativen normalisierten Expressionswerte und den Logarithmus zur Basis 2 des Verhältnisses wurde berechnet, um eine Normalverteilung bereitzustellen. Um das Verhältnis des Expressionsniveaus der verschiedenen Isoformen zu beschreiben, haben wir diese als „Verhältnisindikatoren“ bezeichneten Werte verwendet, um zu betonen, dass die numerischen Werte nicht berücksichtigt werden dürfen, sondern nur die beobachteten Unterschiede von Interesse sind. Da die Varianz der drei biologischen Replikatproben, die in verschiedenen Zelllinien gemessen wurden, nicht gleich ist, führten wir die nichtparametrische Kruskal-Wallis-Analyse durch, gefolgt von paarweisen Conover-Iman-Vergleichen mit Bonferroni-Korrektur unter Verwendung von XLSTAT. Für jede Isoform wurden die Verhältnisindikatoren normaler Zelllinien mit der Gruppe der Krebszelllinien verglichen. Abbildung 4. veranschaulicht die Ergebnisse.

Verhältnis des relativen normalisierten Expressionsniveaus der verschiedenen Isoformen (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 zur gesamten dUTPase-Expression, gemessen mit dem DUT-all-Ziel . Alle Krebszelllinien wurden in einer Gruppe zusammengefasst, die für paarweise Vergleiche mit jeder normalen Zelllinie verwendet wurde. Krebszelllinien sind rot gefärbt. Die einzelnen Farben für die normalen Zelllinien entsprechen den in Tabelle 2 verwendeten Farben. Die y-Achse zeigt Verhältnisindikatoren, die das Verhältnis des relativen normalisierten Expressionswerts jeder Isoform zum Gesamtexpressionswert auf einer logarithmischen Skala darstellen. Der Mittelwert jeder Gruppe wird durch schwarze Linien angezeigt. Die p-Werte geben die Ergebnisse paarweiser Vergleiche an. Die Unterschiede erwiesen sich bei p < 0,0018 als signifikant und sind mit Sternchen (*) gekennzeichnet. Einzelne Diagramme wurden mit OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) erstellt und die Figur wurde mit CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) zusammengestellt.

Im Fall der DUT-N- und DUT-4-Isoformen wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Da DUT-N die höchste Expression aufweist, wurde erwartet, dass das Verhältnis dieser Isoform zur Gesamtexpression zwischen den Zelllinien nahezu gleich ist. Die DUT-4-Isoform weist die niedrigste Expression auf, ihr Verhältnisindikator zeigt jedoch ebenfalls keine signifikanten Veränderungen, sie ist unter den normalen Zelllinien recht stabil. Bei den DUT-M- und DUT-3-Isoformen wurden jedoch Unterschiede zwischen den normalen Zelllinien beobachtet. Es wurde festgestellt, dass sich die Zelllinien HEK293, HUES-9 und XCL-1 nicht wesentlich von der Gruppe der Krebszelllinien unterscheiden. Die humane pluripotente Stammzelllinie HUES-9 und die induzierte pluripotente Stammzelllinie XCL-1 zeigten ähnliche, nicht erhöhte Verhältnisindikatorwerte, was für die Ähnlichkeit dieser Zelllinien spricht. HEK293 ist eine teilweise differenzierte Vorläuferzelllinie, die mit Ad5 transformiert wurde, und dies könnte der Grund für ihre Abweichung von der normalen Zellgruppe sein. Im Gegensatz dazu zeigten die differenzierten Normalzelllinien HMEC, HUVEC/TERT2, MRC-5 und HFF-1 deutlich erhöhte Werte. Die Verhältnisindikatorwerte für die DUT-M- und die DUT-3-Isoformen zeigten parallele Veränderungen, was ein weiteres Argument für ihren gemeinsamen Promotor darstellt.

Serummangel ist eine häufig angewandte Behandlung, die in verschiedenen Forschungsbereichen zur Untersuchung menschlicher Zelllinien eingesetzt wird, um molekulare Mechanismen aufzudecken, die an verschiedenen zellulären Prozessen, Stoffwechselwegen und Auswirkungen medikamentöser Behandlungen beteiligt sind32. Zuvor wurde die relative mRNA-Expression von DUT-N und DUT-M bei Serummangel in 34Lu normalen menschlichen Lungenfibroblastenzellen von Ladner et al. untersucht. unter Verwendung der Northern-Blot-Technik7. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die mRNA-Expression von DUT-M konstitutiv war, die DUT-N-mRNA-Expression jedoch bei Serummangel deutlich abnahm. Es war von Interesse, die Expression der beiden neuen Isoformen von dUTPase sowie von DUT-N und DUT-M und auch des DUT-all-Ziels unter Serummangelbehandlung in verschiedenen Zelllinien zu untersuchen, um zu entscheiden, ob die Auswirkungen auf die Zelle zurückzuführen sind. zeilenabhängig. In Anbetracht unseres Satzes von 13 menschlichen Krebszelllinien kann ein Stillstand des Zellzyklus für die meisten Zelllinien nicht effizient erreicht werden, entweder weil das Wachstum der Zellen nicht beeinträchtigt wird oder die Lebensfähigkeit der Zellen durch Serummangel stark beeinträchtigt wird. Daher haben wir drei menschliche Krebszelllinien – HeLa, A-549 und MDA-MB-231 – ausgewählt, für die diese Behandlung anwendbar ist33. Drei biologische Replikatkulturen wurden im Fall der MDA-MB-231-Zelllinie zwei Tage lang und im Fall der HeLa- und A-549-Zelllinien vier Tage lang mit Serum behandelt. Die Zellzyklusphasenverteilung der behandelten und unbehandelten Zellkulturen wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Eine Erhöhung des Verhältnisses der Zellen in der G1-Phase wurde parallel zu einer Abnahme des Verhältnisses der Zellen in der G2- und S-Phase bei Serummangel beobachtet (ergänzende Abbildung S7). Der Anteil der Zellen in der G1-Phase in den serumarmen Zellen lag in jedem Fall über 70 %, sodass der Zellzyklusstopp erfolgreich erreicht wurde.

Die Genexpression der dUTPase-Isoformen sowie des DUT-all-Ziels wurde mittels RT-qPCR-Analyse bestimmt, indem die serumarmen Zellen mit den unbehandelten Zellen verglichen wurden (Abb. 5). Zur Normalisierung wurden drei Referenzgene – CNOT4, PUM1 und PCBP1 – basierend auf unserem vorherigen Artikel zur Untersuchung von Referenzgenen ausgewählt19. Die relative normalisierte Expression der DUT-4-Isoform blieb während des Serummangels in allen drei untersuchten Zelllinien konstant. Im Fall der DUT-M- und DUT-3-Isoformen – die vom gleichen Promotor transkribiert werden – stieg die relative normalisierte Expression in jedem Fall signifikant an. Die DUT-N-Isoform weist basierend auf den beobachteten Amplifikationskurven die höchste Expression der dUTPase-Isoformen auf. Bei Serummangel blieb die relative normalisierte Expression der DUT-N-Isoform in HeLa-Zellen konstant, nahm jedoch in A-549- und MDA-MB-231-Zellen signifikant ab. Die relative normalisierte Expression des DUT-all-Ziels änderte sich in die gleiche Richtung wie die DUT-N-Isoform, es wurde jedoch festgestellt, dass das Ausmaß der Änderung geringer war. Dieses Phänomen kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die Expression der DUT-M- und DUT-3-Isoformen bei Serummangel zunimmt und dies die Abnahme der Expression der DUT-N-Isoform ausgleichen kann. Die relativen Expressionswerte zusammen mit den Fehlerbalken für die serumarmen und unbehandelten Proben und die p-Werte sind in der Ergänzungstabelle S2 zusammengefasst.

Relative normalisierte Expression der dUTPase-Isoformen (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 und (E) des DUT-all-Ziels in HeLa (rot), A -549 (orange) und MDA-MB-231 (gelb) Zelllinien nach Serummangel und (F) Western-Blot-Analyse der dUTPase-Proteine ​​in der U-937-Zelllinie. (AE) NT, unbehandelt (einfache Säulen); SS, Serummangel (gestreifte Säulen). Die einzelnen Farben entsprechen den in Tabelle 2 verwendeten Farben. Die Skala der y-Achse ist logarithmisch zur Basis 10 und wird in jedem Panel einheitlich von 1 bis 10 dargestellt. In jedem Panel wurde die biologische Gruppe mit der niedrigsten Expression auf 1 gesetzt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) für jede Zelllinie. Die Anzahl der Sternchen weist auf eine zunehmende Wahrscheinlichkeit hin, dass sich die Genexpression bei Serummangel verändert. * p < 0,1, ** p < 0,01, *** p < 0,001, berechnet mit der CFX Maestro-Software. (F) Drei technische Replikatproben zum Nachweis von dUTPase-Proteinen mittels Western Blot. Auf der linken Seite sind die dUTPase-Zielproteine ​​und das Aktinprotein als Referenz mit Pfeilen dargestellt. Auf der rechten Seite sind die entsprechenden theoretischen Molekulargewichtswerte angegeben. Die einzelnen Bilder in voller Größe sind als Ergänzungsabbildung S8 verfügbar. Einzelne Diagramme für (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 und für (E) DUT-alle wurden mit CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) erstellt. (F) Das Bild wurde mit der Software Image Lab 4.1 (Bio-Rad) erstellt. Die Figur wurde mit CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) zusammengestellt.

Eine wichtige Erkenntnis aus der Analyse der Auswirkungen von Serummangel auf die Expressionsniveaus von dUTPase-Isoformen ist, dass durch Hunger hervorgerufene Störungen auf zelllinienspezifische Weise auftreten. Wichtig ist, dass wir, wie in der ergänzenden Abbildung S7 gezeigt, in allen Zelllinien den durch Hunger verursachten Stillstand des Zellzyklus in ähnlichem Ausmaß beobachtet haben. Daher sind die beobachteten unterschiedlichen Störungen der Expressionsniveaus der dUTPase-Isoformen nicht auf Unterschiede im Stillstand des Zellzyklus zurückzuführen. Das auffälligste Ergebnis ist, dass die HeLa-Zelllinie eine starke Widerstandsfähigkeit gegen Serummangel zeigt und die DUT-N-Isoform im Gegensatz zu den anderen Zelllinien auf einem hohen Expressionsniveau hält (Abb. 5). Das in der Literatur beschriebene Hauptkonzept besteht darin, dass dUTPase eine doppelte Rolle spielt: Sie ist sowohl für die Entfernung von dUTP zur Desinfektion des dNTP-Pools als auch für die Produktion von dUMP für die De-novo-Thymidylatsynthese von wesentlicher Bedeutung. In Übereinstimmung damit wird die am häufigsten vorkommende Isoform DUT-N hauptsächlich während der S-Phase des Zellzyklus und auf wachstumsabhängige Weise exprimiert, ähnlich wie andere Mitglieder der Nukleotidvorläuferbiosynthese und des DNA-Replikationswegs7,35,36, 37. Während des Stillstands des Zellzyklus stoppt die Proliferation, sodass Zellen keine dNTPs für die Replikation benötigen. Es kann jedoch weiterhin eine Reparatursynthese stattfinden. Die beobachtete Abnahme der Expression der DUT-N-Isoform bei Serummangel steht im Einklang mit der Rolle des Enzyms. Unsere vorliegenden Daten deuten jedoch auch darauf hin, dass dieses Schema zwar typisch sein mag, in einigen Krebszelllinien jedoch die enge Regulierung der dUTPase-Expression verloren gehen kann, da Krebszellen während der kontinuierlichen Proliferation ihre Empfindlichkeit gegenüber Signalmolekülen verlieren. Im Falle der HeLa-Zelllinie stoppt die Proliferation, das hohe Expressionsniveau der DUT-N-Isoform bleibt jedoch erhalten.

Es wurde zuvor gezeigt, dass die DUT-M-Isoform sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in 34Lu-Zellen konstitutiv exprimiert wird7. Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass in den drei untersuchten Zelllinien die Expression der DUT-M-Isoform bei Serummangel signifikant zunahm. Dieser Effekt kann für die mitochondriale Thymidylat-Biosynthese und für eine bessere Erhaltung der mitochondrialen DNA-Integrität bei Serummangel wichtig sein. Wir schließen daraus, dass die Expression der DUT-N- und DUT-M-Isoformen durch völlig unterschiedliche Mechanismen reguliert wird und auch von den Zelllinien abhängt. Wir fanden auch heraus, dass das Expressionsniveau der DUT-3-Isoform in allen untersuchten Zelllinien parallel zu den DUT-M-Expressionsniveaus Veränderungen aufweist, was ein weiteres Argument für ihren gemeinsamen Promotor darstellt. Das Fehlen signifikanter Änderungen im Expressionsniveau der DUT-4-Isoform (die das gleiche NLS wie DUT-N enthält) weist darauf hin, dass alle drei Zelllinien, die wir in dieser Hinsicht untersucht haben, vermutlich die Kernlokalisation von dUTPase auch im Hungerzustand beibehalten.

Neben der Bestimmung der mRNA-Expression von dUTPase-Isoformen untersuchten wir auch die Proteinexpression der Isoformen mittels Western-Blot-Analyse (Abb. 5F) unter Verwendung von 16 % Acrylamidgel. Das Originalbild mit 1 s Belichtungszeit, das Bild mit 40 s Belichtungszeit und das zusammengeführte Bild mit der Proteinleiter sind als ergänzende Abbildung S8 verfügbar. Wir verwendeten die Zelllinie U-937, die im Vergleich zu anderen in dieser Studie untersuchten Zelllinien die höchste Expression der DUT-N- und DUT-4-Isoformen aufweist und gleichzeitig auch eine hohe Expression der DUT-M- und DUT-3-Isoformen aufweist. Wir haben Actin als Referenz verwendet. Wir haben drei unterschiedliche Banden nachgewiesen, die den DUT-M-, DUT-N- und DUT-3-Isoformen entsprechen – in der Reihenfolge abnehmender Molekularmasse. Wir haben das theoretische Molekulargewicht der dUTPase-Isoformen mit dem Protein Molecular Mass Tool (https://www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html) berechnet und darüber hinaus auch die empirischen Werte für die drei erkannten Isoformen basierend auf berechnet Banden der Proteinleiter. Die DUT-N-Isoform weist die höchste mRNA-Expression und die höchste Proteinexpression auf, was als riesige Bande auf dem Blot sichtbar ist. Die theoretische Molekülmasse der DUT-4-Isoform (17,83 kDa) entspricht nahezu der theoretischen Molekülmasse der DUT-N-Isoform (17,75 kDa), daher kann die DUT-4-Isoform mit der Western-Blot-Technik nicht nachgewiesen werden. Die theoretische und die empirische Molekülmasse der DUT-M-Isoform (19,35 kDa bzw. 19,38 kDa) und der DUT-N-Isoform (17,75 kDa bzw. 17,68 kDa) liegen einigermaßen nahe beieinander. Die empirische Molekülmasse (15,41 kDa) der dritten nachgewiesenen Bande entspricht im Wesentlichen der theoretischen Molekülmasse (15,4 kDa) der DUT-3-Isoform, was die Identität dieser neuen Isoform bestätigt.

dUTPase ist ein allgegenwärtiges Enzym, das in allen bisher untersuchten eukaryotischen Organismen vorkommt, von Pflanzen über Hefen bis hin zu Tieren34. Die Wesentlichkeit dieses Enzyms wurde durch die Verwendung von Knock-out-Modellen gezeigt, während Knock-down-Modelle Auxotrophie oder Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Stoffen zeigen4,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45,46,47. Im Gegensatz zu ihrer unverzichtbaren Natur wurde die Isoformenverteilung der dUTPase nur in wenigen Modellorganismen untersucht. Bei Mäusen wurden eine nukleare und eine mitochondriale Isoform der dUTPase beschrieben – ähnlich wie beim Menschen6,7,27. In Drosophila melanogaster wurde gezeigt, dass eine nukleare und eine zytoplasmatische dUTPase-Isoform existieren48,49. In Saccharomyces cerevisiae wurde nur das Vorhandensein einer bifunktionellen dITP/dUTP-Diphosphatase nachgewiesen, ihre Lokalisierung wurde jedoch nicht untersucht50. In Dictyostelium discoideum wurde nur eine Isoform der dUTPase identifiziert, die ausschließlich in den Mitochondrien lokalisiert ist51. In dieser Arbeit haben wir zwei weitere Isoformen für das Enzym dUTPase auf mRNA-Ebene in einer Vielzahl menschlicher Zelllinien unterschiedlicher Herkunft identifiziert (Abb. 6). Wichtig ist, dass wir eine dieser neuen Isoformen auf Proteinebene identifiziert haben, der kein organellenlokalisiertes Signal fehlt (DUT-3). Unsere Daten deuten nun darauf hin, dass das Vorhandensein von dUTPase im Zytoplasma ein allgemeineres Phänomen und nicht nur ein Ausnahmefall bei der Fruchtfliege sein könnte. Da dNTPs tatsächlich frei durch die Kernpore diffundieren können, besteht keine explizite und eindeutige Notwendigkeit, dass das dUTPase-Enzym nuklear ist. Allerdings kann die Anwesenheit dieses desinfizierenden Enzyms im Zellkern eine effizientere Kontrolle der dUTP-Eliminierung während der DNA-Synthese ermöglichen, und dUTPase kann auch mit anderen Kernproteinen interagieren52.

Schematische Abbildung, die die Hauptaspekte dieser Studie veranschaulicht. Die dunkelblaue Farbe zeigt die DUT-M-Isoform an, die rote Farbe zeigt die DUT-N-Isoform an und die neuen Isoformen DUT-3 und DUT-4 sind hellblau bzw. orange gefärbt. In der oberen rechten Ecke sind repräsentative Verstärkungskurven dargestellt. Die Schriftgröße der Namen der Isoformen entspricht ihren relativen Ausdrucksstufen. Die hypothetische zelluläre Lokalisierung der dUTPase-Isoformen ist durch gestrichelte Linien dargestellt. Die Figur wurde mit CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) erstellt.

Im Lichte unserer vorliegenden Arbeit ist das dUTPase-Repertoire in menschlichen Zellen umfangreicher als bisher angenommen und umfasst unseren Ergebnissen zufolge vier Isoformen unter der Regulierung von drei verschiedenen Promotoren. Es bleibt zu klären, ob eine weitere Vielfalt an dUTPase-Isoformen auch in anderen Arten identifiziert werden kann. Ein Promotor reagiert empfindlich auf Hungerstress und reduziert dadurch die nuklearen und gesamten dUTPase-mRNA-Spiegel um das Fünffache. In der HeLa-Zelllinie geht diese starke Regulation jedoch verloren, was möglicherweise eine bessere Kontrolle der DNA-Uracilierung auch im Ruhezustand (z. B. bei der Reparatursynthese) ermöglicht. Unter den drei Promotoren weist derjenige, der die Synthese der DUT-4-Kern-dUTPase-Isoform antreibt, den konstitutivsten Charakter auf, was die Bedeutung der nuklearen Präsenz von dUTPase unterstreicht.

Unser Ziel war es, beliebte Zelllinien zu verwenden, die in zahlreichen Studien in der Literatur weit verbreitet sind. Zuvor haben wir die Aspekte zusammengefasst, die für die Auswahl von 13 Krebs- und 7 normalen menschlichen Zelllinien19 verwendet wurden. Genau dieselben Zelllinien wurden auch in dieser Studie verwendet. Zu den Krebszelllinien gehören HeLa, MCF-7, A-549, K-562, HL-60(TB), HT-29, MDA-MB-231, HCT 116, U-937, SH-SY5Y, U-251MG , MOLT-4 und RPMI-8226, während zu den normalen Zelllinien HEK293, MRC-5, HUVEC/TERT2, HMEC, HFF-1, HUES-9 und XCL-1 gehören.

Die Zelllinien HEK293 (CRL-1573), HeLa (CCL-2), SH-SY5Y (CRL2266), U-937 (CRL-1593.2) und die menschliche Vorhautfibroblastenzelllinie HFF-1 (SCRC-1041) wurden von ATCC erworben . Die Zelllinien A-549, HCT 116, HL-60(TB), HT-29, K-562, MCF-7, MDA-MB-231, MOLT-4, MRC-5 und RPMI-8226 wurden von erhalten Entwicklungstherapeutisches Programm des National Cancer Institute (National Institutes of Health). Mit TERT immortalisierte HMEC-Zellen wurden von der Cell Services-Abteilung des Francis Crick Institute erworben. HUVEC/TERT2 und MRC-5 waren ein großzügiges Geschenk von József Tóvári. Die humane pluripotente Stammzelllinie HUES-9 wurde freundlicherweise von Douglas Melton (HHMI) zur Verfügung gestellt. Die induzierte pluripotente Stammzelllinie XCL-1, die aus CD34 + Nabelschnurblutzellen durch episomale Vektoren umprogrammiert wurde, wurde von XCellScience (Novato, CAXIP-001-1 V) erhalten. A-549, HCT 116, HEK293, HeLa, HL-60(TB), HT-29, K-562, MCF-7, MDA-MB-231, MOLT-4, RPMI-8226, SH-SY5Y, U- 251MG- und U-937-Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium (Gibco, 72400-021), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, 10500064) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco), kultiviert , 15140-122). HFF-1-Zellen wurden auf mit Gelatine (Sigma) beschichteten Platten in DMEM-Glutamax-Medium gehalten, ergänzt mit 10 % FBS (Thermo Scientific). HMEC-Zellen wurden in MEGM Mammary Epithelial Cell Growth Medium BulletKit (Lonza, CC-3150) kultiviert. HUVEC/TERT2-Zellen wurden in EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 (Lonza, 00190860), ergänzt mit Komponenten aus dem EGM-2 Endothelial SingleQuots Kit (Lonza, CC-4176), kultiviert. MRC-5-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, 11995-065), ergänzt mit 20 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, kultiviert. HUES-9- und XCL-1-Zellen wurden auf mit Matrigel (Corning) beschichteten Platten mit sechs Vertiefungen in mTeSR-Medium (Stemcell Technologies) gehalten. Alle Zelllinien wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2-Atmosphäre kultiviert. Alle Zellkulturen waren laut PCR frei von Mykoplasmen. Adhäsionszelllinien wurden passagiert, als die Kultur eine Konfluenz von 40–50 % erreichte, um eine Kontakthemmung zu vermeiden. Suspensionszelllinien wurden alle 2–3 Tage passagiert. Zur RNA-Extraktion wurden die Zellen nach 2-tägiger Passage gesammelt.

Zur Serummangelbehandlung wurden die Zellen in RPMI 1640-Medium (Gibco, 72400-021), ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco, 15140-122), und ohne 10 % hitzeinaktiviertes FBS kultiviert. Zellen nach Serummangel wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Sigma, P3813) gewaschen, trypsinisiert und in frischem Medium, ergänzt mit 3 mM EDTA (Sigma, E9884) – und im Falle von Kulturen mit Serummangel – 10 mg/ml Rind resuspendiert Serumalbumin (BSA, Sigma, A7906). EDTA und BSA wurden in MilliQ-Wasser gelöst und die Stammlösungen wurden mit der Millex-GP Millipore Express PES-Membranfiltereinheit (Millipore) steril filtriert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 200 g mit einer Eppendorf MiniSpin-Zentrifuge (Typ 5452) zentrifugiert und mit PBS gewaschen.

Adhäsive Zellen wurden mit Trypsin-EDTA-Lösung (Sigma, T3924) trypsinisiert und in frischem Medium resuspendiert. Suspensionszellkulturen und trypsinisierte Adhäsionszellen wurden mit einer Eppendorf MiniSpin-Zentrifuge (Typ 5452) 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde in RLT-Puffer (Teil des Qiagen RNeasy Plus Mini-Kits), ergänzt mit 1 % Beta-Mercaptoethanol (Merck), resuspendiert und durch 1-minütiges Vortexen mit sterilen Glasperlen lysiert. Die lysierten Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei –20 °C aufbewahrt. Die RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Plus Mini-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Der DNase-Aufschluss auf der Säule wurde mit dem RNase-Free DNase Set (Qiagen, 79254) durchgeführt. Die RNA wurde in 50 µl nukleasefreiem Wasser (Ambion) eluiert. Die Konzentration und Reinheit, wie durch die Verhältnisse 260/280 und 260/230 angegeben, wurden mit NanoDrop ND-2000 bestimmt. Um sicherzustellen, dass in der folgenden Reverse-Transkriptionsreaktion die gleiche RNA-Menge gemessen wird, wurde die Konzentration aller RNA-Proben auf 24 ng/µl eingestellt und mit NanoDrop verifiziert. Eine Agarose-Gelelektrophorese wurde durchgeführt, um die Integrität der RNA-Proben und eine mögliche genomische DNA-Kontamination unter Verwendung von 1 % Agarose (Sigma, A9539) und TBE-Laufpuffer zu beurteilen. Gleichermaßen 600 ng RNA wurden mit Gelladefarbstoff (New England Biolabs, B7024S) gemischt und in die Vertiefungen des Gels geladen. Als Marker wurde GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM1331) verwendet. Für die Bildgebung wurde Gel Doc XR + Imager (Bio-Rad) verwendet. RNA-Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 ° C aufbewahrt.

Um die Eignung der RT-Reaktion zu beurteilen, wurden das Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR (Thermo Scientific, K1642) und das High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, 4.368.814) verglichen. Die Kits wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet und für das Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR wurde die RT-Reaktion 30 Minuten lang bei 65 °C durchgeführt. Aus der aus HCT 116-Zellen extrahierten RNA wurde eine Reihe von 6-Punkt-Zweifachverdünnungen hergestellt und mit einer Startkonzentration von 1600 ng/µl in die RT-Reaktion eingeführt. Für weitere Experimente wurde das Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR verwendet, wobei 200 ng RNA in die Reaktion eingebracht wurden. Die RT-Reaktion wurde im Applied Biosystems GeneAmp PCR-System 2700 durchgeführt. Die cDNA-Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei –20 °C aufbewahrt.

Die Transkriptionsstartstelle der DUT-4-Isoform liegt stromaufwärts von der der anderen Isoformen (Abb. 1A). Für den Nachweis der DUT-4-Isoform wurde ein Intron-flankierender Vorwärtsprimer in seinem ersten Exon entworfen, das in Orange dargestellt ist. Die DUT-M-Isoform hat wahrscheinlich denselben Promotor wie die DUT-3-Isoform, da die Transkription dieser Isoformen an derselben hellblau gefärbten Position beginnt. Die Transkription der DUT-M-Isoform wird mit der dunkelblau gefärbten Sequenz fortgesetzt, während diese Sequenz, die der mitochondrialen Targeting-Sequenz entspricht, in der DUT-3-Isoform fehlt. Der Intron-flankierende Vorwärtsprimer für die DUT-M-Isoform wurde in diesem Exon entworfen. Die Transkription sowohl der DUT-M- als auch der DUT-3-Isoform wird mit der grün gefärbten Sequenz fortgesetzt. Der intronübergreifende Vorwärtsprimer für die DUT-3-Isoform ist grau gefärbt. Die Transkription der DUT-N-Isoform beginnt mit der rot gefärbten Sequenz und wird mit der gemeinsamen Sequenz fortgesetzt. Für den Nachweis der DUT-N-Isoform wurde ein exonisches Primerdesign angewendet. Abbildung 1B zeigt die Proteinsequenz der dUTPase-Isoformen. Alle Isoformen enthalten das Kernkernlokalisierungssignal (KRAR)10 mit Ausnahme der DUT-3-Isoform, deren Translationsinitiationsstelle stromabwärts der fetten grünen gemeinsamen Sequenz liegt.

Unser Ziel war es auch, das gesamte dUTPase-mRNA-Expressionsniveau (DUT-all) zu bestimmen. Da die gemeinsame kodierende Region aller dUTPase-Isoformen der Transkriptvariante 3 (NCBI RefSeq ID: NM_001291368.4) und 4 (NCBI RefSeq ID: NM_001291369.4) des Zinkfingerproteins 534 (ZNF534) des Homo sapiens sehr ähnlich ist, den Primerpaaren für die gemeinsame Sequenz wurden so konzipiert, dass sie sich in der 3'-UTR-Region befinden. Für die spezifische Amplifikation der DUT-3-Isoform wurden die Vorwärtsprimer so konzipiert, dass sie sich an der Exon-Exon-Verbindung befinden (Intron-übergreifendes Design). Im Fall von DUT-4 und den DUT-M-Isoformen wurden die Vorwärts- und Rückwärtsprimer durch ein Intron getrennt (Intron-flankierendes Design). Das Primerdesign der oben genannten Isoformen schloss die Möglichkeit einer Verstärkung der genomischen DNA-Kontamination aus. Die DUT-N-Isoform von dUTPase wurde mithilfe eines Exon-Primer-Designs bestimmt. Für alle Ziele wurden drei oder vier Primerpaare entworfen und mit Temperaturgradienten-PCR gekoppelt mit Schmelzkurvenanalyse und Agarosegelelektrophorese verglichen, um die Spezifität der PCR-Produkte sicherzustellen. Während der Optimierung wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, während nach jeder PCR-Reaktion routinemäßig eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt wurde. Spezifische Produkte wurden als einzelne scharfe Bande auf dem Agarosegel angezeigt und durch einen einzelnen Peak bei der Schmelzkurvenanalyse charakterisiert. Falls mehr als ein Primerpaar spezifische Produkte erzeugte, wurde dasjenige mit dem niedrigsten Cq-Wert für weitere Experimente ausgewählt.

Zum Entwerfen von Primerpaaren wurde das NCBI-Primer-Design-Tool verwendet53. Die Länge des PCR-Produkts war auf 120 Basenpaare (bp)54 begrenzt. Die Schmelztemperaturen der Primer wurden auf einen Bereich von 60–63 °C eingestellt. Die Spezifität wurde mit BLAST mit den folgenden Parametern untersucht: insgesamt mindestens 5 Fehlpaarungen zu unbeabsichtigten Zielen, einschließlich mindestens 3 Fehlpaarungen innerhalb der letzten 5 bps am 3'-Ende. Ziele mit mehr als 6 Nichtübereinstimmungen wurden bei der Spezifitätsprüfung ignoriert. Die Primer wurden bei Merck mit Entsalzungsreinigung im Trockenformat bestellt und in nukleasefreiem Wasser gelöst, wobei der Empfehlung zur Herstellung von 100-µM-Lösungen gefolgt wurde. Die Konzentration der Primerlösungen wurde mit NanoDrop überprüft.

Die qPCR-Reaktion wurde in einem Endvolumen von 10 µL unter Verwendung von MyTaq HS Mix (Bioline, BIO-25046), Evagreen-Farbstoff (Biotium, 31000), nukleasefreiem Wasser, cDNA-Matrize und geeigneten Primern durchgeführt. In jeder qPCR-Reaktion wurden 0,1 µl cDNA-Probe verwendet und die Endkonzentrationen aller Primer betrugen 500 nM. Für jede Probe und jedes Zielgen wurden drei technische Replikate verwendet. Für jedes Ziel auf jeder Platte wurden zwei technische Replikate der NTC-Reaktion (No Template Control) gemessen. Für 25 % der Proben wurde zufällig keine Reverse-Transkriptionskontrolle (NRT) gemessen. Aus den RNA-Proben wurden NRT-Kontrollen unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser anstelle des RT-Enzyms und des Reaktionspuffers hergestellt. Der Unterschied zwischen den Cq-Werten des NRT/NTC und der Proben betrug in den meisten Fällen mehr als 10 und in allen Fällen mehr als 5.

Es wurden klare Hartschalen-96-Well-PCR-Platten (Bio-Rad) und Microseal „B“-PCR-Plattenversiegelungsfolie (Bio-Rad) verwendet. Der thermische Zyklus und die Detektion wurden im CFX96-Echtzeit-PCR-Detektionssystem (Bio-Rad) durchgeführt. Das Thermozyklusprotokoll umfasst die anfängliche Denaturierung und Hot-Start-Polymeraseaktivierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 50 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden und Annealing/Verlängerung bei 63 °C für 30 Sekunden. Nach der Amplifikation wurde eine Schmelzkurvenanalyse von 60 °C bis 95 °C mit einer Erhöhung von 0,5 °C alle 5 s durchgeführt. Zum Vergleich der Schmelzkurven der PCR-Produkte, die bei der Identifizierung der dUTPase-Isoformen verwendet wurden, wurde der Temperaturanstieg auf 0,2 °C eingestellt.

Zur Bestimmung der PCR-Effizienzwerte mithilfe von PCR-Produkten wurden aus drei biologischen Replikaten von HCT 116-Zellen extrahierte RNA-Proben gepoolt und für jedes Ziel in Reverse-Transkriptionsreaktionen eingeführt, gefolgt von der Amplifikation mit qPCR wie oben beschrieben. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von 2 % Agarose und TAE-Laufpuffer analysiert. Die PCR-Produkte wurden mit NucleoSpin Gel und PCR Clean-up (Macherey-Nagel, 740609) gemäß der Empfehlung des Herstellers aus dem Gel gereinigt. Die Konzentrationen der Lösungen wurden mit NanoDrop bestimmt. Es wurden Reihen von 7-Punkt-Zehnfachverdünnungen hergestellt und jeder Konzentrationspunkt in qPCR-Reaktionen im Bereich der Endkonzentration von 100 fg/µl bis 0,0001 fg/µl mit drei technischen Replikaten eingeführt. Die Cq-Werte wurden gegen den Logarithmus zur Basis 10 der Konzentration aufgetragen, die Steigung der Kurven und Regressionskoeffizienten bestimmt und die PCR-Effizienzwerte mit der Formel E(%) = [10^(1/-Steigung)- berechnet. 1]*100 %. Die aus den Messungen mit PCR-Produkten gewonnenen PCR-Effizienzwerte wurden für weitere Berechnungen verwendet.

Wir haben auch die PCR-Effizienzwerte anhand von cDNA-Proben für zwei dUTPase-Targets, DUT-N und DUT-all, und – in unserem vorherigen Artikel – für die Referenzgen-Targets IPO8, PUM1, SNW1 ermittelt. Zu diesem Zweck wurde cDNA aus biologischen Replikaten von HCT 116-Zellen gepoolt und eine 6-Punkt-Vierfachverdünnungsreihe erstellt. Die am stärksten konzentrierten Punkte enthielten 0,3 µl cDNA in jeder Vertiefung. Für jedes Ziel und jeden Konzentrationspunkt wurden drei technische Replikate angewendet. Die Ergebnisse wurden wie oben besprochen ausgewertet.

Um zunächst die Spezifität der PCR-Produkte zu überprüfen, wurde cDNA aus biologischen Replikaten von HCT 116-Zellen gepoolt und in qPCR-Reaktionen eingeführt. Die Sanger-Sequenzierung wurde für längere PCR-Produkte für jede dUTPase-Isoform durchgeführt. Der folgende Rückwärtsprimer wurde – zusammen mit den entsprechenden Vorwärtsprimern für jedes dUTPase-Ziel – verwendet, um die längeren PCR-Produkte zu erzeugen: 5'-TGGTATTGTGTAATCATAGGCACTGT-3'. Unter Verwendung dieser Ziele als Matrizen wurde eine verschachtelte PCR der zweiten Runde durchgeführt und die PCR-Produkte wurden mit den PCR-Produkten aus Einzelrunden-PCR-Reaktionen mittels Agarosegelelektrophorese und Schmelzkurvenanalyse verglichen. Für die Agarosegelelektrophorese wurden 2 % Agarose und TAE-Laufpuffer verwendet. Für jedes Gen wurden 2–4 µl PCR-Produkte mit Ladefarbstoff gemischt und auf das Gel aufgetragen. Als Marker wurden GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder und GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM0321) verwendet. Für die Bildgebung wurde Gel Doc XR + Imager verwendet. Nach jeder Amplifikation wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Falls die Schmelzkurven eine spezifische Produktbildung zeigten, wurden die Vertiefungen von der Analyse ausgeschlossen.

Die Phasenverteilung des Zellzyklus wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Zellen wurden 20 Minuten lang mit 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) in einer Konzentration von 10 µM behandelt. Die Zellen wurden wie oben beschrieben gesammelt. Die Färbung der Zellen für die DNA-Synthese wurde mit dem Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen, C10632) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Zellen wurden auch mit 10 µg/ml Propidiumiodid (Thermo Scientific) und 20 µg/ml RNase A (Sigma, 10109142001, gelöst in 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, pH = 7) in 500 µl PBS und auf DNA-Gehalt gefärbt 30 Minuten bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt inkubiert. Die Proben wurden mit dem Attune NxT-Durchflusszytometer (Thermo Fischer Scientific Waltham, MA, USA) analysiert. Das Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488-Signal wurde mit 488 nm Anregung und 530/30 nm Emission im BL1-Kanal erkannt. Das Propidium-Iodid-Signal wurde mit einer Anregung von 488 nm und einer Emission von 695/40 nm im BL3-Kanal nachgewiesen. Die Analyse der Ergebnisse wurde mit der Software Attune NxT 3.2.1 durchgeführt.

Die Zellen wurden durch 1-minütiges Vortexen in RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid, 1 % Nonidet P-40-Ersatz, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM TRIS-HCl, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mM) lysiert Benzamidin, 2 mM EDTA), ergänzt mit cOmplete ULTRA Tablets (Roche) und PhosSTOP (Roche). Das Lysat wurde zweimal 3 Minuten lang mit Entgasungsfunktion bei 4 °C (Elma S 30 H Elmasonic) beschallt und 5 Minuten lang bei 4 °C und 10621 g (Eppendorf Centrifuge 5804 R) zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung bei –20 °C gelagert. Die Proteinkonzentration der Proben wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, 23227) unter Verwendung des BioTek Synergy Mx Microplate Reader bestimmt. 15 µg Gesamtprotein wurden in jede Vertiefung geladen, nachdem 3,5 µl Ladepuffer 5X (250 mM Tris-HCl, 50 % Glycerin, 10 % DTT, 10 % SDS, 0,05 % Bromphenolblau, pH = 6,8) und RNase-freies Wasser hinzugefügt wurden Endvolumen von 17,5 µl. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und auf 16 % Polyacrylamidgel geladen. Als Proteinleiter wurde GRS Protein Marker Multicolor (GRiSP, GLP01.0500) verwendet. Die Elektrophorese wurde im Mini-PROTEAN-Elektrophoresesystem (Bio-Rad) in Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, 20 mM Glycin, 0,1 % SDS) bei 200 V für 90 Minuten durchgeführt. Für den Transfer wurde eine Immobilon-P-PVDF-Transfermembran mit einer Porengröße von 0,45 µm (Merck, IPVH09120) mit Transferpuffer (10 mM CAPS, 15 % Methanol, pH = 11) bei 250 mA für 3 Stunden verwendet. Die Membran wurde auf Filterpapier getrocknet und nach dem Transfer geschnitten und in TBS-T (25 mM TRIS HCl, 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 0,05 % Tween-20, pH = 7,4) gelegt. Blockierung und Immunfärbung wurden in 5 % Magermilchpulver in TBS-T durchgeführt. Nach einstündiger Blockierung wurde über Nacht eine Inkubation mit primären Antikörpern durchgeführt (polyklonaler Anti-Actin (20–33)-Antikörper, hergestellt in Kaninchen (Sigma, A5060), monoklonaler Anti-dUTPase-Antikörper, hergestellt in Ratten (Sigma, SAB4200044)). Nach dreimaligem 10-minütigem Waschen der Membranen mit TBS-T wurde eine 2-stündige Inkubation mit sekundären Antikörpern durchgeführt, die vor Licht geschützt waren (Anti-Kaninchen-IgG (GE Healthcare, Na934vs) für Aktin, Anti-Ratten-IgG (Sigma, A9542) für dUTPase). Nach erneutem dreimaligem Waschen der Membranen für 10 Minuten mit TBS-T wurden die Membranen bis zur Bildgebung in TBS-Puffer gelegt. Die Banden wurden mit Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck, WBKLS0100) sichtbar gemacht. Die Bildgebung wurde mit dem ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) durchgeführt.

Für die Genexpressionsanalyse wurde die Software CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) verwendet (URL: https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-maestro-software-for-cfx-real -Zeit-PCR-Instrumente). Der Schwellenwert wurde für jede gemessene Platte einheitlich auf 500 relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) eingestellt. Gelbilder wurden mit der Software Image Lab 4.1 (Bio-Rad) aufgenommen (URL: https://www.bio-rad.com/en-hu/product/image-lab-software). Diagramme wurden mit OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) erstellt (URL: https://www.originlab.com/2018). Zur Erstellung von Abbildungen aus einzelnen Diagrammen wurde die CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) verwendet (URL: https://www.coreldraw.com/en/product/coreldraw/).

Um das Verhältnis der relativen normalisierten Expression der dUTPase-Isoformen zur Gesamtexpression zu beurteilen, wurden paarweise Vergleiche zwischen jeder normalen Zelllinie und der Gruppe der Krebszelllinien durchgeführt. Die relativ normalisierten Expressionsdaten wurden aus CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) extrahiert. Der Logarithmus des Verhältnisses des relativen normalisierten Ausdrucks jeder Isoform zum Gesamtausdruck (gemessen mit dem DUT-all-Ziel) wurde berechnet und als Verhältnisindikator bezeichnet. Da die Varianz der drei in verschiedenen Zelllinien gemessenen biologischen Replikatproben nicht gleich ist, führten wir die nichtparametrische Kruskal-Wallis-Analyse durch, gefolgt von paarweisen Conover-Iman-Vergleichen mit Bonferroni-Korrektur unter Verwendung von XLSTAT (Lumivero). Nach der Bonferroni-Korrektur wurden p-Werte als signifikant unter 0,0018 definiert. Für das Serummangelexperiment wurden die p-Werte mit der CFX Maestro-Software berechnet.

Während der aktuellen Studie wurden keine Datensätze generiert oder analysiert. Auf Anfrage sind Rohdaten über die E-Mail-Adresse [email protected] verfügbar.

Gaidamaviciute, E., Tauraite, D., Gagilas, J. & Lagunavicius, A. Ortsgerichtete chemische Modifikation der archaealen Thermococcus litoralis Sh1B-DNA-Polymerase: Erworbene Fähigkeit, Template-Strang-Uracile zu lesen. Biochim. Biophys. Acta – Proteins Proteomics 1804, 1385–1393 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Vértessy, BG & Tóth, J. Uracil aus der DNA fernhalten: Physiologische Rolle, Struktur und katalytischer Mechanismus von dUTPasen. Acc. Chem. Res. 42, 97–106 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hirmondo, R., Lopata, A., Suranyi, EV, Vertessy, BG & Toth, J. Differenzielle Kontrolle der dNTP-Biosynthese und Aufrechterhaltung der Genomintegrität durch die Enzyme der dUTPase-Superfamilie. Wissenschaft. Rep. 7, 6043 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dengg, M. et al. Die Aufhebung des CLK-2-Kontrollpunkts führt zu einer Toleranz gegenüber Zwischenprodukten der Basenexzisionsreparatur. EMBO Rep. 7, 1046–1051 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Webley, SD, Welsh, SJ, Jackman, AL & Aherne, GW Die Fähigkeit zur Akkumulation von Desoxyuridintriphosphat und die zelluläre Reaktion auf die Hemmung der Thymidylatsynthase (TS). Br. J. Cancer 85, 446–452 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ladner, RD, McNulty, DE, Carr, SA, Roberts, GD & Caradonna, SJ Charakterisierung verschiedener nuklearer und mitochondrialer Formen der menschlichen Desoxyuridintriphosphat-Nukleotidohydrolase. J. Biol. Chem. 271, 7745–7751 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ladner, RD & Caradonna, SJ Das menschliche dUTPase-Gen kodiert sowohl nukleare als auch mitochondriale Isoformen. J. Biol. Chem. 272, 19072–19080 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cohen, D. et al. Zuordnung des menschlichen dUTPase-Gens (DUT) zum Chromosom 15q15-q21. 1 durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Genomics 40, 213–215 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Róna, G. et al. Die Dynamik der Rekonstitution des menschlichen Kernproteoms nach der Zellteilung wird durch NLS-benachbarte Phosphorylierung reguliert. Zellzyklus 13, 3551–3564 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Róna, G. et al. Phosphorylierung neben dem Kernlokalisierungssignal der menschlichen dUTPase hebt den Kernimport auf: Strukturelle und mechanistische Erkenntnisse. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 69, 2495–2505 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Ginzinger, DG Genquantifizierung mittels quantitativer Echtzeit-PCR. Exp. Hämatol. 30, 503–512 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bustin, SA, Benes, V., Nolan, T. & Pfaffl, MW Quantitative Echtzeit-RT-PCR: Eine Perspektive. J. Mol. Endokrinol. 34, 597–601 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bustin, S. Absolute Quantifizierung von mRNA mithilfe von Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionstests. J. Mol. Endokrinol. 25, 169–193 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pfaffl, MW & Hageleit, M. Gültigkeiten der mRNA-Quantifizierung unter Verwendung externer Kalibrierungskurven für rekombinante RNA und rekombinante DNA in der Echtzeit-RT-PCR. Biotechnologie. Lette. 23, 275–282 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Bennett, J., Hondred, D. & Register, JC Sicherstellen, dass die qRT-PCR streng und biologisch relevant bleibt. Plant Cell Rep. 34, 1–3 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bustin, SA et al. Die MIQE-Richtlinien: Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente. Klin. Chem. 55, 611–622 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bustin, SA & Nolan, T. Fallstricke der quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion. J. Biomol. Technik. 15, 155–166 (2004).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Derveaux, S., Vandesompele, J. & Hellemans, J. Wie man eine erfolgreiche Genexpressionsanalyse mit Echtzeit-PCR durchführt. Methoden 50, 227–230 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rácz, GA, Nagy, N., Tóvári, J., Apáti, Á. & Vértessy, BG Identifizierung neuer Referenzgene mit stabilen Expressionsmustern für Genexpressionsstudien an menschlichen Krebs- und normalen Zelllinien. Sci. Rep. 11, 19459 (2021).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desiere, F. et al. Das Peptidatlas-Projekt. Nukleinsäuren Res. 34, D655–D658 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ståhlberg, A., Håkansson, J., Xian, X., Semb, H. & Kubista, M. Eigenschaften der Reverse-Transkriptionsreaktion bei der mRNA-Quantifizierung. Klin. Chem. 50, 509–515 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Miranda, JA & Steward, GF Variablen, die die Effizienz und Interpretation der quantitativen Reverse-Transkription-PCR (RT-qPCR) beeinflussen: Eine empirische Studie mit dem Bakteriophagen MS2. J. Virol. Methoden 241, 1–10 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cholet, F., Ijaz, UZ & Smith, CJ Reverse-Transkriptase-Enzym und Priming-Strategie beeinflussen Quantifizierung und Diversität von Umwelttranskripten. Umgebung. Mikrobiol. 22, 2383–2402 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nolan, T., Hands, RE & Bustin, SA Quantifizierung von mRNA mittels Echtzeit-RT-PCR. Nat. Protokoll. 1, 1559–1582 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pfaffl, MW Quantifizierungsstrategien in der Echtzeit-PCR. in The Real-Time PCR Encyclopaedia A–Z of Quantitative PCR (Hrsg. Bustin, S.) 87–112 (La Jolla, CA: International University Line, 2004).

Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, MW & Kubista, M. Wie gut ist eine PCR-Effizienzschätzung: Empfehlungen für präzise und robuste qPCR-Effizienzbewertungen. Biomol. Erkennen. Quantif. 3, 9–16 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rácz, GA et al. Bewertung kritischer Designparameter für die RT-qPCR-basierte Analyse mehrerer dUTPase-Isoform-Gene in Mäusen. FEBS Open Bio 9, 1153–1170 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Uhlen, M. et al. Ein Pathologieatlas des menschlichen Krebstranskriptoms. Science 357, eaan2507 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Jo, J. et al. Herkömmlich verwendete Referenzgene eignen sich nicht hervorragend zur Normalisierung der Genexpression in der Krebsforschung am Menschen. BMC Bioinform. 20, 245 (2019).

Artikel Google Scholar

Jin, P. et al. Auswahl und Validierung endogener Referenzgene mithilfe eines Hochdurchsatzansatzes. BMC Genomics 5, 55 (2004).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vandesompele, J. et al. Genaue Normalisierung quantitativer Echtzeit-RT-PCR-Daten durch geometrische Mittelung mehrerer interner Kontrollgene. Genombiol. 3, 1 (2002).

Artikel Google Scholar

Pirkmajer, S. & Chibalin, AV Serummangel: Vorsichtsmaßnahme. Bin. J. Physiol. Physiol. 301, C272–C279 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Sandag, Z. et al. Hemmende Rolle von TRIP-Br 1/XIAP bei der Nekroptose unter Nährstoff-/Serummangel. Mol. Zellen 43, 236–250 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kerepesi, C. et al. Leben ohne dUTPase. Vorderseite. Mikrobiol. 7, 1768 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, MV & Studebaker, AW Herunterregulierung der menschlichen Desoxyuridintriphosphat-Nukleotidhydrolase (dUTPase) mithilfe von Small Interfering RNA (siRNA). Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids 23, 1467–1470 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Studebaker, AW, Lafuse, WP, Kloesel, R. & Williams, MV Modulation der menschlichen dUTPase unter Verwendung kleiner interferierender RNA. Biochem. Biophys. Res. Komm. 327, 306–310 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Merényi, G. et al. Die zelluläre Reaktion auf eine effiziente dUTPase-RNAi-Stummschaltung in stabilen HeLa-Zelllinien stört die Expressionsniveaus von Genen, die am Thymidylatstoffwechsel beteiligt sind. Nukleoside. Nucleotides Nucleic Acids 30, 369–390 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Gadsden, MH, McIntosh, EM, Game, JC, Wilson, PJ & Haynes, RH dUTP-Pyrophosphatase ist ein essentielles Enzym in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 12, 4425–4431 (1993).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guillet, M., Van Der Kemp, PA und Boiteux, S. Die dUTPase-Aktivität ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität in Saccharomyces cerevisiae. Nukleinsäuren Res. 34, 2056–2066 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siaud, N. et al. Das SOS-Screening bei Arabidopsis: Eine Suche nach Funktionen, die am DNA-Metabolismus beteiligt sind. DNA-Reparatur (Amst). 9, 567–578 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dubois, E. et al. Die homologe Rekombination wird durch eine Abnahme der dUTPase in Arabidopsis stimuliert. PLoS ONE 6, e18658 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alam, MS, Moriyama, H. & Matsumoto, M. Die Hemmung des Dr-dut-Gens verursacht DNA-Schäden bei Planarien. Mol. Reproduktion. Entwickler 85, 188–196 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kumar, H. et al. Funktionelle genetische Bewertung von DNA-Hausreinigungsenzymen im Malariaparasiten: dUTPase und Ap4AH sind in Plasmodium berghei essentiell, aber ITPase und NDH sind entbehrlich. Expertenmeinung. Dort. Ziele 23, 251–261 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pálinkás, H. et al. CRISPR/Cas9-vermittelter Knock-out der dUTPase bei Mäusen führt zu früher embryonaler Letalität. Biomolecules 9, 136 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Castillo-Acosta, VM, Estévez, AM, Vidal, AE, Ruiz-Perez, LM und González-Pacanowska, D. Die Erschöpfung der dimeren all-α-dUTPase induziert DNA-Strangbrüche und beeinträchtigt das Fortschreiten des Zellzyklus bei Trypanosoma brucei. Int. J. Biochem. Zellbiol. 40, 2901–2913 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Castillo-Acosta, VM et al. Eine erhöhte Insertion von Uracil in die DNA ist zytotoxisch und erhöht die Häufigkeit von Mutationen, der Bildung von Doppelstrangbrüchen und dem VSG-Wechsel bei Trypanosoma brucei. DNA-Reparatur (Amst). 11, 986–995 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Castillo-Acosta, VM et al. Pyrimidinbedarf in Desoxyuridintriphosphat-Nukleotidhydrolase-defizienten Trypanosoma brucei-Mutanten. Mol. Biochem. Parasit. 187, 9–13 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Békési, A. et al. Entwicklungsregulierung der dUTPase in Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem. 279, 22362–22370 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Muha, V., Zagyva, I., Venkei, Z., Szabad, J. & Vértessy, BG Signalabhängige und -unabhängige Bewegungen der nuklearen Lokalisierung von dUTPase-Isoformen von Drosophila melanogaster während der Kernspaltung. Biochem. Biophys. Res. Komm. 381, 271–275 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tchigvintsev, A. et al. Struktur und Aktivität der dUTP-Pyrophosphatase DUT1 aus Saccharomyces cerevisiae, einem essentiellen Haushaltsenzym. Biochem. J. 437, 243–253 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chia, CP, Inoguchi, N., Varon, KC, Bartholomai, BM & Moriyama, H. Mitochondriale Lokalisierung der dUTPase aus Dictyostelium discoideum, vermittelt durch ihren N-Terminus. BMC Res. Anmerkungen 13, 16 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, R., Lin, Y., Rao, MS & Reddy, JK Klonierung und Identifizierung von Ratten-Desoxyuridintriphosphatase als Inhibitor des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptors α. J. Biol. Chem. 271, 27670–27676 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ye, J. et al. Primer-BLAST: Ein Tool zum Entwerfen zielspezifischer Primer für die Polymerase-Kettenreaktion. BMC Bioinform. 13, 134 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Debode, F., Marien, A., Janssen, É., Bragard, C. & Berben, G. Der Einfluss der Amplikonlänge auf Echtzeit-PCR-Ergebnisse. Biotechnologie. Agron. Soc. Env. 21, 3–11 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde hauptsächlich vom Nationalen Büro für Forschung, Entwicklung und Innovation Ungarns unterstützt (K119493, K135231, VEKOP-2.3.2-16-2017-00013 an BGV, NKP-2018-1.2.1-NKP-2018-00005). und das TKP2021-EGA-02-Stipendium, umgesetzt mit Unterstützung des ungarischen Ministeriums für Kultur und Innovation aus dem Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsfonds, finanziert im Rahmen des TKP2021-EGA-Förderprogramms. Diese Arbeit wurde auch vom ungarischen Fonds für wissenschaftliche Forschung unterstützt (OTKA-K128011 an VGy und OTKA-K128369 an AÁ). Diese Studie wurde auch vom ungarischen Thematic Excellence Program (TKP2020-NKA-26) unterstützt. Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch das National Laboratories Excellence-Programm (im Rahmen des National Tumorbiology Laboratory Project (2022-2.1.1-NL-2022-00010 an JT)) und das ungarische thematische Exzellenzprogramm (TKP2021-EGA-44 an JT). Die Autoren danken Beáta Haraszti für die technische Unterstützung.

Open-Access-Förderung durch die Technische und Wirtschaftswissenschaftliche Universität Budapest.

Abteilung für Angewandte Biotechnologie und Lebensmittelwissenschaften, Fakultät für Chemische Technologie und Biotechnologie, BME Budapester Universität für Technologie und Wirtschaft, Műegyetem Rkp. 3., Budapest, 1111, Ungarn

Gergely Attila Rácz & Beáta G. Vértessy

Institut für Enzymologie, Forschungszentrum für Naturwissenschaften, ELKH Eötvös Loránd Forschungsnetzwerk, Budapest, Ungarn

Gergely Attila Rácz, Nikolett Nagy, György Várady, Ágota Apáti & Beáta G. Vértessy

Doctoral School of Biology, Institut für Biologie, ELTE Eötvös Loránd Universität, 1117 Budapest Pázmány Péter Sétány 1/C, Budapest, Ungarn

Nikolett Nagy

Abteilung für experimentelle Pharmakologie, Nationales Institut für Onkologie, Ráth Gy. U. 7-9, Budapest, 1122, Ungarn

József Tóvári

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GAR und BGV konzipierten das Projekt und gestalteten die Experimente. GAR und NN führten die Experimente durch und analysierten die Ergebnisse. Die BGV betreute das Projekt. JT und Á.A. stellte Materialien und Fachwissen zur Kultivierung normaler Zelllinien zur Verfügung. GV führte die Durchflusszytometrieanalyse durch. GAR, NN und BGV haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren überprüften das Manuskript und gaben kritisches Feedback.

Korrespondenz mit Gergely Attila Rácz oder Beáta G. Vértessy.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rácz, GA, Nagy, N., Várady, G. et al. Entdeckung zweier neuer Isoformen des menschlichen DUT-Gens. Sci Rep 13, 7760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1

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Eingegangen: 30. Juni 2022

Angenommen: 05. April 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1

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