Eine probiotische Störung des Quorum Sensing verringert die Virulenz und erhöht die Cefoxitin-Empfindlichkeit in Methicillin

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4373 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Therapien, die auf Quorum-Sensing-Systeme (QS) abzielen, die die Virulenz bei Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) regulieren, sind eine vielversprechende Alternative zu Antibiotika. QS-Systeme spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der MRSA-Antibiotikaresistenz, der Exotoxinproduktion, dem antioxidativen Schutz und der Umgehung von Immunzellen und sind daher attraktive therapeutische Ziele zur Reduzierung der Virulenz eines Krankheitserregers. In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen bioaktiver Peptide, die aus zwei Milchsäurebakterienstämmen isoliert wurden, auf Antibiotikaresistenz, Carotinoidproduktion, Resistenz gegen oxidative Abtötung und Biofilmstruktur in zwei klinischen MRSA-Isolaten getestet. Die Ergebnisse der fraktionierten Hemmkonzentrationstests mit großen und halbgereinigten bioaktiven Molekülen zeigten einen signifikanten synergistischen Effekt, der die Cefoxitin-vermittelte Abtötung von MRSA steigerte. Dies war mit einer sechsfachen Abnahme des Hauptmembranpigments Staphyloxanthin und einer 99-prozentigen Erhöhung der Anfälligkeit für durch oxidativen Stress verursachte Abtötung verbunden. Eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse der QS-Gene agrA und luxS zeigte eine unterschiedliche Expression zwischen MRSA-Stämmen und eine signifikante Herunterregulierung des Hämolysin-Gens hla. Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie zeigten eine Veränderung der Biofilmbildung und des Clusterverhaltens. Diese Ergebnisse zeigen, dass bioaktive Metaboliten wirksam zusammen mit Beta-Lactam-Antibiotika eingesetzt werden können, um MRSA gegenüber Cefoxitin zu sensibilisieren. Darüber hinaus zeigten diese Ergebnisse, dass mehrere wichtige QS-kontrollierte Virulenzmechanismen durch probiotische Metaboliten verringert werden.

Der übermäßige Einsatz von Antibiotika hat in der Vergangenheit durch die Selektion auf neu auftretende Resistenzen zum Anstieg antibiotikaresistenter Bakterien beigetragen1, und es ist auch nicht länger zu erwarten, dass die Abhängigkeit von Antibiotika-Monotherapien mit den neu entstehenden resistenten Bakterienstämmen Schritt halten kann2,3. Eine Strategie zur Bewältigung der Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen besteht darin, den Selektionsdruck zu verringern, der zur Entstehung von Resistenzen beiträgt, indem der Einsatz etablierter antimikrobieller Mittel eingeschränkt wird4. Folglich liegt ein größerer Schwerpunkt auf der Erforschung von Alternativen zu herkömmlichen Monotherapien mit Antibiotika3,5. Insbesondere alternative Therapeutika, die das bakterielle Quorum Sensing (QS) und die Zell-zu-Zell-Kommunikation beeinträchtigen, sind ein vielversprechender Ansatz, um die Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen besser zu bewältigen. Bakterielle QS-Systeme nutzen hochentwickelte Regulierungsmechanismen, um die bakterielle Pathogenese zu unterstützen, indem sie die Expression von Virulenzgenen an die schwankende Umgebung des Wirts während der Infektion anpassen. Bei niedrigen Krankheitserregerdichten sind die Signalmoleküle, die für die Kommunikation zwischen Zellen verwendet werden, in geringer Konzentration vorhanden, reichern sich jedoch mit zunehmender Zellpopulationsdichte bis zu einer Schwellenkonzentration an. Sobald die Schwelle erreicht ist, werden die QS-Signalmoleküle über spezifische Transporter von der Zelle aufgenommen und Transkriptionsregulatoren aktiviert, die wiederum die in diesem Stadium der Pathogenese erforderlichen Virulenzgene induzieren6. QS-Systeme sind nicht direkt an wesentlichen Stoffwechselprozessen beteiligt und zumindest theoretisch würden diese nichttötenden Alternativen einen geringeren Selektionsdruck auf Krankheitserreger mit der Fähigkeit zur Resistenzausprägung ausüben7,8. Da QS-Systeme außerdem häufig eine entscheidende Rolle bei typischen Merkmalen und Verhaltensweisen von Bakterien spielen, die zu ihrer Gesamtvirulenz beitragen, wie z. B. der Toxinproduktion und der Umgehung von Immunzellen, sind QS-Disruptoren interessante therapeutische Kandidaten im Kampf gegen bakterielle Infektionen und Sepsis9,10.

Eine dieser neuartigen Alternativen, die sich in jüngster Zeit als Anwärter auf die Bekämpfung pathogener Bakterien herausgestellt hat, ist der Einsatz probiotischer Bakterien und ihrer Metaboliten, die als QS-Disruptoren wirken8. Obwohl es kaum wissenschaftliche Belege für die Vorteile von Probiotika für die Gesundheit von Mensch und Tier gibt, haben neuere Arbeiten mehrere Mechanismen aufgeklärt, durch die Probiotika direkt in die Virulenz von Krankheitserregern eingreifen. Von Lactobacillus acidophilus produzierte Stoffwechselpeptide reduzieren nachweislich die Virulenz pathogener Bakterienstämme, indem sie deren Verwendung von QS zur Wahrnehmung und Kommunikation in ihrer Umgebung reduzieren: ein entscheidender Faktor für die Fähigkeit des Krankheitserregers, Toxine zu produzieren, in Wirtszellen einzudringen, Immunzellen auszuweichen usw bilden Biofilme11,12. Es wurde auch gezeigt, dass Metaboliten, die aus dem zellfreien verbrauchten Medium (CFSM) von Bifidobacterium-Kulturen isoliert wurden, die wichtigsten regulatorischen Gene herunterregulieren, die die Virulenzfaktoren steuern, die für die Bindung und Adhäsion in Salmonella enterica Serovar Typhimurium und enterohämorrhagischem Escherichia coli O157:H713,14 erforderlich sind. Insbesondere wurde in vivo gezeigt, dass das Probiotikum Bacillus subtilis Quorum-Quenching-Metaboliten produziert, die erheblich zum Ausschluss des kommensalen Krankheitserregers Staphylococcus aureus im Darm ländlicher thailändischer Bevölkerungen beigetragen haben15.

Staphylococcus aureus ist ein grampositiver Erreger, der Anlass zu großer Sorge gibt. Grampositive Bakterien nutzen autoinduzierende Oligopeptide in interzellulären QS-kontrollierten Genexpressionssystemen, und die Kommunikation über diese undurchlässigen Autoinduktoren wird durch spezialisierte Rezeptoren vermittelt. Der akzessorische Genregulator (agr)-Weg ist eines der am besten beschriebenen QS-Systeme in S. aureus und umfasst eine Zweikomponenten-Rezeptor-Histidinkinase (AgrC) und ihren Transkriptionsreaktionsregulator (AgrA)16. Das Agr-System wird von der Zellpopulationsdichte beeinflusst und reguliert die Virulenzexpression, wie sie von S. aureus in den verschiedenen Infektionsstadien benötigt wird17. Es wurde auch gezeigt, dass AgrA über eine Oxidationserkennungsfähigkeit verfügt, die für die Abwehr von S. aureus gegen oxidativen Stress und die Umgehung von Immunzellen von entscheidender Bedeutung ist18, und dass das Agr-System für die dichteabhängige Regulierung von Exotoxinen wie Alpha-Hämolysin und Zelloberfläche von entscheidender Bedeutung ist Proteinexpression19,20. Frühere Untersuchungen haben auch gezeigt, dass das agr-System eine signifikante regulatorische Wirkung auf das mecA-Gen hat, das die Methicillin-Resistenz bei hochvirulenten, ambulant erworbenen Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) steuert21,22,23. Daher wurde vorgeschlagen, dass das Agrarsystem als bedeutender Kandidat für QS-Störungen und neuartige therapeutische Interventionen bei S. aureus angesehen werden sollte9. Ein zweites QS-reguliertes System ist der alternative Sigma-Faktor B (sigB), der die Stressreaktionssysteme vieler grampositiver Bakterien, einschließlich S. aureus, moduliert. SigB reguliert auch Virulenzmerkmale wie die Carotinoid-Biosynthese und Antibiotikaresistenzmechanismen24. Darüber hinaus führte die Deletion von sigB in einem MRSA-Stamm zu einer erhöhten Anfälligkeit für zellwandaktive Antibiotika wie Methicillin und Oxacillin25. Eine faszinierende Idee ist daher die Anwendung von nicht-antibiotischen QS-störenden Molekülen in Kombination mit etablierten Antibiotika als neuartige Kombinationstherapie.

Es wird vorgeschlagen, dass von probiotischen Bakterien produzierte QS-Disruptoren zur Bekämpfung antimikrobieller Resistenzen eingesetzt werden könnten, indem sie dazu beitragen, dass wirkungslose Antibiotika wieder wirksamer gegen bestimmte MRSA-Stämme werden. Darüber hinaus kann aufgrund der übergreifenden regulatorischen Präsenz mehrerer QS-Systeme in MRSA auch die Störung von QS-regulierten Faktoren, die stark zur Virulenz von MRSA beitragen (z. B. Überleben von Oxidationsmitteln), durch diese probiotischen Metaboliten erreicht werden. Um die potenziellen Fähigkeiten probiotischer Verbindungen zur Virulenzreduktion zu analysieren, wurde das zellfreie verbrauchte Medium (CFSM) des probiotischen Milchsäurebakteriums (LAB) Enterococcus faecium NCIMB 30616 („Ef 30616“) ausgewählt. Ein zweiter probiotischer Stamm von Milchsäurebakterien, Lactococcus lactis ATCC 11454 („Ll 11454“), wurde ebenfalls untersucht, um festzustellen, ob die Wirkung bei vielen probiotischen Arten erhalten blieb. Darüber hinaus wurden zwei klinische MRSA-Isolatstämme als Ziele ausgewählt, um die Reduzierung mehrerer wichtiger Virulenzfaktoren zu vergleichen, die in hochvirulenten MRSA-Populationen gut beschrieben sind20: Staphyloxanthin- und Carotinoidsynthese23, Alpha-Hämolysinproduktion, erhöhtes Überleben von Wasserstoffperoxid und Resistenz gegen die Abtötung durch Oxidationsmittel23,26, Besitz des mobilen genetischen Elements Staphylokokken-Kassettenchromosom (SCC), das die Gene für die Antibiotikaresistenzmaschinerie und die Regulierung und Expression des mecA-Gens enthält, das sich auf dem SCC9,17,21,22,27 befindet.

Um die Wirkung von probiotischem Material zu untersuchen, wurden zunächst die individuellen minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von zwei klinischen MRSA-Stämmen, Stamm 81M („MRSA 81M“) und Stamm 414M („MRSA 414M“), gegen das Beta-Lactam-Antibiotikum Cefoxitin bestimmt. und was zu Cefoxitin-MHK-Werten von 100 µg/ml bzw. 60 µg/ml für jeden Stamm führte. Cefoxitin wurde für diese Studie ausgewählt, da gezeigt wurde, dass dieses Antibiotikum den SSC mecA (PBP2a)-Signalweg für Antibiotikaresistenz bei MRSA-Stämmen stark hochreguliert28. Die Zugabe von drei Konzentrationen von filtersterilisiertem Ef 30616-CFSM in großen Mengen, das bioaktive Metaboliten enthielt (5, 30 und 60 mg/ml), wurde schachbrettartig zu einem Bereich von Cefoxitin-Konzentrationen (0–100 µg/ml) mit gleichen Anfangsimpfungen hinzugefügt jeweiligen MRSA-Stamm. Die Ergebnisse deuten auf eine konzentrationsabhängige Abnahme der Mindestkonzentration an Cefoxitin hin, die erforderlich ist, um die MRSA-Zelldichte um mehr als 90 % zu reduzieren, wenn sie 24 Stunden lang mit den bioaktiven Metaboliten inkubiert wird (Abb. 1a, b). Der Index der fraktionierten Hemmkonzentration (FIC) wurde verwendet, um die Wirksamkeit der Kombination der nicht antimikrobiellen bioaktiven Verbindung mit Cefoxitin zu bewerten29. Der FIC ist ein mathematischer Ausdruck, der verwendet wird, um die Wirkungen von Kombinationen aus zwei oder mehr Antibiotika oder einem Antibiotikum und einer nicht-antibiotischen Verbindung zu beschreiben; Wirkungen können gemäß der Definition des FIC-Index30 als antagonistisch, indifferent, additiv oder synergistisch beschrieben werden. Der Kriterienindex zur Bestimmung der Ergebnisse der FIC-Berechnungen zwischen Cefoxitin und dem bioaktiven Material Ef 30616 wurde wie folgt umgesetzt: Ein synergistisches Ergebnis wurde beobachtet, wenn die Kombination die beobachteten additiven Wirkungen der einzelnen Komponenten übertraf (FIC ≤ 0,5), ein additives Ergebnis wurde bei der Summe der Wirkungen der einzelnen Komponenten beobachtet (FIC > 0,5–1,0), ein indifferentes Ergebnis wurde beobachtet, wenn die Kombination gleich der Wirkung war, die bei der aktivsten Komponente beobachtet wurde (FIC > 1,0–2,0), und ein Antagonist Das Ergebnis wurde beobachtet, wenn die Kombination der beiden Verbindungen im Vergleich zur aktivsten Einzelkomponente eine geringere Wirkung hatte (FIC > 2,0). Die für MRSA 81M und 414M erhaltenen FICs zeigen eine umgekehrte Beziehung für FIC-Werte mit zunehmender Konzentration der bioaktiven Metaboliten Ef 30616 (Abb. 1c). Nur Stamm 81M zeigte bei allen getesteten CFSM-Konzentrationen synergistische FIC-Werte, mit einem signifikanten Rückgang der MHK sowohl bei 30 als auch bei 60 mg/ml im Vergleich zur unbehandelten CFSM-Kontrolle (p < 0,0001, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). Der Stamm 414M hatte jedoch nur additive Wirkungen und führte bei keiner verwendeten CFSM-Konzentration zu einer signifikant unterschiedlichen MHK. Daher weisen die beiden MRSA-Stämme in dieser Studie bei Behandlung mit Cefoxitin eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dem bioaktiven Material auf, was auf stammspezifische Unterschiede in der Reaktion auf CFSM und/oder Antibiotikaresistenz hinweist.

Wärmediagramme der prozentualen MHK-Wachstumshemmung der beiden repräsentativen klinischen MRSA-Stämme durch Kombinationstests des Beta-Lactam-Antibiotikums Cefoxitin (0–100 µg/ml) und der bioaktiven Metaboliten Ef 30616 (0, 5, 30 und 60 mg/ml): (a) MIC-Wärmediagramme von MRSA 81M und (b) MIC-Wärmediagramme von MRSA 414M. (c) FIC-Indexwerte für die kombinatorischen Wirkungen der bioaktiven Metaboliten EfMSI1 und Cefoxitin für die MRSA-Stämme 81M und 414M. (d) Wärmediagramm der prozentualen Wachstumshemmung von MRSA 81M für den Kombinationstest von Cefoxitin (0–100 µg/ml) und den bioaktiven Metaboliten Ef 30616 (30 mg/ml), MWCO 3000 Filtrat (d. h. < 3000 Da) und Retentat ( dh > 3000 Da) (n = 3). Für Heatmaps werden Durchschnittswerte biologischer Replikate angezeigt und als Mittelwerte in Form der prozentualen Wachstumshemmung dargestellt (ANOVA, p < 0,05 Dunnetts Mehrfachvergleichstest).

Nach der Bestimmung der FIC-Werte wurde MRSA 81M für weitere MHK-Tests ausgewählt, da es eine größere Empfindlichkeit gegenüber dem bioaktiven Material aufweist (siehe oben) und bei allen getesteten Konzentrationen synergistische FIC-Werte zeigte, während MRSA 414M kein ähnliches Muster zeigte. Die Konzentration von 30 mg/ml bioaktivem Material wurde ausgewählt, da es sich um die niedrigste Konzentration handelte, die einen FIC-Wert deutlich unter 0,5 aufwies. Das bioaktive Material Ef 30616 wurde unter Verwendung eines Zentrifugalfilters mit einer Molekulargewichtsgrenze (MWCO) von 3000 Dalton (Da) in zwei Fraktionen aufgeteilt, wobei die erste Fraktion nur das Filtrat (< 3000 Da) und die zweite Fraktion nur das gewaschene und enthielt resuspendiertes Retentat (> 3000 Da). Zur Bestimmung der MHK des Stammes MRSA 81M wurde erneut eine Schachbrettmethode verwendet, wobei dieselbe Kombination von Cefoxitin-Konzentrationen (0–100 µg/ml) mit gleichem Ausgangsinokulum verwendet wurde, und ein ähnliches Muster bei der verringerten MHK wurde im Filtrat beobachtet (Abb. 1d).

Es musste bestätigt werden, dass die Verringerung der MRSA 81M MHK-Werte, die sowohl bei Massen- als auch bei fraktioniertem CFSM beobachtet wurde, auf bioaktive Peptide und nicht auf von LAB produzierte inhibitorische Moleküle wie organische Säuren zurückzuführen ist. Präparative Größenausschlusschromatographie (SEC-FPLC) wurde verwendet, um die CFSM-Masse in Fraktionen aufzutrennen, die spezifische Metaboliten enthalten, wobei kleine Peptide in Fraktion vier („Peptidfraktion“) eluieren. Jede der SEC-Fraktionen wurde auf eine Konzentration resuspendiert, die 5, 15 oder 30 mg/ml des ursprünglichen CFSM entsprach, und in einer Schachbretttitration mit Cefoxitin getestet, um die Wirkung auf die MHK von MRSA 81M zu bestimmen. Wenn eine oder mehrere der Fraktionen mit bioaktiven Metaboliten angereichert sind, sollten selbst bei geringen Konzentrationen des Materials starke additive oder synergistische Effekte zu beobachten sein.

Die Ergebnisse zeigen, dass Ef 30616 Fraktion vier in der Lage war, die MHK-Werte von MRSA 81M konzentrationsabhängig zu reduzieren (Abb. 2a). Die FIC-Indexwerte waren bei 15 und 30 mg/ml Material synergistisch und bei 5 mg/ml additiv (Abb. 2b). Da diese Fraktion keine organischen Säuren enthält, kann man schlussfolgern, dass die Wirkung auf die darin enthaltenen kleinen bioaktiven Peptide zurückzuführen ist. Es wurde auch festgestellt, dass Fraktion drei die 81 M MIC-Werte senkte, dies war jedoch nur bei der höchsten verwendeten Konzentration synergistisch (Abb. 2b, ergänzende Abb. S1). Weder Fraktion eins noch zwei hatten einen Einfluss auf die bakterielle MHK (ergänzende Abbildung S1), was weiter bestätigt, dass kleine Peptide die bioaktiven Moleküle sind, die für die Verringerung der MRSA 81M-Resistenz gegen Cefoxitin verantwortlich sind.

Wärmediagramme der MIC-prozentualen Wachstumshemmung von MRSA 81M in Kombination mit Cefoxitin (0–140 µg/ml) und SEC-Fraktion vier von (a) Ef 30616 oder (b) Ll 11454 bei 5, 15 und 30 mg/ml äquivalenter Menge Material. (c) FIC-Indexwerte für Ef 30616 Fraktionen eins bis vier und (d) Ll 11454 Fraktionen eins bis vier. Für Heatmaps werden Durchschnittswerte biologischer Replikate angezeigt und als Mittelwerte in Form der prozentualen Wachstumshemmung dargestellt (ANOVA, p < 0,05 Dunnetts Mehrfachvergleichstest).

Fraktioniertes bioaktives Material aus einem zweiten probiotischen Bakterium, L. lactis 11454, wurde ebenfalls in einem FIC-Assay gegen MRSA 81M getestet und es wurde auch festgestellt, dass die Peptidfraktion die MHK-Werte senkt (Abb. 2c). Es gab synergistische Effekte von Ll 11454-Peptiden und Cefoxitin bei allen getesteten Konzentrationen, was zu einer signifikanten Verringerung der MHK im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle führte (Abb. 2d) (p < 0,0001, Dunnetts Mehrfachvergleichstest). Obwohl die Ef 30616-Fraktion vier weniger proteinhaltiges Material enthält als die entsprechende Ll 11454-Fraktion, reduziert das Ef 30616-Material interessanterweise das MRSA 81M-Wachstum in Cefoxitin immer noch erheblich, was darauf hindeutet, dass die für die Wirkung verantwortlichen Peptide bei niedrigen Konzentrationen wirksam sind und nur einen kleinen Anteil ausmachen des Gesamtproteins im Material. Diese Ergebnisse zeigen, dass kleine bioaktive Peptide, die aus der probiotischen Fermentation resultieren, die Antibiotikaresistenz von MRSA reduzieren können.

Populationen kleiner Kolonievarianten (SCVs) können in S. aureus-Kulturen entstehen, wenn Zellen Umweltstressoren wie Antibiotika ausgesetzt sind31. Solche SCVs wurden beobachtet, wenn bioaktiv behandelte MRSA-Kulturen auf Blutagarplatten ausplattiert wurden. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 ± 1 °C ergab die Ausplattierung von bioaktiv behandeltem MRSA 81M kleine weiße Kolonien mit minimalen bis keinen sichtbaren Hämolyseringen; Im Vergleich dazu waren die unbehandelten 81M-Wildtyp-Kolonien größtenteils einheitlich und behielten ihre ausgeprägte Orangefärbung und ihren hämolytischen Phänotyp bei (Abb. 3a, b). Insgesamt 30,9 % der MRSA 81M-Kolonien hatten ihr orangefarbenes Pigment vollständig verloren und erschienen als SCVs. Ein ähnliches Muster wurde für MRSA 414M beobachtet, allerdings hatten nur 19,5 % der insgesamt gezählten Kolonien ihre Pigmentierung verloren (Abb. 3c). Der SCV-Phänotyp blieb erhalten, als das ursprünglich bioaktiv behandelte SCV erneut ausgestrichen und auf Blutagarplatten gezüchtet wurde (ergänzende Abbildung S2). Alle Kontrollen waren negativ hinsichtlich Wachstum oder Kontamination auf dem Blutagar.

(a) Kolonien von MRSA 81M, die auf Blutagar wachsen, nach der Behandlung mit 30 mg/ml Ef 30616 bioaktivem Material (links) oder ohne Behandlung (rechts) und (b) Kolonien von MRSA 414M, die auf Blutagar wachsen, nach der Behandlung mit 30 mg/ml Ef 30616 bioaktives Material (links) oder keine Behandlung (rechts). Pfeile zeigen SCVs an, denen die Carotinoidpigmentierung fehlt und die Hämolyse reduziert sind. (c) Prozentsatz von SCV zu Wildtyp-Kolonien für MRSA 81M (n = 3) und MRSA 414M (n = 3) nach 24-stündiger Inkubation bei 37 +/− 1 °C mit und ohne bioaktives Ef 30616-Material (30 mg/ ml) (U = 0; p < 0,05; Mann-Whitney). Die mittleren schwarzen Balken geben den Mittelwert an, die oberen und unteren Balken das Maximum bzw. Minimum.

Es wurde beobachtet, dass Stamm 81M-Zellen nach 24-stündiger Inkubation bei 37 ° C ± 1 ° C mit den bioaktiven Metaboliten Ef 30616 insgesamt eine signifikante Verringerung der Orangefärbung zeigten (Abb. 4a); während MRSA 414M eine sehr geringe Pigmentierung aufwies (Abb. 4b, c). Die Quantifizierung von Carotinoiden durch Methanolextraktion und Absorptionsmessungen bei 450 nm (A450) bestätigte die visuelle Beobachtung, da zwischen den Behandlungen der 81M-Zellen ein signifikanter sechsfacher Unterschied in der Carotinoidkonzentration, gemessen durch die Absorption, aber weniger als ein dreifacher Unterschied bestand Carotinoid zwischen Behandlungen der MRSA 414M-Zellen (U = 0; p < 0,05; Mann-Whitney) (Abb. 4d). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die bioaktiven Metaboliten von Ef 30616 bei einer verringerten Carotinoidsynthese die Empfindlichkeit der MRSA-Stämme gegenüber der Abtötung durch Oxidationsmittel erhöhen würden. Wasserstoffperoxid wurde mit 1,5 % v/v zu unbehandelten und bioaktiv behandelten Kulturen des jeweiligen MRSA-Stammes gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C ± 1 °C in PBS-Lösung inkubiert; Die Zellzahlen (KBE/ml) wurden sowohl vor als auch nach der einstündigen Inkubation bestimmt (ergänzende Abbildung S3). Die bioaktiv behandelten Zellen zeigten 99,67 % bzw. > 99,99 % Zelltod für die MRSA-Stämme 414M bzw. 81M (W = 0; p < 0,05; Wilcoxon-Signed-Rank); im Gegensatz zu den unbehandelten 414M- und 81M-Zellen, die nur 16,67 % bzw. 19,70 % Zelltod aufwiesen (Abb. 4e). Allerdings wurde die Reduzierung der unbehandelten 414M nicht als signifikant angesehen (W = 5; p > 0,05; Wilcoxon-Signed-Rank).

MRSA-Zellpellets weisen nach 24-stündiger Inkubation mit bioaktivem Ef 30616-Material (30 mg/ml) bei 37 °C ± 1 °C keine Carotinoidpigmentierung auf: (a) unbehandelte MRSA 81M-Pellets (links) und bioaktiv behandelte MRSA 81M-Pellets (rechts), (b) unbehandelte MRSA 414M-Pellets (links) und bioaktiv behandelte MRSA 414M-Pellets (rechts) und (c) Vergleich aller vier Pellets (von links nach rechts): unbehandelter MRSA 81M, bioaktiv behandelter MRSA 81M, unbehandelter MRSA 414M und bioaktiv behandeltes MRSA 414M. (d) Carotinoid-Absorptionsmessung bei 450 nm (A450) aus jeder der beiden beschriebenen Behandlungen für beide Stämme (n = 3) (U = 0; p < 0,05; Mann-Whitney). (e) Prozentualer Rückgang des Staphylokokken-Überlebens auf 1,5 % v/v Wasserstoffperoxid für MRSA 81M (n = 3) und MRSA 414M (n = 3) nach 1-stündiger Inkubation bei 37 °C ± 1 °C in PBS-Lösung mit und ohne Ef 30616 bioaktive Behandlung (30 mg/ml) (W = 0; p < 0,05; Wilcoxon-Signed-Rank). Die mittleren schwarzen Balken zeigen den Median an, und die oberen und unteren Whisker-Kappen zeigen das Maximum bzw. Minimum für die Boxplots (d) und (e).

Eine Analyse der relativen mRNA-Expression wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen QS und der Virulenzgenexpression anzuzeigen, die möglicherweise durch das bioaktive Material Ef 30616 beeinflusst wird (Abb. 5). Da gezeigt wurde, dass viele QS-bezogene Systeme, einschließlich sigB, in späten exponentiellen Wachstumsstadien stärker aktiviert sind24, wurde die Expression der ausgewählten Gene in der späten exponentiellen und frühen stationären Phase der jeweiligen Stämme überwacht. Das QS-System des akzessorischen Genregulators (Agr) zeigte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle für den Transkriptionsreaktionsregulator argA keine signifikante unterschiedliche Expression. Das Gen asp23 wurde wie zuvor beschrieben als Indikator für die SigB-Aktivität überwacht32 und die Ergebnisse zeigen, dass die probiotischen Metaboliten von Ef 30616 leicht mit Schlüsselgenen im Zusammenhang mit dem Quorum Sensing über SigB in den MRSA-Stämmen 414M und 81M interferieren.

Differenzielle Expression von MRSA-Virulenz-bezogenen Genen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen der MRSA-Stämme 81M und 414M nach Inkubation mit bioaktivem Ef 30616-Material (30 mg/ml) bei 37 °C ± 1 °C; Die Kulturen wurden bis zur späten exponentiellen Phase und stationären Phase inkubiert. Die 16s-rRNA wurde als Housekeeping-Gen verwendet. Die Daten werden als Durchschnittswerte angezeigt und Balken geben die Standardabweichung an (n = 3). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Stämmen, gekennzeichnet durch Sternchen (ANOVA; p < 0,05).

Die Expression von HLA, das für Alpha-Hämolysin kodiert, war in der stationären Phase, insbesondere im Stamm 414M, stark herunterreguliert. Dies bestätigt weiter, dass bioaktive Metaboliten die Hämolyse reduzieren, wie es bei SCVs auf Blutagarplatten beobachtet wurde. Interessanterweise schien crtM, das für die Dehydrosqualen-Synthase kodiert, die für die Katalyse des ersten Schritts der Staphyloxanthin-Biosynthese verantwortlich ist, im Stamm 81M während der frühen stationären Phase eine leichte Hochregulierung aufzuweisen, während 414M eine sehr geringe Herunterregulierung aufwies. Die qPCR-Ergebnisse zeigen Unterschiede in der Virulenzgenexpression zwischen den beiden MRSA-Stämmen als Reaktion auf die Behandlung mit bioaktivem Material.

MRSA 81M- und 414M-Stämme, die mit und ohne 30 mg/ml der probiotischen Metaboliten inkubiert wurden, wurden mittels Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) nach 4, 6 und 24-stündiger Inkubation bei 37 °C ± 1 °C bewertet. Die SEM-Bildgebung zeigte, dass beide bioaktiv behandelten MRSA-81M- und 414M-Stämme nach 6-stündiger Inkubation zu aggregieren begannen und im Vergleich zu unbehandelten Zellen (Abb. 6a–c, g–) zunehmend mehrschichtige Strukturen bildeten (Abb. 6d–f, j–l). ich). Die Lichtmikroskopie zeigte außerdem, dass sich die bioaktiv behandelten MRSA-Zellen zu sammeln begannen und markantere Cluster bildeten (Abb. 7d – f, j – l). Im Gegensatz dazu bildeten die unbehandelten MRSA-Zellen typische traubenartige Cluster, ohne mehrschichtige Cluster zu bilden (Abb. 7a – c, g – i). Darüber hinaus schien die Behandlung mit der bioaktiven Verbindung die Zellform oder -größe nicht zu beeinflussen: Sowohl unbehandelte als auch bioaktiv behandelte MRSA 81M- und 414M-Einzelzellen erschienen kokkoid.

Rasterelektronenmikroskopie zeigt das Fortschreiten der Biofilmbildung sowohl unbehandelter als auch bioaktiv behandelter MRSA 81M- und 414M-Kulturen, die über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C inkubiert und in den folgenden Abständen abgebildet wurden: unbehandelte MRSA 414M-Bilder bei (a) 4 h, (b) 6 h und (c) 24 h, mit Ef 30616 bioaktiv behandelter MRSA 414M bei (d) 4 h, (e) 6 h und (f) 24 h, unbehandelter MRSA 81M bei (g) 4 h , (h) 6 h und (i) 24 h, und mit Ef 30616 bioaktiv behandelter MRSA 81 M bei (j) 4 h, (k) 6 h und (l) 24 h. Vergrößerung = 4000×. Maßstabsbalken = 20 µm.

Lichtmikroskopische Bilder verschiedener Wachstumsstadien sowohl unbehandelter als auch mit Ef 30616 bioaktiv behandelter MRSA 81M- und 414M-Kulturen, die über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C inkubiert und in den folgenden Abständen abgebildet wurden: unbehandeltes MRSA 414M bei (a) 4 h, (b) 6 h und (c) 24 h, bioaktiv behandelter MRSA 414M bei (d) 4 h, (e) 6 h und (f) 24 h, unbehandelter MRSA 81M bei (g) 4 h, (h ) 6 h und (i) 24 h, und mit Ef 30616 bioaktiv behandelter MRSA 81M bei (j) 4 h, (k) 6 h und (l) 24 h. Ziel = 10×. Maßstabsbalken = 140 µm.

Die vorliegende Studie zeigt, dass aus dem CFSM des E. faecium-Stamms 30616 und des L. lactis 11454 isolierte Metaboliten die Empfindlichkeit zweier klinischer MRSA-Stämme gegenüber Cefoxitin erhöhen, einem Beta-Lactam-Antibiotikum, das klinisch nicht mehr gegen MRSA-Infektionen geeignet ist. Da Cefoxitin die Vernetzung von Peptidoglycanschichten innerhalb der bakteriellen Zellwand behindert, wirkt sich die Wirkung der probiotischen bioaktiven Metaboliten auf die Zellwandkomponenten synergistisch positiv auf den Wirkungsmechanismus von Cefoxitin aus. Unsere Daten deuten darauf hin, dass bioaktive Peptide aus E. faecium Ef 30616 und L. lactis 11454 als nicht antimikrobielle Adjuvantien in Verbindung mit einem Antibiotikum wirken können und, was entscheidend ist, das Potenzial haben könnten, MRSA gegenüber nicht mehr klinisch relevanten Antibiotika zu „re-sensibilisieren“. wie Cefoxitin. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass diese Ef 30616-Bioaktivstoffe Virulenzmerkmale behindern können, die MRSA-Infektionen unterstützen: Resistenz gegen Sauerstoffspezies, Staphyloxanthin-Biosynthese sowie Hämolysinproduktion, die durch QS-Systeme in S. aureus vermittelt wird. Da Carotinoidpigmente einen großen Beitrag zur Fitness von Staphylokokken leisten, insbesondere bei der Umgehung von Immunzellen, könnte die Hemmung der Carotinoidsynthese ein potenzielles Ziel für therapeutische Interventionen bei S. aureus-Infektionen sein27. Schließlich kann das Auftreten größerer Konzentrationen von SVCs innerhalb der gesamten MRSA-Population auf eine Verschiebung der MRSA-Zellen mit verringerter Expression wichtiger QS-bezogener Gene innerhalb der Population in späteren Wachstumsstadien hinweisen. Im Hinblick auf biofilmbedingte S. aureus-Infektionen ist der Einsatz probiotischer QS-störender Verbindungen jedoch möglicherweise nicht vorteilhaft, da die QS-Unterbrechung nachweislich Vorteile bei der Auswahl von SVCs und der gesamten Biofilmbildung bietet6,33.

Die FIC-Werte für MRSA 81M zeigten, dass es einen synergistischen Kombinationseffekt für alle drei Konzentrationen des bioaktiven Materials Ef 30616 gab, wohingegen die FIC-Werte für MRSA 414M nur einen synergistischen Effekt bei der höchsten verwendeten Konzentration zeigten. Diese Ergebnisse weisen auf stammspezifische Unterschiede in der Empfindlichkeit der beiden MRSA-Stämme gegenüber dem Antibiotikum hin. Nur bioaktive Kontrollvertiefungen zeigten bei beiden Stämmen keine negativen Auswirkungen auf das MRSA-Wachstum, was darauf hindeutet, dass der Wirkungsmechanismus der bioaktiven Metaboliten nicht von Natur aus antimikrobiell gegen MRSA ist und dass eine Hemmung des MRSA-Wachstums nur beobachtet wurde, wenn die bioaktiven Metaboliten Ef 30616 mit diesen kombiniert wurden Cefoxitin. Die MHK-Ergebnisse der bioaktiven Fraktionen zeigen deutlich, dass das Filtrat die größte Aktivität enthielt und die MHK von Cefoxitin reduzierte; Im Retentat wurde jedoch eine gewisse Restaktivität festgestellt, was dazu führte, dass die MHK etwas geringer war als bei der unbehandelten Kontrolle. Darüber hinaus zeigten zwei durchgeführte Wäschen des Retentats auch eine gewisse verbleibende bioaktive Aktivität (ergänzende Abbildung S4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die meisten Ef 30616-Verbindungen, die eine Bioaktivität gegen die beiden getesteten klinischen MRSA-Stämme aufweisen, eine Größe von etwa ≤ 3000 Da hatten.

Durch die Aufteilung des Hauptmaterials in chemisch definierte Fraktionen wurde nachgewiesen, dass bioaktive Peptide für die beobachtete Verringerung der Antibiotikaresistenz des MRSA-Stamms 81M gegen Cefoxitin verantwortlich sind. Die CFSM- und MWCO-Großfiltrate enthalten noch viele Medienbestandteile wie Restzucker, nicht hydrolysierte Proteine sowie organische Säuren, die aus der Fermentation resultieren. Es ist bekannt, dass Milchsäurebakterien das Wachstum von S. aureus durch Ansäuerung der Umwelt hemmen34. Daher war es wichtig, organische Säuren zu entfernen, die andernfalls die Anfälligkeit von S. aureus gegenüber Cefoxitin beeinträchtigen könnten. Obwohl die Peptidfraktion Ef 30616 im Vergleich zu Ll 11454 viel weniger Material enthielt, war der Effekt immer noch stark genug, um eine synergistische Verringerung der FIC-Werte zu bewirken. Dies deutet darauf hin, dass diese proteobiotischen Moleküle mit extrem hoher Wirksamkeit und in sehr geringen Konzentrationen wirken können. Ähnliche Ergebnisse wurden in einer Studie von Kou et al.35 beobachtet, in der die Autoren herausfanden, dass bereits 1 µg/ml eines synthetischen Quorum-Quenching-Moleküls die MRSA-MICs auf die Beta-Lactam-Antibiotika Nafcillin und Cephalothin der frühen Generation reduzieren konnten um das 50-fache. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Moleküle bei der Anwendung in Kombination mit Cephalothin in einem Maus-MRSA-Bakteriämie-/Sepsis-Modell wirksam sind, um den Tod zu reduzieren36. Künstliche Peptide wurden auch eingesetzt, um die Wirksamkeit von Antibiotika der frühen Generation durch Zerstörung der Zellhülle zu steigern37. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass die natürlichen Fermentationsprozesse von Milchsäurebakterien genutzt werden können, um bioaktive Peptide zu erzeugen, die eine starke Antivirulenzaktivität besitzen.

Das durch antioxidative Carotinoide dargestellte goldene Pigment war bei MRSA 81M und MRSA 414M nach der Behandlung mit 30 mg/ml der bioaktiven Metaboliten Ef 30616 deutlich reduziert. Obwohl der Wildtyp MRSA 414M ursprünglich nur eine sehr geringe orange Pigmentierung aufwies, führte die Behandlung mit dem bioaktiven Material Ef 30616 bemerkenswerterweise dazu, dass der MRSA 414M den größten Teil seines Pigments verlor, was zu einem fast rein weißen Pellet führte. Die Veränderung der Zellpelletfarbe nach 24-stündiger Inkubation mit den bioaktiven Metaboliten von Ef 30616 weist auf eine probiotische Störung der ordnungsgemäßen Zellwandstruktur hin: Carotinoide sind vermutlich auch an der Stabilisierung der S. aureus-Membran während Infektion und Pathogenese und der Aufrechterhaltung der Zellsteifigkeit beteiligt Abwehrkräfte des Gastgebers26,38. Darüber hinaus tragen diese an der Oberfläche angesammelten Verbindungen zur Gesamtvirulenz von S. aureus bei, indem sie Schutz vor Photosensibilisierung und Austrocknung bieten und als starke Antioxidantien wirken, die toxische reaktive Sauerstoffspezies löschen, die von Immunzellen verwendet werden39. Die Verringerung der charakteristischen gelb-orangen Färbung des umgangssprachlich als „goldener Staphylokokken“ bezeichneten MRSA ist wahrscheinlich auf die Störung von QS-bezogenen Zweikomponentensystemen zurückzuführen, die Berichten zufolge für die Wasserstoffperoxidtoleranz bei S. aureus wesentlich sind, einschließlich des alternativen Sigmafaktors sigB . Darüber hinaus waren die Zellpellets, obwohl die Gesamt-KBE/ml-Zahlen zwischen der unbehandelten Kontrolle und den bioaktiv behandelten MRSA-Zellen nach 24-stündiger Inkubation nahezu identisch waren, weniger dicht und bildeten größere Zellpellets (Abb. 4a – c). scheint ein Ergebnis der fortgeschrittenen Biofilmbildung nach der Inkubation des MRSA mit den bioaktiven CFSM-Metaboliten zu sein, wie durch mikroskopische Bildgebung nachgewiesen wurde (Abb. 6, 7). Der Verlust von Membranbestandteilen wie Staphyloxanthin beeinträchtigt die Membranintegrität und führt zu Veränderungen im Aggregationsverhalten und zur Bildung von Biofilmen. Es ist interessant festzustellen, dass die beiden bioaktiv behandelten MRSA-Stämme zwar ein fortgeschrittenes Fortschreiten der Aggregation und der Biofilmbildung zeigten, beide jedoch über 24 Stunden hinweg eine erhöhte Anfälligkeit für Cefoxitin zeigten, was darauf hindeutet, dass die Aggregation und die Biofilmproduktion die Replikation der MRSA-Zellen nicht unterstützten das Vorhandensein von Cefoxitin. Diese Ergebnisse sind von entscheidendem Interesse, da subinhibitorische Konzentrationen von Beta-Lactam-Antibiotika die Bildung von Biofilmen bei MRSA auslösen können und diese Ergebnisse zeigen, dass bioaktive Peptide eine erhöhte Anfälligkeit von MRSA gegenüber Antibiotika sogar während der Biofilmbildung ermöglichen.

Interessanterweise zeigten nach der Inkubation mit 1,5 % v/v Wasserstoffperoxid sowohl die bioaktiv behandelten MRSA 81M als auch MRSA 414M eine signifikante Verringerung des Zelltods um > 99,99 % bzw. 99,67 %, obwohl verbleibendes orangefarbenes Pigment offenbar in der bioaktiven Substanz verblieben war. MRSA behandelt. Dieser niedrige Pigmentgehalt war jedoch möglicherweise auf das Zwischenpigment 4,4′-Diaponeurosporen zurückzuführen, was zuvor durch eine SigB-Unterbrechung angezeigt wurde40. Da Wildtyp-MRSA 414M offenbar nur eine geringe Carotinoidproduktion aufweist (im Vergleich zu MRSA 81M), geht eine alternative Theorie davon aus, dass die bioaktiven Metaboliten auch in der Lage sind, die intrinsische Komponente des Agrarsystems zu stören, die für die Wahrnehmung oxidativer Umgebungen verantwortlich ist8. Was die Toxinproduktion betrifft, variiert die Transkription von HLA zwischen den MRSA41-Stämmen, und die Herunterregulierung durch das bioaktive Material kann über einen konservierten Mechanismus wie Quorum Sensing erfolgen. Die Verringerung von HLA wurde phänotypisch beim Wachstum von MRSA-Kolonien nach der Behandlung mit dem bioaktiven Material beobachtet, was bei beiden Stämmen eine starke Verringerung der Hämolyseringe auf Blutagarmedien zeigte. Darüber hinaus zeigten die meisten Kolonien mit reduzierter Hämolyse andere Morphologien als der Wildtyp-MRSA: Die Kolonien waren klein, langsam wachsend und hatten den größten Teil ihrer ursprünglichen Pigmentierung verloren (Abb. 3a, b). Diese Kolonien wurden zuvor in MRSA-Kulturen als kleine Kolonievarianten beschrieben. Eine Störung des Agrarsystems wurde mit SVCs in Wildtyp-MRSA-Populationen in Verbindung gebracht, die nachweislich eine verringerte Virulenz und eine erhöhte Zellaggregation aufweisen. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Annahme, dass bestimmte proteobiotische Ef 30616-Moleküle die typische Zellwandsynthese bei MRSA stören können, indem sie die Carotinoidproduktion blockieren, die als wichtiges Antioxidans wirkt, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber der Abtötung von Oxidationsmitteln führt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass natürlich erzeugte Quorum-Quenching-Moleküle das Potenzial haben, die Ausbreitung multiresistenter Bakterien gegen Antibiotika zu bekämpfen. Es ist möglich, dass durch die proteobiotisch vermittelte Zerstörung von MRSA-Zellwandstrukturen wie Staphyloxanthin die Wirksamkeit der Immunantwort des Wirts erhöht werden könnte, da die Bakterienzellen durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies anfälliger für die durch Makrophagen vermittelte Abtötung werden. Obwohl diese Ergebnisse mit unseren früheren Erkenntnissen bezüglich der QS-störenden Aktivität der probiotischen Metaboliten im CFSM anderer probiotischer LAB übereinstimmen, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den vollständigen Wirkungsmechanismus dieser bioaktiven Metaboliten aufzuklären. Die Identifizierung, wie diese Moleküle die Quorum-Sensing-Kontrolle der Virulenz behindern, wird auch wichtige Auswirkungen auf ihre Anwendung in einem klinischen Umfeld zur Bekämpfung einer bakteriellen Infektion haben. Adjuvans-Technologien, die aus probiotischen Bakterien entwickelt wurden und die QS-Systeme von S. aureus unterbrechen, sind jedoch potenziell ernsthafte Konkurrenten bei der Bekämpfung von MRSA-Infektionen.

Vom Canadian Research Institute for Food Safety (University of Guelph, Ontario, Kanada). Dieser probiotische Stammstamm wurde zur Herstellung bioaktiver Materialien mit probiotischen Metaboliten für alle in dieser Studie verwendeten Experimente verwendet. Ein zweiter probiotischer Stamm, Lactococcus lactis 11454 („Ll 11454“), wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen und zur Herstellung von bioaktivem Material für MIC-Tests verwendet.

Zwei klinische Isolate von S. aureus-Bakterien, MRSA 81M SPA t008 („MRSA 81M“) und MRSA 414M SPA t034 („MRSA 414M“), wurden vom Atlantic Veterinary College (AVC) an der University of Prince Edward Island (Charlottetown) erhalten , PE, Kanada). Das Vorhandensein einer Methicillinresistenz über den SCC-mecA-Genweg in beiden Stämmen wurde durch Oxacillin-Scheibendiffusion und mecA-Genprimer bestätigt (Ergänzungstabelle S1)42. Die klinischen Isolate wurden auf Tryptic-Soja-Agar (TSA)-Platten, ergänzt mit 5 % v/v sterilem defibriniertem Schafsblut (Cedarlane, Burlington, Ontario, Kanada), gehalten. Für alle experimentellen Tests wurden MRSA-Kulturen in BBL™-kationenangepassten Mueller-Hinton-Medien (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) gezüchtet.

E. faecium Ef 30616 wurde in 200 ml 0,22 µm filtersterilisiertes, modifiziertes De Man, Rogosa und Sharpe (MRS)-Medium (VWR International, Mississauga, Ontario, Kanada) inokuliert. Diese Flaschenkultur wurde ohne Schütteln 18 Stunden lang bei 37 ± 1 °C inkubiert. Die Kultur wurde dann verwendet, um 4 l chemisch definiertes Medium (CDM) mit 200 g Molkenproteinisolat (Canadian Protein) und 25 g Laktose zu beimpfen. Die Gefäßkultur wurde 48 Stunden lang statisch bei 37 ± 1 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Ef 30616-Zellen durch 30-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 ° C aus der flüssigen Phase isoliert (Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter, Kanada). Der zellfreie Überstand, der die probiotischen Metaboliten enthielt, wurde dann bei –80 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Der getrocknete zellfreie Ef 30616-Überstand wurde bis zur Verwendung in Pulverform bei –20 °C langfristig gelagert.

Der getrocknete Überstand wurde abgewogen und in kationenangepassten Mueller-Hinton-Medien in der gewünschten Konzentration (5, 30 und 60 mg/ml) resuspendiert. Der pH-Wert des resuspendierten Materials wurde mit einem Accumet® AE150 pH-Meter (Fisher Scientific, Waltham, USA) überprüft und nach Bedarf auf einen pH-Wert von 7,3 ± 0,1 eingestellt. Die resuspendierte Lösung wurde dann mit einer Centrifuge 5804 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 5000 × g 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die verbleibende Flüssigkeit wurde vom Trümmerpellet abgetrennt und durch einen Supor®-800 0,45 µm-Membranfilter (Pall Corporation, New York, USA) mit einem 40/35 Synthware-Vakuumfiltrationsgerät (Kemtech America, Los Angeles, USA) filtriert verbleibendes kolloidales Material. Das Filtrat wurde dann unter Verwendung eines Basix™ 25 mm 0,2 µm Spritzenfilters (Fisher Scientific, Waltham, USA) filtersterilisiert. Die Proben wurden bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Für die Ultrafiltration des resuspendierten probiotischen zellfreien Überstands wurden Amicon® Ultra 15-ml-Zentrifugenfilter mit einem Molekulargewichts-Cut-Off (MWCO) von 3000 Da (Millipore Sigma, Burlington, USA) verwendet. Nach der Resuspension wie oben beschrieben wurden 10 ml des zellfreien Überstands in das MWCO 3000-Zentrifugenfilterröhrchen gegeben und 1 Stunde lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Das MWCO 3000-Filtrat wurde gesammelt; Die verbleibende Retentatfraktion wurde gesammelt, indem der Filterkopf bei jedem Spülvorgang zweimal mit 10 ml kationenangepasstem Mueller-Hinton-Medium gespült wurde. Nach den beiden Spülungen wurden weitere 10 ml Medium verwendet, um das Retentat zu resuspendieren und zu sammeln. Alle gesammelten Fraktionen wurden dann mit einem 0,2-µm-Spritzenfilter filtersterilisiert, um jegliche Kontamination zu entfernen. Die flüssigen Retentat- und Filtratlösungen von MWCO 3000 wurden bei –20 °C gelagert, bis sie für die Experimente benötigt wurden.

Der getrocknete Überstand wurde in Milli-Q-Wasser auf eine Konzentration von 50 mg/ml resuspendiert und 15 Minuten lang beschallt, um die Solubilisierung zu verbessern. Nach der Resuspension wurden die Proben 20 Minuten lang bei 8000 × g zentrifugiert und der Überstandsfilter mit einem 0,22-µm-Spritzenfilter sterilisiert. Die Proben wurden auf einer mit Superdex 30 gefüllten präparativen Säule XK 26/100 aufgetrennt und mit einem AKTA Explorer (Cytiva Life Sciences, Marlborough, USA) analysiert. Das Material wurde mit 10 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure bei einer Flussrate von 3 ml/min eluiert. Die Elutionskurve wurde durch Messung des pH-Werts und der Absorption bei 280 und 214 nm überwacht. Die gewünschten Elutionen wurden gesammelt und in definierten Fraktionen gepoolt, dann bei –80 °C eingefroren und anschließend gefriergetrocknet. Lyophilisiertes Material wurde bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Das für die Prüfung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) bei den beiden MRSA-Stämmen ausgewählte Antibiotikum war Cefoxitin, wie in den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) für die Prüfung der MHK von Staphylokokkenarten beschrieben43. Cefoxitin in Pulverform (Alfa Aesar, Haverhill, USA) wurde mit einer Analysenwaage abgewogen und in Methanol bei 10 mg/ml resuspendiert und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Die MHK-Untersuchung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) für die MHK-Untersuchung von Staphylokokkenspezies43 durchgeführt. Übernachtkulturen des jeweiligen klinischen MRSA-Stamms wurden 1000-fach verdünnt, um etwa 106 KBE/ml als Ausgangsimpfung zu erhalten. Die Verdünnungsbereiche für Cefoxitin lagen zwischen 0 und 100 μg/ml. Klinische MRSA-Stamm-MHK-Werte mit Cefoxitin wurden durch Mikroverdünnung der Brühe mit Cefoxitin in kationenangepassten Mueller-Hinton-Medien in transparenten Costar®-96-Well-Standard-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Corning® Inc., Corning, USA) bestimmt. Nur-Medien-Aliquots wurden zur Sterilitätsprüfung hinzugefügt und als Hintergrundkontrolle verwendet, während die 100 µg/ml Cefoxitin-Vertiefung als Positivkontrolle der antibiotikavermittelten Abtötung diente. Alle Testprobenvolumina betrugen 200 µL pro Vertiefung mit Duplikaten. Nach der Probenvorbereitung und Aliquotierung wurden die MIC-Testplatten mit Parafilm versiegelt und 24 Stunden lang bei 35 ± 1 °C und 200 U/min unter Schütteln in einem VWR® Incubating Mini Shaker inkubiert. Die Temperatur wurde mit einem digitalen Fisherbrand™-Thermometer (Fisher Scientific, Waltham, USA). Nach der Inkubation wurden die Platten auf Raumtemperatur abgekühlt und die Trübung mit einem SpectraMax M2-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, San Jose, USA) bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen. Als MHK wurden die niedrigsten Cefoxitin-Konzentrationen definiert, die im Vergleich zu den jeweiligen Positivwachstumskontrollen zu einer Verringerung der Trübung um 90 % oder mehr führten. Alle MHK-Tests wurden in drei biologischen Replikaten durchgeführt. Nach dem MHK-Schachbretttest wurde MRSA 81M als klinischer Stamm mit hoher MHK für die Prüfung der Ultrafiltrations- und SEC-Fraktionen des bioaktiven Materials ausgewählt, um die Größe und chemische Identität der bioaktiven Stoffe besser zu klären. Die MWCO 3000- und SEC-Fraktions-MIC-Tests wurden identisch mit der oben beschriebenen MIC-Testmethode durchgeführt.

Schachbrett-MIC-Analysen wurden für drei vorab festgelegte Konzentrationen probiotischer bioaktiver Materialien durchgeführt, um die synergistischen, additiven oder antagonistischen kombinatorischen Wirkungen von Cefoxitin gegen die klinischen MRSA-Stämme zu bestimmen. Die Verdünnungsbereiche des bioaktiven Materials betrugen 5, 30 und 60 mg/ml des gefriergetrockneten zellfreien Ef 30616-Überstands oder 5, 15 und 30 mg/ml der gefriergetrockneten Ef 30616- und Ll 11454 SEC-Fraktionen. Die in FIC-Tests verwendeten Verdünnungsbereiche für Cefoxitin lagen bei 0–100 µg/ml für Hauptmaterial und bei 0–140 µg/ml für SEC-Fraktionen. Die FIC-Tests wurden identisch mit der oben beschriebenen MIC-Testmethode durchgeführt. Der FIC-Index wurde wie zuvor beschrieben bestimmt30. Die Gleichungen (1) und (2) wurden verwendet, um die FIC-Werte für Cefoxitin oder jedes bioaktive Material zu bestimmen, und Gl. (3) wurde zur Berechnung des FIC-Index verwendet, um den kombinatorischen Effekt der beiden Komponenten zu bestimmen.

Dabei sind FICA und FICB die FIC-Werte für Arzneimittel A bzw. Arzneimittel B. MICA und MICB sind die jeweiligen MHKs von Arzneimittel A und Arzneimittel B allein. MICC ist die MHK von Arzneimittel A und Arzneimittel B in Kombination. Der FIC-Index (FICi) ist die Summe aus FICA und FICB.

Für die folgenden physiologischen und qPCR-Tests wurde der jeweilige MRSA-Stamm wie folgt gezüchtet. Jeder MRSA-Stamm wurde in 10 ml kationenangepasstes Mueller-Hinton-Medium („unbehandelt“) und 10 ml kationenangepasstes Mueller-Hinton-Medium, ergänzt mit 30 mg/ml probiotischem bioaktivem Material („behandelt“), inokuliert und dann bei 37 ± inkubiert 1 °C und 200 U/min unter Schütteln für 24 Stunden, sofern nicht anders angegeben.

Die Proben wurden wie oben beschrieben vorbereitet. Nach der Inkubation wurden Staphylokokken-Carotinoide mithilfe eines zuvor etablierten Methanol-Extraktionsprotokolls23 extrahiert. Der Überstand, der die extrahierten Carotinoide enthielt, wurde in 200 µl (mit Duplikaten) in eine Standardplatte mit 96 Vertiefungen pipettiert und die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm (A450) wurde mit einem SpectraMax M2-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, San Jose, USA) gemessen ).

Die Proben wurden wie oben beschrieben vorbereitet. Nach der Inkubation wurden die Proben 15 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert, in 1× Dulbecco's PBS-Lösung (VWR Life Science, Radnor, USA) gewaschen und bei etwa 109–1010 KBE/ml in 1,5 % v/v Wasserstoffperoxidlösung resuspendiert. Anschließend wurden Oxidationsempfindlichkeitstests nach einem zuvor festgelegten Protokoll durchgeführt23.

Die Proben wurden wie beschrieben vorbereitet. Es wurden Reihenverdünnungen der Proben durchgeführt und 100 µl der verdünnten Probe wurden doppelt auf TSA-Platten, ergänzt mit 5 % v/v sterilem defibriniertem Schafsblut (Cedarlane, Burlington, Ontario, Kanada), ausplattiert. Die Platten wurden 15–20 Stunden lang bei 37 ± 1 °C inkubiert und auf Hämolyse und KBE/ml-Zahlen analysiert.

Die Proben wurden wie oben beschrieben vorbereitet und dann bei 37 ± 1 °C und 200 U/min unter Schütteln für 4 und 6 Stunden für MRSA 414M-Proben und 5 und 6 Stunden für MRSA 81M-Proben inkubiert. RNA-Extraktionen der Proben wurden gemäß dem illustra™ RNAspin-Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) durchgeführt. Reverse Transkriptionen und cDNA-Synthesen wurden gemäß dem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt. qPCR-Experimente wurden mit einem CFX96™ Real-Time System C1000™ Thermal Cycler durchgeführt und Datenanalysen wurden mit dem zugehörigen Softwaresystem CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, Hercules, USA) durchgeführt. Die ausgewählten Gene und ihre Primerpaare sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.

Die Proben wurden wie oben beschrieben vorbereitet und dann bei 37 ± 1 °C und 200 U/min unter Schütteln für 4, 6 und 24 Stunden für 414M- und 81M-Proben inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben mit Kristallviolett gefärbt, für die Lichtmikroskopie vorbereitet und mit dem Upright Revolve 4-Mikroskop, ausgestattet mit einem iPad Pro (ECHO Inc., San Diego, USA), beobachtet. REM-Proben wurden wie zuvor beschrieben vorbereitet44. Die Proben wurden mit doppelseitigem Klebeband auf Stummeln befestigt und mit einem Denton Vacuum-System mit Gold sputterbeschichtet und mit einem Hitachi TM3000 Rasterelektronenmikroskop (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japan) beobachtet, das bei 15 kV betrieben wurde.

Die MHK-Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest unter Verwendung von GraphPad Prism Version 9 (GraphPad-Software, San Diego, Kalifornien). Alle qPCR-Daten wurden von ANOVA mit dem Softwaresystem CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, Hercules, USA) analysiert. Die Daten für den Carotinoid-Absorptionstest und die prozentuale SCV-Zellzahl wurden durch statistische Mann-Whitney-U-Tests mit Microsoft Excel analysiert. Die Daten zur Zelltötung durch Wasserstoffperoxid wurden von Wilcoxon Signed-Rank für paarweise statistische Tests mit Microsoft Excel analysiert. Bei allen angegebenen Replikaten (n) handelt es sich um den durchschnittlichen biologischen Wert technischer Duplikate.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. J Trenton McClure vom Atlantic Veterinary College in Charlottetown, PE, Kanada für die Bereitstellung der klinischen MRSA-Stämme und Matthew Saab für die Erleichterung der Stammbeschaffung. Die Autoren danken Jonathon Roepke für seine Unterstützung bei der experimentellen Gestaltung und Durchführung. Die Autoren möchten außerdem dem Canadian Research Institute for Food Safety in Guelph, ON, Kanada, für die Bereitstellung des Stammes Enterococcus faecium danken. Schließlich wurde diese Forschung teilweise vom National Research Council of Canada durch das Industrial Research Assistance Program für Technologieentwicklung unterstützt.

Fakultät für Maschinenbau, École de Technologie Supérieure (ÉTS), Montreal, QC, H3C 1K3, Kanada

Monica Angela Cella, Sara Badr und Ali Ahmadi

MicroSintesis Inc., Victoria, PE, COA 2G0, Kanada

Thomas Coulson, Samantha MacEachern, Mahdis Sadat Tabatabaei und Alain Labbe

Kanadisches Forschungsinstitut für Lebensmittelsicherheit, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Kanada

Mansel William Griffiths

Abteilung für Lebensmittelwissenschaften, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Kanada

Mansel William Griffiths

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MAC führte die Zytotoxizitätstests und Carotinoidmessungen durch. MAC und SM führten die MIC-Tests durch. MST führte die SEC-Fraktionierung durch. MAC, TC, AL und MWG lieferten Datenanalysen und Einblicke in die Testergebnisse. SB und AA führten Bildgebung durch und analysierten Mikroskopiebilder. MAC und TC haben das Manuskript geschrieben und die Zahlen vorbereitet.

Korrespondenz mit Thomas Coulson oder Alain Labbe.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cella, MA, Coulson, T., MacEachern, S. et al. Eine probiotische Störung des Quorum Sensing verringert die Virulenz und erhöht die Cefoxitin-Empfindlichkeit bei Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus. Sci Rep 13, 4373 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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Eingegangen: 09. November 2022

Angenommen: 13. März 2023

Veröffentlicht: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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Eine probiotische Störung des Quorum Sensing verringert die Virulenz und erhöht die Cefoxitin-Empfindlichkeit in Methicillin